CRISPRCas技术

1、crispr-cascrispr-cas 技术技术一、一、crispr-cas系统的简介系统的简介 1，crispr/cas系统的由来系统的由来 2，crispr/cas系统的分类系统的分类 3，crispr/cas系统的结构系统的结构二、二、crispr-cas系统的作用机理系统的作用机理 1，crispr间隔区的获得间隔区的获得 2，crrna的表达和成熟的表达和成熟 3，外源基因的切割，外源基因的切割三、三、dsb的修复的修复四、四、crispr-cas系统的应用系统的应用五、五、crispr技术的脱靶问题技术的脱靶问题六、实验设计六、实验设计u crispr/cas9系统是一特殊的dn

2、a重复序列家族，又命名为成簇的、规律间隔的、短回文、重复序列，是目前用于基因敲除、点突变、基因插入、基因修复等基因编辑方面的新方法。u crispr/cass系统是从细菌和古生菌内发现的，它参与细菌的免疫过程，抵挡外源遗传物质的侵袭，是一种后天获得的防御系统。u 以往的基因编辑技术（zfn/talen）一次只能编辑一个基因，并且耗时耗力。 crispr/cas9 技术最大的优势就在于一次可以编辑很多个基因位点，只需设计多个不同的 g rna，它可以介导 cas9 核酸酶进行多靶点基因编辑 。u crispr/cas9 技术可以通过核酸之间的相互识别，防止 dna 甲基化对基因编辑的干扰。编辑效

3、率显著高于zfn/和alen。且不需要反复设计核算内切酶载体，操作简单。crispr/cas9 来源于细菌免疫系统，经过人为改造后，可在真核细胞中实现高度灵活且特异的基因组编辑。crispr /cas9 系统是一种后天免疫防御系统，用以保护细菌或古细菌免受外来质粒或噬菌体的侵入。当病毒首次入侵时，细菌会整合病毒基因到crispr的间隔区，当再次入侵时，crispr转录相应的crrna，crrna与病毒基因的同源序列结合，介导cas酶切割病毒基因，从而保护自己。 u 基于crispr-cas基因保守型和位点构成的不同，可分为type、type 、type三种类型。u type和 行较为复杂，类的

4、特征蛋白是cas3，在细菌和古生菌中都有。 类的有cas6和cas10两种酶。u type系统较简单只存在与细菌，主要是cas9酶介导降解外源基因和crrna的成熟。u crispr-cas系统目前广泛应用，由系统改造而的，为第三代人工核酸内切酶，比第一代（zfn）和第二代（talen）的人工核酸内切酶操作更加简单、修饰更为精确、且成本低。crispr-cas系统包括不连续的重复序列（repeats）、间隔序列（spacers）间隔排列成crispr簇、前导序列（l）和编码cas酶的基因、tracrrna基因。repeaeas两端序列是严格保守的分别为和，能使转录岀的rna二级结构保持稳定。

5、spacers均为外源的dna插入。前导序列可能在插入新的spacers时起到识别作用或者作为转录crispr的启动子。cas蛋白是一种双链dna核酸酶，能在guide rna的引导下切割靶位点， cas9 具有 hnh 和 ruv c 两结构域，都可以切割 dna，其中 hnh 结构域切割互补的 dna 链，ruv c 切割非互补的 dna 链。cas9切割双链时无特异性，可作用于任何基因。crispr之间的间隔区转录成前体cr-rna（pre-crrna），经核酸酶切割成熟，与tracr rna结合成sgrna，sgrna具有特异性，作用于特定的基因序列。实验时只需要改造crispr的部分

6、序列，就可以得到针对特定基因的crispr/cas系统。crrna与tracrrna碱基互补配对结合成grna，此复合物能引导核酸酶cas9 蛋白切割与crrna配对的双链dna。crispr间隔区的获得crrna的表达和成熟外源基因的切割作用过程作用过程u噬菌体或质粒上与crisprcas9系统中间隔序列对应的序列被称为protospacer（pam），一般为。u当外源基因入侵时，宿主识别pam，以pam附近的序列作为protospacer；把protospacer整合到crispr基因座的5端的两个重复序列之间，从而获得相应的间隔区。前导区调控细菌crispr之间的间隔区转录为前体crrn

7、a，反式激活 cr rna（tracr rna）与 pre-cr rna 重复序列互补介导核酸酶 rnase iii 对 pre-cr rna 进行加工处理，切割成成熟crrna。crrna 和tracrrna结合成sgrna，指导cas9对外源基因进行切割。cas9识别目的基因中的pam片段，而crrna识别 的端互补的20bp的dna序列片段（外源dna），使基因组与cas9稳定结合，从而对靶位点进行切割，基因组双链发生断裂，形成双链缺口（dsb）。u在真核生物中dsb （dna双链切口）可被两种不同的机体自身修复机制修复dsb非同源性末端连接（nhej）和同源重组（ hdr）进行修复。n

8、hej能够高效地引入不同长度的插入或缺失突变（indel），产生由于移码突变而导致的基因功能受损，多用于细胞或动物模型中的基因敲除、功能基因组的筛查、转录调控和基因沉默的研究；hdr以dna结构的同源性为基础，修复会带入特定位点的突变或在外源dna供体模板存在下对靶点形成可预测的插入.此外还有一种微生物学介导的末端连接，这种在实验中比较少应用。u除了dsb，实验时也能利用cas9突变的“切口酶”形成单链切口（nick），可通过同源重组（ hdr）进行修复，以完整的链为模板修复缺口。u基因敲出：如向受精卵中注射cas9mrna和sgrna、构建grna-cas质粒结合非同源重组进行基因的敲除。

9、u构建sgrna文库进行基因组筛查和药物靶点的鉴定。u基因表达调控：改造成转录激活因子、转录抑制因子等调节蛋白对基因表达进行调控。如使cas9两个活性位点突变形成dcas9，dcas9不切割dna，而是引导抑制因子或转录因子的结合到靶位点上，从而达到抑制基因的表达或激活基因的表达。目标位置可以是启动子区域、调控区域或早期编码区域。u脱靶现象是基因编辑实验的资格重要问题，crispr/cas的脱靶受到sgrna、pam、cas9等的影响。实验时可以通过设计优化的sgrna、控制cas9-sgrna的用量、改造cas9、选着合适的pam系列和适中的酶浓度等方法降低脱靶率。六、实验设计六、实验设计实

10、验思路实验思路实验过程实验过程 以高度转移的肿瘤细胞株作为模式细胞，筛选跟肿瘤转移密切相关的基因。 构建grna腺病毒质粒文库，用于靶基因位点的敲除： 以质粒为载体，通过在线软件设计设计grnas文库，质粒载体中需包含有grna、嘌呤毒素抗性基因。 对grna文库进行扩增。 把grna文库合并到腺病毒中。 转染细胞时，腺病毒会把质粒传递到细胞中。实验过程实验过程 构建reporter腺病毒载体:把荧光蛋白报告基因（fp）整合到腺病毒上合成报告因子，载体中需要包含有包含有cas9和报告基因。表达形成cas9-fp复合物，grna序列会将dcas9-fp融合物导向特定的基因组序列。（荧光蛋白载体和grna载体可通过addgene网站获取） 制备高度转移的肿瘤单细胞悬液。 用构建好的grna腺病毒转染肿瘤细胞。 在培养基中加入嘌呤毒素筛选出转染成功的细胞。 裂解细胞提取质粒dna。 通过酶切电泳鉴定和dna测序鉴定。实验过程实验过程 把构建好的reporter载体转染到筛选出来的肿瘤细胞中，以reporter转染空肿瘤细胞做空白对照。 培养一段时间后，通过荧光显微镜观察细胞荧光表达情况。 制备单细胞悬液。 用流式细胞仪分选出突变的细胞并进行扩大培养。 对发生突变的细胞进行单克隆培