microRNA研究进展及其在动物分子育种中的应用

1、microRNA研究进展及其在动物分子育种中的应用在整个基因组中，编码蛋白的基因通常只占到2%左右，绝大多数的基因是不直接编码蛋白质的，但是参与生命活动的DNA 都被转录成RNA，还有大量的非编码RNA 的信息没有被揭开“面纱”。RNA 转录组学中microRNA 的研究，从首个microRNA: lin-4 的发现，到大规模microRNA 转录组的测定，再到目前microRNA 通过基因沉默方式调节靶基因表达的机制研究，一共经了三个阶段，尤其是大规模转录组测序后，大量的microRNA 被发现，与之相关的功能性研究正如火如荼的展开。多年来一直被认为是基因组中垃圾成分的非编码RNA 终于越来

2、越得到人们的重视。研究发现，microRNA 对基因表达和生长发育起到了重要的调节功能。近年来，microRNA 参与动物表型调控的报道相继出现。2009 年，发现了果蝇的miR-8 基因在调节果蝇体型方面有重要作用，对miR-8 进行敲除实验发现果蝇体型明显变小，这说明microRNA 通过改变mRNA 的翻译水平能够显著的影响动物的表型。1 microRNA 简介1.1 microRNA 的发现早在1993 年，Lee 等利用遗传分析方法发现了第一个microRNA: lin-4，它是线虫中的一个长度为22 nt 的小分子非编码RNA。这种单链通过碱基配对的方式结合到靶mRNAlin-14

3、 的3'末端非翻译区( 3'-untranslational region，3 ' UTR) ，从而抑制lin-14 的翻译，但并不影响其转录。7 年以后，另一个促进线虫幼虫向成虫转变的基因let-7被发现，它的转录产物是长度为21nt 的RNA 分子，作用方式与lin-14 相似，结合在lin-47和lin-57 的3'UTR 来抑制基因的翻译。到目前为止，已经在模式生物中发现了大量miRNA，当然miRNA 的数量远远不止这些，还有更多的miRNA尚未发现。1.2 microRNA 的产生过程microRNA( miRNA，miR) 是由约21 25 个核苷

4、酸组成的分子，通过抑制mRNA 的翻译或者促进其降解而起到负性调控的作用。目前动物细胞中的miRNA 多是短序列的非编码蛋白质RNA，不仅在基因位置上保守，并且还具有很高的序列保守性。动物miRNA 成熟需要经历两个过程: 在前期长度大约为300 1 000个碱基的pri-microRNA( miRNA 复合体) 先被加工成具有发夹结构的约70 90 个碱基大小的单链RNA前体( pre-miRNA) ，然后pre-miRNA 在Dicer 酶、ATP 和解旋酶的共同作用下分裂成21 25bp 的成熟miRNA。1.3 microRNA的特点一般为22nt左右，其端允许有nt长度的变化，如存在

5、于拟南芥中26nt的一类RNA也属于miRNA；广泛存在于几乎所有的真核生物中，本身不具备开放阅读框（open read frame ORF），不能够编码蛋白质；成熟的miRNA端为单一磷酸基团，端为羟基，它们可以通过不完全互补配对与上游或下游的序列形成茎环结构；miRNA基因不是随机排列的，其中一些基因成簇排列且常常协同表达；miRNA具有保守性，鼠和人类中已知的miRNA有53%与红鳍东方鲀（河豚）或斑马鱼同源，约12%的miRNA在线虫、果蝇和植物中表现出保守性；大多数miRNA的表达具有特异性和时序性，在不同的组织中miRNA的表达水平和类型不同，随着机体发育阶段的不同miRNA的表达

6、也发生变化。如miR-3miR-7在果蝇早期胚胎形成时特异表达，但在其他阶段未检测到表达；miR-212、miR-21和miR-22在幼虫阶段表达量升高，并在成虫阶段维持较高水平。1.4 microRNA 的生物学功能成熟的miRNA 通过与靶基因的特异结合调控基因的表达，这种调控作用机制有两种: 在形成成熟的miRNA 后，其结合到靶基因的3'UTRs( 3'端非翻译区) 来抑制靶基因的翻译过程，从而起到调控的作用。它能够像siRNA 一样通过碱基互补配对结合到靶基因上，降解掉靶基因序列，以此来对靶基因进行调节。但在哺乳动物中，细胞内还没有发现内源siRNA，外源siRNA

7、所介导的RNAi 的抑制作用是一种抵御机制，而miRNAs 恰恰在哺乳动物细胞内扮演了siRNA 的角色。miRNA 与siRNA 不仅功能相似，并且从二者的加工过程来看，在前体的加工过程中都依赖相同的Dicer 酶参与。这两种小分子从序列上到它们发挥作用的机制上都存在一定的相似性，很难从本质上区分。所以，如何在实验中正确区分和鉴别siRNA 和miRNA，这还需要进一步的研究。miRNA作为一种特殊的表观遗传学修饰，成为当下研究的热点与重点。很多研究表明，miRNA参与了生物体的生长增殖、细胞周期进程、凋亡和衰老等生物学过程，并与多种疾病的发生紧密相关。成熟的miRNA能在细胞核和细胞质间穿

8、梭，可直接作用于核内基因。该过程主要由输出蛋白1 调控。研究表明，miR-29b含有六核苷酸元素而能指导其核运输，证明miR-29b主要定位在细胞核。几个miRNA 通过结合在一些特异基因的启动子区调控核内基因表达。这些研究说明miRNA 能在细胞核内行使功能。一些miRNA 在参与双向负反馈环循环调节转录因子的同时，其表达也受到miRNA调控转录因子的反向调控。miRNA-24 在造血干细胞分化过程中表达上调，抑制细胞周期进程，主要是通过直接与转录因子E2F2 mRNA的3'UTR碱基互补配对，下调其表达。同时，研究表明，在细胞周期的特定阶段，miR-27a会抑制肿瘤抑制因子FBW7

9、的表达，释放对其底物细胞周期蛋白E的负影响，从而促使G1期向S期转换。这些实验都说明miRNA作为一种新的调控因子，对细胞周期过程具有调控作用。miRNA 也具有调控心肌细胞和骨骼肌的分化和增殖、视网膜发育、肾发展及红细胞和血管生成等功能。但miRNA的多样性功能作用机制是研究的难点。1.5 miRNA 的形成及其调控机理miRNA 的编码基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等形式存在于基因组中，通常位于基因间或内含子区域，图1 为几种后生动物的miRNA 及其前体。这些miRNA或前体先由miRNA 的编码基因转录形成初级miRNA（Pri-miRNA），其长度通常大于100 bp（有时甚至有几百b

10、p），且带有一个或多个茎环结构，经Drosha 与DGCR8两种酶剪切后形成带发夹与茎环的miRNA 前体结构（pre-miRNA），然后通过Exportin 5 酶将前体运送至核外，接着经Dicer1 酶和TABP2 酶作用剪去发夹环形成双链结构，之后双链解开。其中，一条链即成熟miRNA链，与靶mRNA 的3非翻译区（UTRs）结合形成双链被称为沉默复合体（RISC）；而另一条称为星号链。RISC 诱导靶mRNA 的降解或抑制其翻译成蛋白或两者兼而有之，从而在转录后水平下调靶基因表达，见图2。细胞中miRNA 编码基因的拷贝数粗略估计为500，比mRNA 编码基因的拷贝数高。然而拷贝数因物

11、种和细胞种类而异。研究发现，单链miRNA 区域在形成成熟链时可生成一系列其他形式的序列，这些序列长度不同，且有着不同的3及5末端，被称为miRNA 异构体（isomiRs）。检测表明，这些异构体为变异核酸或是3端附加的非临时核酸序列，也可能同样具备调控功能。miRNA 在生理调控方面有许多新奇的潜在价值。它们有着诸多靶标基因且可通过不同的分子途径影响生理进程。在动物中，microRNA的合成大致可以分为在细胞核内和细胞质内两个阶段：在细胞核内，首先编码转录microRNA的基因由多聚酶转录生成pri-microRNA，pri-microRNA被核内RNase核酸酶Drosha等一些成分构成的

12、微处理器（microprocessor）复合体加工成发夹结构长度约5570nt的pre- microRNA，然后在Exportin5和蛋白因子Ean的帮助下pre- microRNA就从核进入到了胞质内；在细胞质内，pre- microRNA在Dicer酶与结合蛋白的作用下被切割成21nt25nt的双链microRNA分子，然后microRNA分子被解链，其中一条降解，另一条则为成熟的单链microRNA，单链microRNA进入一个核糖蛋白复合体miRNP（也叫RNA诱导的基因沉默复合物RISC），microRNA与靶基因的3UTR区互补配对，从而实现指导miRNP复合体对靶基因mRNA进行

13、切割或翻译抑制。miRNA 在细胞核内DNA 聚合酶作用下由DNA 转录为初级miRNA（pri-miRNA），在核内经RNase-Drosha 酶加工剪切释放出发夹结构前体pre-miRNA，然后由依赖RNA 的核转运受体家族成员输出蛋白5运到胞浆，在胞浆中通过RNaseDicer二次加工为单链的成熟miRNA，与RNA诱导沉默复合物（RISC）结合，识别靶mRNA并抑制其翻译，或通过去腺苷酸化和脱帽引起mRNA降解。miRNA的作用机制研究动物体内发现的大多数miRNA 能与目的基因mRNA 3'UTR形成不完全碱基配对，从而促进翻译抑制或靶基因mRNA 的降解；而植物体内的很多m

14、iRNA指导RISC靶向含有能与其完全互补配对序列的mRNA，这种作用通过Argonuate（AGO）核酸内切酶对靶标mRNA的强烈抑制作用完成。miRNA作用机制研究主要集中于以下几点：miRNA可能通过抑制核糖体的组装或抑制翻译起始复合物的形成或阻止polyA结合蛋白（PABP）结合到mRNA抑制翻译起始；miRNA 可能引起新生多肽链的翻译同步降解或引发大量核糖体脱落及高频次的翻译提前终止来进行翻译起始后的抑制；一些mRNA 降解酶通过定位于被降解的mRNA 中，介导miRNA 衰减mRNA，下调靶mRNA 水平。同时，相关研究发现，miRNA在某些条件下能正调控基因的表达，miR- 1

15、0 能结合到核糖体蛋白mRNA 5'UTR，促进其翻译，从而促进总蛋白的合成。然而，miRNA究竟以怎样的方式靶向目的基因调控其表达的具体机制仍不得而知。与此同时，与疾病发生过程相关的miRNA表达谱也发展成熟，但如何识别miRNA 的直接靶基因成为研究的最大挑战。主要的研究方法包括计算靶标预测、实验靶标的识别及靶基因的验证。前者主要依据mRNA的靶序列与成熟miRNA 5'UTR 种子序列严格互补配对，缩小其可能的靶基因范围，但无法避免假阳性和假阴性预测的发生；后者在前者的基础上，在具体的目标细胞中使用不同的实验方法进行验证。研究发现，可以对RISC 用免疫共沉淀分离miRN

16、-AmRNA复合物，但这种免疫共沉淀方法并不一定要求体内的miRNA-mRNA能相互作用，在细胞裂解过程中人为造成miRNA 与mRNA 非特异性关联会对其产生干扰。体内的miRNA-mRNA相互作用太弱也会使免疫共沉淀失败。由于miRNA 的调控能改变蛋白表达水平，蛋白质组学也可能为miRNA靶标的发现提供技术支持。氨基酸的稳定同位素标记细胞培养（SILAC）可能是鉴定受影响蛋白的一种工具。在对靶基因进行验证时，通常使用萤光酶素报告基因系统，此时，设计合适的对照组来检测miRNA-mRNA相互作用的特异性是非常重要的，如靶基因3'UTR mRNA 序列的模拟mRNA 类似序列和突变序

17、列都不能结合在miRNA的互补位点上。1.6 miNA 的命名miNA 的命名一般按照如下规则： 1) 在命名规则确定之前发现的miNA，如lin-4 和let-7，则保留原来名字; 2) miNA 的成熟体简写成mi，miNA 的前体则用mir 表示，再根据其物种名称(采用34个字母的缩写来表示) ，以及被发现的先后顺序( 阿拉伯数字表示) ，例如mmu、hsa 和rno 分别代表小鼠、人和大鼠，如hsa-mi-124 和mmu-mi-124; 3) 高度同源的miNA在数字后加上英文小写字母( a，b，c，) ，如hsa-mi-34a、hsa-mi-34b 和has-mi-34c; 4)

18、通常一个miNA 的前体长度大约为7080nt，很可能两个臂会都会产生miNA。以前的做法是: 表达水平较低的miNA 后面加上* 号，而表达水平较高的miNA 后面不加任何符号，一般认为miNA* 是没有功能的，但是最近有文章报道它其实是有功能的，甚至在某些组织里miNA* 的表达量高于miNA。现在已经逐渐取消了这种命名方式，如今认为，如果一个miNA 前体的两个臂能够分别加工产生miNA，则以“-5p”和“-3p”分别命名，分别表示从前体的5'端臂和3'端臂加工而来，如hsa-mi-124-5p 和has-mi-124-3p; 5) 由不同染色体上的DNA 序列转录加工而

19、成的具有相同成熟体序列的miNA，则在后面加上阿拉伯数字以区别，如hsami-521-1 和hsa-mi-521-2。2 miRNA的鉴定方法2.1 实验法小RNA 分子的直接克隆测序仍然是目前鉴定miRNA的主要方法。第一种方法是将组织RNA经变形聚丙烯凝胶电泳分离，回收1925 nt 的小分子RNA，将这些小分子RNA 的3和5连上接头，逆转录后用与接头对应的引物进行PCR扩增，然后将这些片段进行克隆，构建cDNA文库，并对每个克隆进行测序分析。另一种方法为利用15%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离总RNA中1628 nt的小片段，poly（A）聚合酶的作用在这些小片段的3端进行多聚腺苷酸化

20、反应，逆转录得到cDNA，并在cDNA的3端进行多聚鸟苷酸化反应，后进行PCR扩增、克隆测序分析。通过实验法直接进行miRNA的克隆，最大的优点是能够精确地确认每一个miRNA，并准确区分开只差一个碱基的家族分子。但是，这种方法也存在着明显的局限性：第一，文库构建时间较长，并且每个文库都需要经过大量的测序反应才能获得足够的数据，耗时、低效且价格昂贵；第二，有些miRNA具有组织特异性或在所研究的组织中可能低丰度表达，另外一些其它内源性非编码RNA和mRNA的降解产物产生的干扰，使该方法很难鉴定组织特异性或低表达的或具有特殊的碱基构成，存在转录后修饰的miRNA。随着分子生物学技术的不断发展，大

21、规模的测序技术不断涌现。利用高效测序技术，一个标签序列可以一次测出一段序列中的17个核苷酸序列。近年来高通量测序技术（如454，Solid和Solexa等测序平台）的出现使该方法得到了极大的完善，能够一次性获得百万级的高质量小RNA分子，并从全基因组范围内发掘已知和未知，保守和非保守的miRNA，大大的弥补了过去难于鉴定低丰度的miRNA缺点。以深度测序为基础的测序分析技术刚刚兴起，并且每次测序可获得3Gbp的序列需要，因此需要借助生物信息学的技术来处理分析。2.2 生物信息学分析法随着全基因组测序工作的完成，生物信息学方法逐渐发展成为鉴定miRNA的有力方法，同时，该方法弥补了直接克隆法的一

22、些不足，大大提高了鉴定miRNA的效率。目前，科研工作者根据已知miRNA的特征信息及其对靶分子的作用方式建立了多种miRNA的计算机识别方法。第一个预测软件是MiRscan，它能特异性的识别2个物种间的同源序列。该软件是由Lim等依据与已知miRNA相似性开发设计的。并且在线虫和人类中利用该软件共预测到了35和107个新miRNA。利用已知miRNA的序列和结构的保守性在全基因组范围内搜索miRNA是分子生物学最常用的搜索方法，即通过对miRNA及其成熟序列的一级结构和二级结构的保守性分析寻找新的候选分子。典型的根据同源性搜索而设计的软件srnaloop是由哈佛大学医学院的Grad等利用mi

23、RNA的序列保守性及结构相似性设计而成的。该软件是一个类似于BLAST的应用程序，但是该软件支持更短片段并排列成互补的碱基对。该软件已在线虫中预测出214 种新的miRNA。另外，越来越多的研究者利用软件分析发现了新的miRNA，如Wang等开发的计算机方法MiRAlign是一种依靠序列和结构比对来寻找动物中的miRNA的方法。当利用同源性没有发现新的miRNA时，就需要科研人员寻找其他的方法，如利用靶序列的保守性识别miRNA。在生物体内，同一miRNA可能调控多个靶分子；多个miRNA也可能作用于同一mRNA靶分子。目前，一些研究者利用靶序列中潜在的保守性作为识别miRNA的重要依据。在成

24、熟miRNA中的种子序列（28位置的7个核苷酸），他们在与靶mRNA 结合中起着重要的作用。Xie 等在mRNA 的3非翻译区发现了106个保守的基本序列，其中72个与大约一半的已知miRNA5端相结合组成68 bp的种子双螺旋。findMicroRNA软件是Adai等在拟南芥中利用单基因组方法设计的搜索miRNA的软件,该软件主要用于植物miRNA的鉴定。它主要依赖miRNA与其对应的靶序列紧密互补来识别候选miRNA。之后该软件将进一步对这些候选miRNA的成熟序列的相邻序列的互补性进行分析, 使得一个RNA内的茎环结构的组成和已知miRNA前体结构保持一致。拟南芥基因组中有29 399个

25、转录本可以和27 987个特定基因座相对应, 用此软件对其分析可以在基因间隔区内识别潜在的microRNA 前体序列。实验方法和生物信息学方法由于各有优缺点，因此，单一的方法可能不能满足试验的需要，或鉴定不出某些特异性的miRNA序列，因此，需要科研工作者同时结合这两个方法，这样在能在各种物种中准确的找到尽可能多的新的miRNA。3 miRNA的检测方法3.1 miRNA芯片技术基因芯片技术是近年来兴起的一种高通量、灵敏度较高的检测基因表达的方法。该方法能够在短时间内同时检测到所有已知miRNA的表达谱。miRNA表达谱的精确分析是研究miRNA在生物体中的功能及其所发挥的作用的基础。目前，有

26、关该技术已经广泛应用于各种生物体的miRNA的表达谱分析，主要包括各种组织miRNA表达谱以及在各种生理和病理状态下的miRNA表达谱。miRNA芯片的制作中关键的步骤就是探针的设计，一般表达谱芯片采用合成的寡核苷酸或cDNA片段作为捕获探针，对转录本的高特异性和高亲和度是理想探针的目标。由于miRNA的杂交温度和成熟序列长度的限制，使得对探针的设计也受到了一定程度的限制。当利用特定的温度标记芯片的miRNA探针时，高Tm值的探针和低Tm值的探针将可能产生不平行或非特异性的信号理论上基因芯片并不能进行定量的测量，由于不同的miRNA具有不同的亲和力，但是基因芯片可以用于不同状态下miRNA表达

27、量的比较分析。因此，通常科研人员会利用增加或减少探针的碱基长度来平衡探针的杂交温度，已获得更精确的芯片分析结果。Liu等用含有245个人类及模式动物鼠的基因组探针的微芯片筛选miRNA，Chen Jian-Fu等通过基因芯片的方法证实了miR-1与miR-133在肌肉的发育过程中能够起到调节作用。但是，基因芯片的方法也存在着一定的不足之处，主要包括制作和检测均需要昂贵的仪器设备，而且结果的重复性比较差；对于不同的miRNA需要优化不同的杂交条件，因此对于高度相似的miRNA或同一家族中的miRNA很难区分。最新研究结果显示，一种新的液相芯片将为后基因组时代的科学发展提供一种新的强有力的技术支持

28、。该芯片的体系是由许多不同的小球体为主要基质所构成的，其中每个小球体上固定不同的探针分子，在每一个特定的探针上都具有一个独特的色彩编号以区分不同的探针，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该方法能够对同一个样品的不同分子进行快速定性，定量分析，因此这种方法也成为xMAP技术。这种精确的能够同时定性，定量的分析方法，具有非常广泛的应用前景。3.2 RNA印迹检测方法该方法也叫做Northern blot，广泛应用于检测分析miRNA的表达。RNA印迹通过凝胶电泳的方法将不同大小和不同分子量的总RNA进行分离，并将分离得到的RNA 转移至尼龙膜或硝酸纤维素膜上与已知标记的探针进

29、行杂交。所得结果可同时用于miRNA的表达水平的定量检测，和用于区分miRNA前体与成熟体的位置。因此，该方法被誉之miRNA检测的“金标准”。目前，地高辛（DIG）标记和生物素（BIOTIN）标记等一些无放射性的探针标记方法已被广泛应用。但是该方法灵敏度和特异性不高，鉴于此，科研工作者发展了用锁核酸（LNA）修饰的杂交探针取代传统的方法。渗入LNA可使探针在短时间内获得较高的Tm值，同时渗入LNA的探针与核酸序列杂交具有严格的序列特异性，在每3个碱基中渗入1个LNA，可以达到最好的杂交效果，研究表明，LNA修饰的寡核苷酸探针能够使检测的灵敏度较传统方法提高100倍以上。3.3 原位杂交检测方

30、法即miRNA ISH，通过将组织或细胞中的核酸与标记的DNA或RNA核酸探针进行杂交，检测互补DNA或RNA在组织、细胞和亚细胞中位置，这种技术，就叫做原位杂交。特异性的原位杂交可以检测细胞，胚胎以及在福尔马林固定或石蜡包埋组织中miRNA的表达，该方法能更直观的展现miRNA的空间表达模式。该方法可以用来检测细胞水平的miRNA，还可以检测和比较不同细胞系中的miRNA的表达。但是其主要缺点是技术掌握困难，所用试剂价格昂贵，试验周期长。LNA 也同样是原位杂交技术中最常用的探针。Wienholds等首次应用LNA探针在斑马鱼中检测了数百个miRNA的空间表达模式。随着科技的发展，原位杂交的

31、技术也得到了改进，Robert等采用RNA探针，利用TMAC的高严谨洗涤及RNaseA处理产生序列特异性的杂交条件来检测成熟的miRNA。应用LNA修饰的miRNA寡聚核苷酸探针的原位杂交目前已经成功用于斑马鱼、小鼠、鸡等物种的胚胎或组织切片研究。3.4 荧光定量PCR检测方法成熟的miRNA分子片段较短，常规的RT-PCR无法完成miRNA的定量或半定量检测。茎环状引物以及RNA加尾和引物延伸RT-PCR方法的发明，较好的解决了这一问题。实时定量PCR的最大优点是其检测具有较高的精度及灵敏度，不需要标记，操作简单等。利用茎环状引物所涉及的荧光定量PCR引物，能够在短时间内获得多个结果，检测多

32、个miRNA的表达并且需要的RNA量也相对较少，因此被广泛用于组织miRNA表达谱的构建。Stem-loop实时定量PCR是miRNA进行实时荧光定量分析的主要检测方法。该方法具有以下几个优点：特异性高，特异的茎环反转录引物能够保证定量反应不受前体的干扰，并可精确辨识高度同源的miRNA序列；所需样品较少，需要的总RNA量仅110 ng左右；定量线性范围较宽和检测灵敏度较高，从几个拷贝到几万个拷贝，定量线性范围可以跨越7个数量级；适用范围广，纯化的RNA、总RNA以及细胞裂解物均可以用于检测miRNA的表达量，同时，还可以进行单细胞的miRNA 表达谱分析。Varkonyi-Gasic 等利用

33、该技术成功地对拟南芥中多种miRNA进行了差异表达分析。4 microRNA 对动物表型调控的研究进展自从1993 年首次在线虫中发现microRNA 以来，越来越多的micoRNA 相继被报道，它们通过与靶mRNA 的特异位点结合，抑制靶蛋白的产生或者降解mRNA，从而调节内源基因表达，miRNA在基因转录组调控网络中扮演了重要的角色。4.1 miRNA 参与动物表型调控小鼠作为分子生物学研究的模式生物，一直以来都是科学家们研究动物表型性状的良好模型。科学家们通过在肥胖小鼠的肝脏和白色脂肪组织( WAT) 中过表达miR-335，发现小鼠会发生病理性肥胖症，表明miR-335 参与了小鼠肥胖

34、发育的调节，通过过表达miR-143 科学家发现了相同的症状，并且发现miR-143 与脂肪细胞分化marker 基因: PPAR、aP2 的表达量相关。microRNA 对动物骨骼肌表型的调控作用主要是通过调节肌细胞的增殖与分化来实现的，为了了解microRNA 在肌肉发育中的重要作用，研究者们做了大量工作。miR-155 是一种多功能的microRNA，参与细胞增殖和分化等多种生物学功能，一些研究证明，miR-155 可促进肌肉细胞的增殖和分化。通过分析miR-155 在长白猪(瘦肉型) 和通城猪(脂肪型) 骨骼肌发育过程中的表达变化，发现在长白和通城猪骨骼肌发育过程中其呈现不同的表达模式

35、，这就说明，miR-155能影响猪骨骼肌发育，与猪肌肉的表型有关。同样在哺乳动物中，The Olfactomedin-like 3( OLFML3) 基因对产后骨骼肌的生长发育起调控作用并随着发育下调表达，最终影响其表型，研究发现miR-155 对OLFML3 的表达也起到了调控作用。miR-148a 是一个新发现的肌源性microRNA，参与肌肉分化。过表达miR-148a，促进肌细胞分化，敲低miR-148a，抑制了肌肉分化。通过生物信息学分析，发现了ROCK1 ( rhoassociated coiled-coil containing protein kinase 1) 基因，它对肌细

36、胞生成起抑制作用，进一步的研究发现miR-148a 作用于ROCK1 的3' UTR 区，miR-148a通过与靶基因结合并对其进行降解，解除掉了ROCK1 对肌肉生长的抑制作用，从而促进肌肉分化。miR-1、miR-206、miR-181 以及miR-29也都是通过促进肌细胞分化的形式影响骨骼肌表型的。4.2 microRNA 敲除对动物表型的影响科学家们发现，在小鼠中敲除Dicer、Dgcr8基因，会导致成熟的miRNA 无法合成，从而小鼠在胚胎早期死于严重的发育缺陷。进一步的研究发现Dicer、Dgcr8、Drosha、Ago2 都参与成熟miRNA 的合成，是小鼠生存的必需因子

37、，同时，Dicer 以及miRNA 也是形成动物皮肤、脊椎肋骨、肺脏的上皮细胞所必需的关键因子。在家猪的卵母细胞和胚胎中也发现Dicer 酶和miRNA 表达，与dicer 酶特异的miRNA 比如像miR-24 的表达量随着胚胎发育的不同时期和培养条件在不断变化，这种与dicer 特异的miRNA可以作为评判胚胎质量的标记基因。miR-8是参与调控果蝇体型的microRNA，miR-200s 是从果蝇延伸到哺乳动物研究中的。miR-200 家族有5 个成员: miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429。通过制备基因敲除小鼠，并与转基因小鼠杂交，获得了

38、在脂肪细胞中剔除目的基因的小鼠，对小鼠的生长发育、生理生化和代谢指标及组织形态等多个方面进行表型分析，发现剔除目的基因簇的小鼠无胚胎致死性，并且在4 周龄的时候开始出现生长减缓的现象，体内沉积脂肪量较对照小鼠减少了一半。用生物信息学软件进一步对miR-200 靶基因和互作关系做出预测，结果发现PI3K-Akt-mT0R 等生长发育和脂肪代谢的相关信号通路被抑制是导致基因剔除小鼠山现体重减轻、脂肪减少的主要原因。在果蝇中与miR-200 功能相似的是miR-8，通过对胰岛素信号通路研究发现，果蝇的保守性microRNA miR-8 /miR-200 作用于靶基因USH/FOG2，再通过USH/F

39、OG2 抑制PI3K 的活性来抑制细胞的生长，从而使果蝇的体型发生改变。在2012 年，科学家又发现miR-8 通过调节果蝇发育的成熟度也可以改变其体尺的大小39。miR-1 在肌肉组织中特异表达，对苍蝇敲除miR-1，会造成苍蝇在胚胎发育期死亡，或者在幼虫时期肌肉分化异常。尽管在哺乳动物中，miR-1 存在miR-1-1 和miR-1-2 两种形式，在小鼠中仅仅对miR-1-2 进行敲除，就有50% 的胚胎死于心肌缺陷，这种功能性单倍剂量不足表明miR-1是心肌发育所必需的。4.3 microRNA 的关联性状研究mRNA 作为编码蛋白质的唯一信使，在决定生物表型时具有重要作用，microR

40、NA 通过修饰调节mRNA 来改变生物体的外观表型，现在研究中最常见的就是microRNA 本身发生单碱基的突变，形成的SNP 位点改变了microRNA 的序列，从而使其与mRNA 的作用发生改变，而这个SNP 可作为关联性状的标记。在一项研究中，科学家发现一个候选基因，它可能参与每窝仔猪的数量的调控，这个基因位于僵猪的一个QTL 附近。通过对大白猪和梅山猪miR-27a 基因的测序，发现一个T /C 突变的SNP 位点，然后通过对大白猪和梅山猪SNP 位点与每窝仔猪数进行关联分析，证明了梅山猪的仔猪中，AA 基因型不同于AB 和BB，并且AA 基因型仔猪的成活率也不同于AB，而在长白猪中并

41、没有此差异。几乎在相同时间，科学家们鉴定出猪miR206 /MiR133B 的基因中有12 个SNP 位点，其中10 个与miR206 相关，两个与miR133B 相关，对不同猪种等位基因频率的测定，并且对肌纤维特点、瘦肉率、产肉质量与miR206 和miR133B 的SNP 位点进行了关联分析，发现miR206 与肌肉形成的IIa、IIb 类型纤维相关，与汁液流失率、明亮度和背标厚度、瘦肉率等肉质质量相关，发现miR133B 的SNP 位点与总肌肉纤维数目、眼肌面积和肌肉的pH 相关。这些SNP 位点显著影响miR206 和miR133B 的成熟，主要是通过调节原始microRNA 转变为m

42、icroRNA 前体的过程。更有趣的是，在miR206基因型的SNP 中，改变其SNP 的量与表型变异型相关，这就说明，猪miR206 /miR133B 簇的多态性对于肌肉和肉质性状来说是一种遗传因子。成骨蛋白( BMP5) 基因是SSC7 脂肪性状数量基因座的潜在位置基因，通过对梅山猪和大白猪的比较测序，发现一个位于3'非编码区131 处C /T 的SNP 位点，通过对322 头大白猪和梅山猪杂交二代进行关联分析，发现CC 基因型比TC 基因型有更薄的背部脂肪和更重的后腿肌肉，并且与TT 基因型相比有着有更高的脂肪百分比和更少的瘦肉率。此外，C /T 碱基的改变可能通过RNA 杂交的

43、方式使BMP5 基因与let-7c 和miR-184 发生互作。通过对猪成纤维细胞过表达BMP5 基因发现， let-7c 和miR-184 会抑制BMP5基因的表达。这就表明这两个microRNA 可能参与BMP5 基因的翻译抑制，这个SNP 位点对于脂肪性状有着很好的标记作用。5. microRNA在肌肉组织中的表达及调控生肌调控因子，如肌分化因子（MyoD）、成肌素（myogenin）、肌生调控因子（MRF4）、生肌调节因子5（Myf5）、肌细胞增强因子（MEF2）决定着肌肉的生长与发育。因此，调控这些生肌因子的microRNA影响着肌肉的增殖与分化，并与肌肉有关的疾病相联系。研究结果表

44、明，miR-133是通过调控血清应答因子（SRF）、肌肉增强子（MEF2）、GATA结合蛋白4（GATA4）、Nk2转录因子5的表达，从而抑制成肌细胞分化或促进成肌细胞增殖。miR-1调控生肌因子MEF2、MyoD和其他因子的表达，增强成肌细胞的分化，抑制增殖。然而，miR-1、miR-133调节肌肉细胞的增殖和分化均是通过抑制组蛋白脱乙酰酶（HDAC4）和SRF的活性。而且miR-1抑制HDAC4的同时，HDAC4又抑制MEF2的活性。miR-206通过降低缝隙连接蛋白43的表达量，促进肌细胞融合，有利于神经肌肉接头的形成。反过来，目标因子的表达，也可诱导microRNA的表达。在肌细胞增殖

45、、分化过程中，MyoD和成肌素的共同时序调控，诱导miR-1、miR-133和miR-206表达，其调控功能见图。microRNA的表达在肌肉组织和细胞中具有发育性特点。在猪胚胎发育过程中，微阵列检测肌肉组织256种microRNA的表达，发现140种microRNA的表达具有明显的发育性特点。成年猪miR-206的表达量比65胚龄猪提高2.9倍；在肌肉发育的整个过程中miR-1和miR-133的表达水平均较高。细胞水平的研究指出，miR-1和miR-133206在增殖期的卫星细胞中几乎不存在，但在胎儿生长发育的个阶段（60、90和105）和成年时期的表达量较高，说明miR-1和miR-206

46、调控着卫星细胞的增殖。总之，在肌肉生长发育的不同阶段，microRNA分别调控卫星细胞的增殖、分化及发育，进而影响着肌肉组织的生长。当然，microRNA的异常调节可引起肌肉组织发育异常，出现肌肉相关疾病。研究结果表明，microRNA异常表达可引起心脏发育异常，心肌肥大和电传导等，如：miR-1和miR-133a在心律失常、心肌肥大、心肌增生的鼠中表达水平下降，miR-195在鼠和人的心肌肥大期间是上调的。因此，microRNA可作为肌肉有关疾病的诊断标记和治疗目标。因此，对microRNA调控肌肉生长发育过程的研究，不仅对microRNA的调控机制有了进一步的认识，对动物生长发育也具有重要

47、的影响，还能为治疗肌肉有关的疾病提供新的思路。6. microRNA在脂肪组织中的表达及调控microRNA调控着脂肪代谢，与脂肪代谢过程息息相关。如：miR-103、miR-122、miR-143、miR-107、miR-222等。Esau等研究结果表明，抑制小鼠miR-122的表达能减少血中胆固醇水平，促进肝脏中脂肪酸的氧化，降低肝脏脂肪酸和胆固醇的合成率。初步认为miR-122调控胆固醇和脂肪酸代谢。Xie等研究指出，前脂肪细胞miR-103和miR-143的异常表达，加速脂滴的聚集，对脂肪形成具有正调控作用。而miR-222和miR-221在脂肪形成中起负调控作用，在肥胖病人的脂肪组织

48、中上调。在鉴定腹膜脂肪组织microRNA的研究中发现，miR-143与脂肪细胞分化有关，且促进肌内脂肪细胞的增殖；miR-103和miR-107与脂类代谢有关，miR-103在猪脂肪组织中参与脂肪代谢和脂肪细胞分化的调控；miR-221和miR-222与脂肪细胞因子的表达有关。Cho等鉴定猪肌内脂肪的生成和脂肪形成的microRNA，结果表明，在脂肪组织中检测到ssc- miR-143，且ssc- miR-143在脂肪形成分化中是上调的ssc- miR-130b、ssc- miR-338、ssc- miR-450b、ssc- miR-339在脂肪组织中均表达。进一步的功能验证显示，miR-2

49、2通过阻断TGF-信号通路，抑制其对脂肪形成的调控。miR-143通过下调脂肪合成因子促蛋白激酶（ERK-5）基因的表达，降低脂肪组织中脂肪的合成。Let-7通过抑制脂肪酸合成因子高迁移率蛋白（HMGA-2）基因，阻止脂肪细胞中脂类的合成。miR-27、miR-130通过直接下调脂肪细胞分化因子过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR-）的表达，降低脂肪细胞的分化能力，减少脂肪细胞的数目。miR-371下调脂肪细胞分泌因子脂联素的表达，降低细胞中甘油三酯含量。反过来，目标因子也可调控microRNA的表达。在脂肪沉积过程中，TNF-基因诱导miR-103和miR-143表达上调，而miR-221和

50、miR-222表达下调。因此，研究脂肪组织中的microRNA对动物的脂肪沉积研究有重要的指导意义，对动物生长及品质调控分子研究具有重要的作用。7. miRNA 靶标的动态变化与功能性靶标每种microRNA 针对着数个甚至上百个潜在靶基因。越来越多的实验证据表明，不同的细胞或同一细胞的不同状态，某一特定miRNA 可调控的靶标是不完全相同的，是动态变化的。为此，我们提出了miRNA 功能靶标的概念。那么，什么原因导致miRNA 靶标的时空特异性及动态变化？我们认为从以下两个方面可能得到比较合理的解释。7.1 竞争性内源RNA 调控网络目前认为miRNA 与靶标mRNA 的比例对于miRNA

51、的功能发挥至关重要：即如果调节本身低表达的miRNA 对其靶标的影响甚微，调控高表达miRNA，将会对靶标的功能具有更深远的作用。Seitz 提出竞争性内源RNA 假说，具有相同miRNA 应答元件的mRNA、假基因转录物、长链非编码RNA 等转录物通过竞争性结合同种miRNA 来调节各自的表达水平，从而影响生物学功能事实上这一假说在PTEN、VACN和CD44的调控过程中得到证实我们课题组在研究miRNA 与靶标mRNA 相互作用过程中，发现了同一miRNA 的不同靶标具有竞争作用，而这种竞争作用体现在mRNA 细胞质与细胞核分布比例高低，即靶标mRNA 质/ 核比例高更容易被miRNA选择

52、调控，成为miRNA 的功能靶标。在不同细胞中，或者同一细胞不同状态下，功能靶标是动态变化的，与之对应的mRNA 质核比也是动态变化的，并且具有很好的一致性。虽然mRNA 质核比的调控以及miRNA 的优势选择机制都不清楚，但不妨碍将这一结果用于预测与验证miRNA 在特定时空的功能靶。7.2 靶mRNA 的单核苷酸多态性影响miRNA 与靶基因的相互作用与miRNA 多态性相比，靶基因3UTR 的多态性更加丰富。miRNA的靶基因3端发生突变并不影响蛋白质的序列，但可以引起蛋白质表达异常靶基因3端突变阻碍miRNA 结合，引起miRNA蛋白质合成抑制作用丧失这种现象已在头颈部鳞状细胞癌、结肠

53、癌、乳腺癌、糖尿病以及心血管疾病等相关基因中得到证明，显示出肿瘤中靶标对miRNA 调控的逃逸现象基因3端突变产生新的miRNA 结合位点，可以使基因表达抑制，在mRNA 没有变化的前提下引起蛋白质合成下降Sandberg 等还报道了在增殖细胞中mRNA 3UTR保守性的缩短，导致miRNA 靶位点减少或丧失，从而逃避miRNA 的负调控靶基因3端多态性或突变可以解释mRNA 表达未发生变化而蛋白质翻译产生变化的生物学机制，尤其为肿瘤生物学提供了新的研究方向。8 动物靶基因预测动物中miRNA与其靶基因部分互补配对，导致每个miRNA 基因可能会锚定数百个潜在靶标。Griffths 等研究将动

54、物miRNA 靶向特性分成miRNA-mRNA 配对特性、作用位点特性、保守性、位点的可达性、多结合位点特性和表达谱特性等六类，按与microRNA数字特征分类的相关程度（通常这种关联是间接的），归为数字特征各类，具体为miRNA-mRNA配对特性、作用位点特性、保守性和多结合位点特性等归为E类；位点可达性归为B类；表达谱特性归为F类，类别划分与第1节相同。运用常用动物miRNA靶基因预测工具，依据预测分析方法与某些数字特征是否有关联，进行类别标注，结果见表2。由表2中靶基因预测工具使用的数字特征分析发现，应用最多是位点的可达性（B 类特征）及miRNA-mRNA相互作用时生物过程中的特征（E

55、类特征）；而mirWIP、HOCTAR、TargetMiner预测工具中除了使用B、E特征外使用表达谱数据（F类特征）作为预测靶基因的特征；只有MirTif和EIMMo两个预测工具使用E特征；GenMiR+中使用E类和F类特征。说明在动物miRNA靶基因预测过程中生源论、miRNA-mRNA相互作用等生物过程中特征是靶基因预测关键特征。9 前景展望从1865 年孟德尔提出遗传规律至今已有148 年的历史，人们已经不再用最直观的表型挑选来对动物进行育种选择，虽然表型挑选可以在某种程度上反映动物的生产性能，但是并不规范，缺乏精确性。动物基因组序列只有2% 左右是编码序列，而有功能的只能占到10%，

56、到目前为止，已经鉴定具有功能的还只是其中的一小部分，还有大量的基因功能未知，并且已经鉴定的QTL 和主效基因还需要进一步的验证。microRNA 作为一种新发现的非编码RNA，通过抑制靶基因的翻译来发挥作用，那么通过对已鉴定出的与动物表型相关的基因进行microRNA 结合位点预测，就能筛选到调控表型的microRNA，从而在分子层面上对动物育种进行选择。同样，microRNA 单碱基突变形成的SNP 位点与产生的相应表型之间通过关联分析，也可以作为一种分子手段来进行育种选择。甚至在某些动物疾病的研究中，可以通过检测异常表达的microRNA 来对这些疾病进行标记，对以后的疾病预防和治疗也会起

57、到积极的作用。目前，分子育种在生产实践中已经起到了关键的作用，产生了极大的社会效益和经济效益，因此，microRNA 作为分子育种的新手段将会成为21 世纪分子育种的新宠儿，最终推动动物育种的发展。microRNA 的研究已经深入到生物研究的各个领域和方向，有着非常广泛多样的生物功能，在生物体内对靶基因的表达调控可能和有着重要功能的转录因子一样重要。miRNA 的研究重点是找到其相应的功能靶标，而目前来说，大量的有明确功能的靶标还未确定，这就限制了对参与重要表型调控的miRNA 的分子机制的深入认识，所以miRNA 的具体功能仍旧是个迷。但是，随着基因组学研究的不断进行和深入，大量的micro

58、RNA功能靶标将会被确定，到那时基于转录后miRNA基因沉默分子机制的研究将会更加明朗和清晰。microRNA参与许多生物进程，调控着动物的生长发育，为动物生长及品质调控分子研究奠定了基础，对调控动物肌肉和脂肪组织生长发育、肉品质等具有重要意义。越来越多的microRNA被相继发现，但是其功能的分子机理研究还不完善，对其功能的研究有待更进一步。microRNA在肌肉、脂肪组织相关的疾病中也发挥着调控作用。microRNA可作为肌肉与脂肪相关疾病的诊断标记和治疗目标，可作为潜在的诊断生物标记，为许多疾病的诊断、治疗和预防提供新的思路和手段。miRNA 的加工成熟过程并不是单一线性的，是纷繁复杂的

59、，它具有时空转换性，多水平调节性从细胞核内转录水平的调控，Drosha 关键蛋白的切割(及不依赖Drosha 的方式)，前体miRNA出核以及在细胞质中另一个关键蛋白Dicer 的加工成熟(及不依赖Dicer 的方式)，这其中每一步都会受到各种调节因子的调控不同细胞或同一细胞不同状态上述调节因子都会发生相应改变，最终会导致miRNA 产生的时空特异性和动态变化另外，一些目前未知的因素是否会有可能引起miRNA 的时空差异和动态变化还不得而知譬如，目前体内发现的大量循环miRNA，它们的产生和细胞间转移极有可能引起miRNA 的时空差异和动态变化，深入开展这方面的研究，也许会使miRNA 的时空变化更丰富多彩充分认识到miRNA 及其靶标