免疫定性试验结果判读(周育洋)

1、今天的复习题今天的复习题 1、简述实验室选择免疫定性检测敏感简述实验室选择免疫定性检测敏感性、特异性、预测值、符合率的原则，性、特异性、预测值、符合率的原则，并举例说明。并举例说明。 2、简述丙肝抗体检测实验室诊断流程。、简述丙肝抗体检测实验室诊断流程。 3、简述造成、简述造成RPR试验假阳性的一部分试验假阳性的一部分原因。原因。 本课件免疫定性试验仅指临床通常使用的本课件免疫定性试验仅指临床通常使用的基于抗原基于抗原-抗体反应原理的试验抗体反应原理的试验 抗原抗原-抗体反应的特点：抗体反应的特点： *特异性特异性 *比例性比例性 前带（抗体多）后带（抗原多）前带（抗体多）后带（抗原多） *可

2、逆性可逆性 pH 离子强度离子强度抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型 沉淀反应沉淀反应 可溶性抗原可溶性抗原 凝集反应凝集反应 颗粒性抗原颗粒性抗原 补体参于的反应补体参于的反应 中和反应中和反应 标记免疫标记免疫 荧光荧光 放射放射 酶标酶标 发光发光 金标金标 影响抗原影响抗原-抗体反应的因素抗体反应的因素 反应物自身的因素：反应物自身的因素： 抗原：抗原： 可溶性可溶性 颗粒性颗粒性 细菌细菌 细胞细胞 抗体：抗体： 来源来源 浓度浓度 特异性特异性 亲和力亲和力 反应环境条件：反应环境条件： 电解质电解质 酸碱度酸碱度 温度温度 原材料原材料-决定性决定性 抗原抗原 类型：天然（自然生成

3、，未经修饰）类型：天然（自然生成，未经修饰） 变性（或在其它方面改变）变性（或在其它方面改变） 合成（用片段和甚至是单独的表位）合成（用片段和甚至是单独的表位） 纯度：用于纯化的方法应尽可能的精密。纯度：用于纯化的方法应尽可能的精密。 为了允许较小组分的检测，应该有足够的量为了允许较小组分的检测，应该有足够的量 亚型：全面性亚型：全面性 突变：抗原性改变突变：抗原性改变 影响因素影响因素-原材料原材料 抗体抗体 类型：单克隆、混合单克隆、多克隆或单克隆类型：单克隆、混合单克隆、多克隆或单克隆-多克隆组合。多克隆组合。 非特异活性：可以来自非特异活性：可以来自“异常异常”人免疫球蛋白，人免疫球蛋

4、白，包括风湿因子和异嗜性抗体（抗包括风湿因子和异嗜性抗体（抗-反刍类、抗反刍类、抗-鸟类或抗鸟类或抗-鼠类）。鼠类）。 效价：效价： 最佳反应的工作稀释度。推荐的稀释度最佳反应的工作稀释度。推荐的稀释度应该只作为起始点被接受。应该只作为起始点被接受。 内源性干扰因素内源性干扰因素类风湿因子、补体、异嗜性抗体、类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体、溶菌酶、治疗性抗体、自身抗体、溶菌酶、磷脂、药物小分子、总蛋白浓度等。磷脂、药物小分子、总蛋白浓度等。类风湿因子（类风湿因子（RF）干扰）干扰 RF一般为一般为IgM型，亦有型，亦有IgG和和IgA型。型。 RF具有与变性具有与变性IgG

5、产生非特异结合的产生非特异结合的特点。特点。 在捕获法在捕获法IgM型特异抗体的测定中表型特异抗体的测定中表现最为明显，因为此时固相包被的抗现最为明显，因为此时固相包被的抗体为抗人体为抗人 链抗体，链抗体， IgM型型RFRF的存在的存在可使其大量结合于固相。可使其大量结合于固相。类风湿因子干扰的排除类风湿因子干扰的排除 稀释标本稀释标本 改变标记抗体改变标记抗体 用变性用变性IgG预先封闭标本中预先封闭标本中RF 测抗原测抗原, ,可加入还原剂如可加入还原剂如2- -巯基乙醇巯基乙醇去除去除RF 使用特异的鸡抗体使用特异的鸡抗体IgY作为标记或固作为标记或固相抗体相抗体补体干扰补体干扰 固相

6、抗体和标记二抗的抗体分子可发生固相抗体和标记二抗的抗体分子可发生变构，从而其变构，从而其Fc段的补体段的补体C1q结合位点结合位点被暴露出来，这样被暴露出来，这样C1q就成为一个中介就成为一个中介物将二者交联起来，从而出现假阳性结物将二者交联起来，从而出现假阳性结果。果。 固相抗体也会因为活化补体的结合，封固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体的抗原表位结合能力，而引起假闭抗体的抗原表位结合能力，而引起假阴性结果或结果偏低。阴性结果或结果偏低。 补体干扰的排除补体干扰的排除 56 30min加热可使标本中补体加热可使标本中补体C1q灭活灭活使用特异的鸡抗体使用特异的鸡抗体IgY作为标记或作为

7、标记或固相抗体固相抗体自身抗体干扰自身抗体干扰自身抗体如抗甲状腺球蛋白、抗自身抗体如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等，能与其相应靶抗原结胰岛素等，能与其相应靶抗原结合形成复合物，在免疫测定方法合形成复合物，在免疫测定方法中可干扰相应抗原抗体的测定。中可干扰相应抗原抗体的测定。为避免以上情况出现，可在测定为避免以上情况出现，可在测定前用理化方法将其解离。前用理化方法将其解离。 影响因素-反应模式 双抗体（原）夹心法双抗体（原）夹心法 间接法间接法 竞争法竞争法 竞争中和法竞争中和法 捕获法捕获法 一步法的增强试剂聚乙二醇，用来一步法的增强试剂聚乙二醇，用来增强抗原增强抗原-抗体复合物的生成，加速抗体复

8、合物的生成，加速非特异性绑定和反应时间，但可以非特异性绑定和反应时间，但可以引起非免疫化学沉淀，降低试验的引起非免疫化学沉淀，降低试验的敏感性和特异性。敏感性和特异性。 液液相技术液液相技术 固液相技术固液相技术二步法二步法影响因素-信号放大系统 显色剂：显色剂：OPD，TMB 荧光：荧光：4-MUP 时间分辨：稀土元素时间分辨：稀土元素 化学发光：鲁米诺，吖啶酯类，化学发光：鲁米诺，吖啶酯类，AMPPD 电化学发光：三甲基吡啶钌电化学发光：三甲基吡啶钌外源性干扰因素外源性干扰因素溶血、细菌污染、标本贮存时间过溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全、反复冻融。长、凝固不全、反复冻融。标本溶

9、血标本溶血注意避免出现严重溶血。血红蛋白类似过氧化物的活性，使反应显色。标本被细菌污染标本被细菌污染 细菌的生长，其所分泌的一些酶可能细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用。会对抗原抗体等蛋白产生分解作用。 细菌的内源性酶如大肠杆菌的细菌的内源性酶如大肠杆菌的-半乳半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。定方法产生非特异性干扰。 标本贮存时间过长标本贮存时间过长 标本在标本在28下保存时间过长，下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法免疫测定可聚合成多聚体，在间接法免疫测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性。中会导

10、致本底过深、甚至造成假阳性。 血清标本如是以无菌操作分离，则可血清标本如是以无菌操作分离，则可以在以在28下保存一周，如为有菌操下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在保存，应在70以下。以下。 标本凝固不全标本凝固不全 血液采集后，离心分离血清没有完全凝固，血液采集后，离心分离血清没有完全凝固，离出的离出的“血清血清”并非为完全的血清，其中并非为完全的血清，其中仍残留部分纤维蛋白原，易造成假阳性结仍残留部分纤维蛋白原，易造成假阳性结果。果。 血液标本采集后，应使其充分凝固后再分血液标本采集后，应使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带

11、分离胶的采血离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。管或于采血管中加入适当的促凝剂。冰冻保存标本避免反复冻融冰冻保存标本避免反复冻融反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。几个统计学概念 正态分布正态分布(Gaussian distribution) 当一质控物用同一方法在不同的时间当一质控物用同一方法在不同的时间重复多次测定，且测定数据足够多时，重复多次测定，且测定数据足够多时，如以横轴表示测定值，纵轴表示在大如以横轴表示测定值，纵轴表示在大量测定中相应测定值的个数，则可得量测定中相应测定值的个数，则可得到一个两头低，中间

12、高，中为所有测到一个两头低，中间高，中为所有测定值的均值，左右对称的定值的均值，左右对称的“钟形钟形”曲曲线，亦即正态分布，又称高斯分布。线，亦即正态分布，又称高斯分布。 正态分布的基本统计学含义可用均数（X）、标准差（s）和概率来说明。重复性条件重复性条件是指在短的间隔时间内，在同一实是指在短的间隔时间内，在同一实验室对相同的测定项目使用同一方验室对相同的测定项目使用同一方法和同一仪器设备，由相同的操作法和同一仪器设备，由相同的操作者获得独立的测定结果的条件。者获得独立的测定结果的条件。 诊断敏感性（诊断敏感性（sensitivity of diagnosis） 是指将实际患病者正确地判断为

13、阳性（真阳性）的百分率。 阳性预测值（阳性预测值（positive predictive value, PPV） 是指特定试验方法测定得到的阳性结果中真阳性的比率阳性结果中真阳性的比率 诊断特异性（诊断特异性（specificity of diagnosis） 是指将实际无病者正确地判断为阴性（真阴性）的百分率。 阴性预示值阴性预示值(negative predictive value, NPV) 是指特定试验方法测定得到的阴性结果中真阴性的比率。阴性结果中真阴性的比率。诊断效率诊断效率（efficiency of diagnosis）是指能准确区分患者和非患者的能力。理想测定方法的诊断效率应

14、为100%。临床免疫检测类型临床免疫检测类型 定量分析：定量分析： 确定被分析物的含量。确定被分析物的含量。 产生一个与待测分析物的浓度产生一个与待测分析物的浓度相关的光谱信号，如果有已知浓度相关的光谱信号，如果有已知浓度的分析物制剂做校准，分析物的实的分析物制剂做校准，分析物的实际浓度就可以被确定。际浓度就可以被确定。定性分析定性分析 只关注分析物的有或无，而不关心有多少只关注分析物的有或无，而不关心有多少（定量）。（定量）。 又分为用肉眼和经验判断结果的又分为用肉眼和经验判断结果的纯定性试纯定性试验验和用读数仪根据和用读数仪根据CUT OFF 值或域值判定值或域值判定结果的结果的量值化定性

15、试验量值化定性试验。阳性结果只说明。阳性结果只说明分析信号超过了分析阈值（检测限）或分析信号超过了分析阈值（检测限）或cut-off值（值（cut-off值的设定给出了简要的敏感值的设定给出了简要的敏感性和特异性组合）。一般针对感染原和来性和特异性组合）。一般针对感染原和来自天然感染或免疫接种的相关抗体的相关自天然感染或免疫接种的相关抗体的相关检测。检测。 定性免疫检验方法较多，主要有沉淀定性免疫检验方法较多，主要有沉淀试验、凝集试验、荧光免疫试验、酶试验、凝集试验、荧光免疫试验、酶免疫试验和金标法。免疫试验和金标法。 其中金标法虽然是灵敏、特异、快速、其中金标法虽然是灵敏、特异、快速、简便、

16、准确率较高的体外诊断方法。简便、准确率较高的体外诊断方法。但是仍存在不足之处，易出现假阳性但是仍存在不足之处，易出现假阳性和假阴性，尤其是国产的金标试剂，和假阴性，尤其是国产的金标试剂，所以建议采用所以建议采用ELISAELISA法。法。定性免疫检测的用途定性免疫检测的用途 筛选试验筛选试验 用来检测全体人群或人群亚群一个特征的出现用来检测全体人群或人群亚群一个特征的出现（如感染原或相关抗体的出现）。（如感染原或相关抗体的出现）。 一般要求趋向二个极端：一般要求趋向二个极端： 要么有高的临床敏感性（即超过要么有高的临床敏感性（即超过95%的临床检的临床检出率），检测结果保证阴性筛选结果具有高可

17、能出率），检测结果保证阴性筛选结果具有高可能性的没有这些特征，而阳性结果可能需要做进一性的没有这些特征，而阳性结果可能需要做进一步的确证试验；血站系统的传染病筛查属于此类。步的确证试验；血站系统的传染病筛查属于此类。 要么有高的特异性，检测结果保证阳性筛选结要么有高的特异性，检测结果保证阳性筛选结果具有高可能性的具有这些特征。果具有高可能性的具有这些特征。 诊断试验诊断试验 用来评价具有可疑给予特征（如一种感染用来评价具有可疑给予特征（如一种感染 的特殊类型）的人。的特殊类型）的人。 敏感性和特异性应该处于相对平衡状态。敏感性和特异性应该处于相对平衡状态。如果此特征对治疗或预后考虑很重要，那如

18、果此特征对治疗或预后考虑很重要，那么敏感性要尽可能的高；么敏感性要尽可能的高； 而且后续已有准确的确证试验，可以不需而且后续已有准确的确证试验，可以不需要高的特异性。要高的特异性。 感染性疾病的大多数临床试验是用于诊断。感染性疾病的大多数临床试验是用于诊断。 确证试验确证试验 获得筛选或诊断试验阳性结果后，增加的试验获得筛选或诊断试验阳性结果后，增加的试验用于证明和确认此人前面的阳性结果。在这种情用于证明和确认此人前面的阳性结果。在这种情况下，主要考虑的性能常常是特异性和阳性预测况下，主要考虑的性能常常是特异性和阳性预测值，而不是敏感性和阴性预测值；特异性应该超值，而不是敏感性和阴性预测值；特

19、异性应该超过过98到到99%。 确证试验可以是非免疫化学的（如，培养或脱氧确证试验可以是非免疫化学的（如，培养或脱氧核糖核酸研究）或免疫化学的（包括免疫印迹和核糖核酸研究）或免疫化学的（包括免疫印迹和抗原或抗体中和试验）。抗原或抗体中和试验）。 如果筛选和诊断试验已具有高的特异性和阳性预如果筛选和诊断试验已具有高的特异性和阳性预测值，则不需要确证试验。测值，则不需要确证试验。定性免疫检验质量控制定性免疫检验质量控制 已知的已知的弱阳性质控弱阳性质控: :每次测定都应至少每次测定都应至少带一个已知的弱阳性对照，从而有助带一个已知的弱阳性对照，从而有助于判断临床标本的检测结果是否有效。于判断临床标

20、本的检测结果是否有效。 阴性质控阴性质控: :必需必需 每次测定都必须设空白对照、阴性对每次测定都必须设空白对照、阴性对照、阳性对照和弱阳性对照。照、阳性对照和弱阳性对照。 CUT OFF 值的选择值的选择 一个试验一般不可能有完全的（一个试验一般不可能有完全的（100%）敏感性、）敏感性、特异性或预测值。特异性或预测值。Cut off值的选择和来自一个值的选择和来自一个检测的结果报告，应该考虑以下这些性能指标哪检测的结果报告，应该考虑以下这些性能指标哪个更重要：个更重要： （1）当疾病是严重并且可治疗的，应该不能漏）当疾病是严重并且可治疗的，应该不能漏检；假阳性结果不会导致严重的精神或经济创

21、伤；检；假阳性结果不会导致严重的精神或经济创伤；不合适的治疗仅有轻微的后果需要不合适的治疗仅有轻微的后果需要高敏感性高敏感性。 （2）当疾病是严重的但是不能治疗；没有疾病）当疾病是严重的但是不能治疗；没有疾病时具有心理或公众健康价值；假阳性结果可能引时具有心理或公众健康价值；假阳性结果可能引起严重的精神或经济上的创伤（如起严重的精神或经济上的创伤（如HIV抗体的确抗体的确证试验）需要证试验）需要高特异性高特异性。 （3）当不合适的治疗可能导致严重后果，需要）当不合适的治疗可能导致严重后果，需要高预测值高预测值。 （4）当疾病严重但是可治疗，并且假阴性或假）当疾病严重但是可治疗，并且假阴性或假阳

22、性结果同样严重（如引起脑膜炎细菌抗原的分阳性结果同样严重（如引起脑膜炎细菌抗原的分析）需要析）需要高符合率高符合率。 在确定这些因素的合适平衡点时，厂商或其它检在确定这些因素的合适平衡点时，厂商或其它检测的研发者应该用来自三种人群的样本评估检测测的研发者应该用来自三种人群的样本评估检测的性能：感染疾病的人，没有疾病的健康人和非的性能：感染疾病的人，没有疾病的健康人和非讨论疾病患者的病人。厂商应该标明推荐的讨论疾病患者的病人。厂商应该标明推荐的cut-off值是怎么定义的以及在什么样的人群应用。值是怎么定义的以及在什么样的人群应用。 理想状态，实验室应该在自己的服务人群理想状态，实验室应该在自己

23、的服务人群中确定区间和中确定区间和cut-off值。值。纯定性试验的质控要求纯定性试验的质控要求 临床免疫纯定性试验大都属于临床免疫纯定性试验大都属于CLIA88豁免豁免的技术（的技术（waived testing sites），包括免），包括免疫沉淀、凝集试验、标记免疫的金标试纸疫沉淀、凝集试验、标记免疫的金标试纸和斑点渗滤、免疫荧光印迹法等等。和斑点渗滤、免疫荧光印迹法等等。 对于对于FDA等批准家庭使用的技术，只要求等批准家庭使用的技术，只要求检测装置有内对照，检测结果满足说明书检测装置有内对照，检测结果满足说明书规定即可；规定即可； 对于需要经验来判定结果的技术仍需在实对于需要经验来判

24、定结果的技术仍需在实验室进行，均有质控的要求，但国际上无验室进行，均有质控的要求，但国际上无具体操作的规定和资料。具体操作的规定和资料。 根据显色或发光直接判定阴阳性的技术，如金标根据显色或发光直接判定阴阳性的技术，如金标试纸，美国试纸，美国CDC在在“CLIA88豁免的豁免的HIV抗体快速抗体快速检测的质量保证指南检测的质量保证指南 ”中要求：除检中要求：除检测装置的内对照外，每检测日或分析批，应使用测装置的内对照外，每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性外对照作为质控。无判定标准，一弱阳性和阴性外对照作为质控。无判定标准，一般理解为阴、阳性质控的检测结果分别为阴性和般理解为阴、阳性质控的检测

25、结果分别为阴性和阳性即表明在控，相反则为失控。阳性即表明在控，相反则为失控。 根据滴度或稀释度判定阴阳性的技术，如凝集试根据滴度或稀释度判定阴阳性的技术，如凝集试验，使用弱阳性和阴性外对照质控，阳性质控结验，使用弱阳性和阴性外对照质控，阳性质控结果在均值上下一个滴度或稀释度以及阴性质控结果在均值上下一个滴度或稀释度以及阴性质控结果为阴性即为在控，否则视为失控。果为阴性即为在控，否则视为失控。失控原因分析失控原因分析 失控信号的出现受多种因素的影响，包括质控物、试失控信号的出现受多种因素的影响，包括质控物、试剂、仪器、操作以及质控规则本身等等。一旦出现失剂、仪器、操作以及质控规则本身等等。一旦出

26、现失控信号，实验室应该仔细地分析原因、查找根源，不控信号，实验室应该仔细地分析原因、查找根源，不要拘泥于推荐的程式化的步骤进行，而应该根据误差要拘泥于推荐的程式化的步骤进行，而应该根据误差的来源和当批工作的实际开展排查工作。的来源和当批工作的实际开展排查工作。 偶然误差造成的失控，首先考虑有无工作条件的变偶然误差造成的失控，首先考虑有无工作条件的变化，如新的质控物、新的试剂、仪器故障、人员变动、化，如新的质控物、新的试剂、仪器故障、人员变动、操作程序变化等等；其次查找仪器校准、环境因素操作程序变化等等；其次查找仪器校准、环境因素（水质、温湿度）等原因。（水质、温湿度）等原因。 系统误差造成的失

27、控，首先考虑质控物或试剂原因，系统误差造成的失控，首先考虑质控物或试剂原因，其次查找仪器校准问题，再次分析操作程序、环境因其次查找仪器校准问题，再次分析操作程序、环境因素等原因。素等原因。失控处理失控处理 实验室在确定失控原因后，应有针对性地实验室在确定失控原因后，应有针对性地采取纠正措施；对重复或系统性出现的失采取纠正措施；对重复或系统性出现的失控原因需引入预防措施，必要时还应修改控原因需引入预防措施，必要时还应修改程序文件或作业指导书。程序文件或作业指导书。 对于失控批的患者标本应根据不同情况采对于失控批的患者标本应根据不同情况采取相应的重测方案：阳性失控，重测所有取相应的重测方案：阳性失

28、控，重测所有阴性标本；阴性失控，重测所有阳性标本。阴性标本；阴性失控，重测所有阳性标本。判读实例（判读实例（1） 梅毒试验的实验室检查梅毒试验的实验室检查TP Treponema palidum subsp.palidum 苍白密螺旋体苍白亚种苍白密螺旋体苍白亚种 梅毒梅毒(syphilis)是一种疾病，我们只是做相是一种疾病，我们只是做相关的实验室检查，对结果的解释必须结合关的实验室检查，对结果的解释必须结合病史和患者的临床情况。病史和患者的临床情况。现实意义现实意义 梅毒感染率逐年增加，梅毒感染率逐年增加，2005年在所有甲乙类传染年在所有甲乙类传染病仅次于肺结核、乙型肝炎、痢疾、淋病居第

29、五病仅次于肺结核、乙型肝炎、痢疾、淋病居第五位。位。 和艾滋病、淋病、肺结核等呈复合感染。和艾滋病、淋病、肺结核等呈复合感染。 梅毒感染率逐年增加，不容忽视假阳性率也很高梅毒感染率逐年增加，不容忽视假阳性率也很高 阳性率：大样本输血员阳性率：大样本输血员 0.58% 低危人群（病员）低危人群（病员） 1.52%1.61% 其中其中 50岁者占岁者占 53.3%62.3% 阳性率阳性率3.02%3.15% 我们怎么应答我们怎么应答 ： 供血与受血者，手术，创伤性供血与受血者，手术，创伤性检查，院内感染控制检查，院内感染控制 。（婚检）必查项目。（婚检）必查项目。实验室诊断实验室诊断（病原体（病原

30、体1） DFM-暗视野显微镜找暗视野显微镜找Tp：病灶组织液、：病灶组织液、肿大淋巴结穿刺液。肿大淋巴结穿刺液。Tp呈白色发光，运动快速，开塞钻样旋转。呈白色发光，运动快速，开塞钻样旋转。 单次阳性率单次阳性率50%，多灶取样，连续检查。，多灶取样，连续检查。 注意安全防护。注意安全防护。实验室诊断实验室诊断（病原体（病原体2） DFAT-直接荧光抗体检查直接荧光抗体检查Tp：病灶组织液、肿大淋巴结穿刺液。涂片、干燥、病灶组织液、肿大淋巴结穿刺液。涂片、干燥、丙酮固定。丙酮固定。 FITC抗抗 Tp单抗单抗 染色，荧光显微镜检查。染色，荧光显微镜检查。 注意安全保护。注意安全保护。实验室诊断实

31、验室诊断（病原体（病原体3） PCR-核酸检查核酸检查： 敏感性差异大，不能区分敏感性差异大，不能区分T.pallidum亚种。亚种。 已建立一些新方法（如已建立一些新方法（如MGB-TaqMan探针荧光定量探针荧光定量PCR），需广泛验证。），需广泛验证。实验室诊断实验室诊断（血清学）（血清学） 非密螺旋体抗体试验（非密螺旋体抗体试验（nontreponemal antibody tests ,NTrAT）: 测抗类脂抗体（反应素测抗类脂抗体（反应素regain）。）。 其其靶抗原靶抗原是宿主细胞被螺旋体感染后释放的类脂是宿主细胞被螺旋体感染后释放的类脂（lipoidal）物质、螺旋体释放的

32、自身脂蛋白样物质）物质、螺旋体释放的自身脂蛋白样物质（lipoprotein-like material）和心磷脂（）和心磷脂（cardiolipin） 密螺旋体抗体试验（密螺旋体抗体试验（treponemal antibody tests ,TrAT） ：测抗：测抗Tp特异抗体。特异抗体。 其其 靶抗原靶抗原是是Tp的的Nichols株的纯化处理物。株的纯化处理物。实验室诊断（实验室诊断（NTrAT） NTrAT： 1）VDRL（ venereal disease research laboratory）2）RPR（rapid plasma reagin）3）USR（unheated ser

33、um reagin）4）TRUST（toluidine red unheated-serum test） NTrAT：抗原为心磷脂、胆固醇、卵磷脂：抗原为心磷脂、胆固醇、卵磷脂按适当比例配制按适当比例配制 的乙醇溶液的乙醇溶液 1）VDRL：待测血清加热灭活，显微镜观：待测血清加热灭活，显微镜观察。察。 2）USR：血清不加热显微镜观察。：血清不加热显微镜观察。 3）RPR：抗原染成黑色，血清不加热，：抗原染成黑色，血清不加热，肉眼观察。肉眼观察。 4）TRUST：抗原染成红色，血清不加热，：抗原染成红色，血清不加热，肉眼观察。肉眼观察。实验室诊断实验室诊断（TrAT）TPHA （ T.pal

34、lidum hemagglutination assay）TPPA（T.pllidum particle agglutination assay）金标记免疫层析金标记免疫层析ELISA-TPFTA-ABS（fluorescent Tp-antibody absorption）FTA-ABS-DS（FTA-ABS double staining）免疫印迹试验免疫印迹试验 TrAT：抗原为梅毒螺旋体：抗原为梅毒螺旋体Nichols株特异抗株特异抗原。原。（1）TPHA：Nichols株超声或株超声或SDS提取抗原，包被提取抗原，包被甲醛、鞣酸处理的甲醛、鞣酸处理的SRBC,遇血清中抗体血凝。血清遇

35、血清中抗体血凝。血清用用Reiter株，牛、羊株，牛、羊RBC，正常兔血清和兔睾丸提，正常兔血清和兔睾丸提取物吸收。取物吸收。（2）TPPA：染成红色明胶颗粒包被抗原。试剂盒中：染成红色明胶颗粒包被抗原。试剂盒中未配吸收剂。未配吸收剂。（3）ELISA：纯化或重组：纯化或重组T.pallidum抗原抗原（15000、17000、42000、47000）包被，）包被，间接法或双抗原夹心法。未配吸收剂。间接法或双抗原夹心法。未配吸收剂。 （4）FTA-ABS: Nichols株制片，丙酮固定，待测血株制片，丙酮固定，待测血清用含清用含Reiter株吸收剂吸收。株吸收剂吸收。FITC-抗人抗人IgG

36、（ IgM）示踪。示踪。（5） FTA-ABS-DS：同上，第一次荧光染色用四甲：同上，第一次荧光染色用四甲基异硫氰酸罗达明标记的抗人基异硫氰酸罗达明标记的抗人IgG ；第二次荧光染；第二次荧光染色用色用FITC标记抗标记抗Tp抗体。抗体。（6）免疫印迹（）免疫印迹（WB）：）： Nichols株纯化抗原株纯化抗原SDS-PAGE，电转印至，电转印至NC膜或膜或PVDF膜，待测血清不吸膜，待测血清不吸收，与膜上抗原反应，再与酶标抗人收，与膜上抗原反应，再与酶标抗人IgG反应，显反应，显色。色。（7）金标记免疫层析：膜条上包被纯化的）金标记免疫层析：膜条上包被纯化的Tp抗原，抗原，待测血清不吸收

37、，与膜端金标抗人待测血清不吸收，与膜端金标抗人IgG结合后层析结合后层析至测试区与至测试区与Tp抗原结合，出现呈色条带。抗原结合，出现呈色条带。梅毒血清学试验敏感性与特异性梅毒血清学试验敏感性与特异性试验 敏感性特异性 一期 二期 潜伏 三期VDRL 78（7487） 100 95（88100） 71（3794） 98（9699）RPR 86（77100） 100 98（95100） 73（3696） 98（9399）USR 80（7288） 100 95（88100） 99TRUST 85（7786） 100 98（95100） 99（9899）NTrAT试验 敏感性特异性一期 二期 潜伏

38、三期FTA-ABS 84（70100 ） 100 100 96 97（94100）FTA-ABS-DS 80（6990） 100 100 98（97100）TPHA 76（6990） 100 97（97100） 94 99（98100）TPPA 80（86100） 100 100 96（95100）ELISA-IgG 97（97100） 99（98100）注：无分期资料TrAT梅毒实验室检查难点梅毒实验室检查难点 本属包括本属包括4种对人致病和至少种对人致病和至少6种对人不致种对人不致病的密螺旋体。病的密螺旋体。Tp和其它该属螺旋体在形和其它该属螺旋体在形态学上无法区别；核酸杂交试验态学上无法

39、区别；核酸杂交试验DNA同源同源性性95%；已知的基因序列高度一致性；已知的基因序列高度一致性；蛋白质结构及与某些单克隆抗体反应几乎蛋白质结构及与某些单克隆抗体反应几乎相同。相同。 因此，只能依靠对人和实验动物的致病谱因此，只能依靠对人和实验动物的致病谱来加以区别。来加以区别。螺旋体的分类及致病性螺旋体种类螺旋体的分类及致病性螺旋体种类 属属 种种 疾疾 病病 传播方式或媒介传播方式或媒介 疏螺旋体（疏螺旋体（Borrelia） 伯氏疏螺旋体伯氏疏螺旋体 莱姆病莱姆病 硬蜱硬蜱 回归热螺旋体回归热螺旋体 流行性回归热流行性回归热 体虱体虱 赫姆疏螺旋体赫姆疏螺旋体 地方性回归热地方性回归热 软

40、婢软婢 奋森疏螺旋体奋森疏螺旋体 多种口腔感染多种口腔感染 条件致病条件致病 短螺旋体（短螺旋体（Brachyspira） 脊螺旋体（脊螺旋体（Cristispira） 细丝体细丝体 （Leptonema） 钩端螺旋体（钩端螺旋体（Leptospira） 问号钩端螺旋体问号钩端螺旋体 钩端螺旋体病钩端螺旋体病 接触疫水接触疫水 双曲钩端螺旋体双曲钩端螺旋体 小蛇形螺旋体（小蛇形螺旋体（Serpulina） 螺旋体螺旋体 （Spirochaeta） 密螺旋体密螺旋体 （Treponema） 梅毒螺旋体梅毒螺旋体 梅毒梅毒 性传播性传播 雅司螺旋体雅司螺旋体 雅司病雅司病 皮肤损伤皮肤损伤 品他螺

41、旋体品他螺旋体 品他病品他病 皮肤损伤皮肤损伤 地方性螺旋体地方性螺旋体 地方性梅毒地方性梅毒 粘膜损伤粘膜损伤 梅毒螺旋体结构梅毒螺旋体结构（1）长）长620m,直径直径90180nm，有，有614个规则螺旋，两端尖直。个规则螺旋，两端尖直。（2）外膜：有三层，含蛋白质、类脂、）外膜：有三层，含蛋白质、类脂、糖，有糖，有抗抗 原性原性，对溶菌酶抵抗，对溶菌酶抵抗 ，对，对脂溶剂、脂溶剂、SDS敏感。敏感。（3）胞质微丝：有外鞘及内核心，含）胞质微丝：有外鞘及内核心，含大量蛋白质大量蛋白质（4）菌体：圆柱形，包括细胞壁、胞）菌体：圆柱形，包括细胞壁、胞质膜、胞质。质膜、胞质。（5）周质鞭毛：附

42、着于菌体两端）周质鞭毛：附着于菌体两端23条条或或46条。条。（6）基因组（）基因组（Nichols株株1.131106bp，1998年）年）（7）抗）抗 原：特异性耐热多糖抗原：特异性耐热多糖抗 原（多糖原（多糖-RNA），非特异性心磷脂、类脂抗），非特异性心磷脂、类脂抗 原，原，特异性不耐热蛋白质，包括特异性不耐热蛋白质，包括MW（15.5190.0103）的）的16种，其中种，其中15500、17000、42000、47000有特异有特异性。性。血清学试验假阳性原因（一）血清学试验假阳性原因（一） 其他的人类其他的人类-宿主相关螺旋体宿主相关螺旋体 （1）口腔螺旋体（齿龈间隙牙菌斑）参与

43、）口腔螺旋体（齿龈间隙牙菌斑）参与 齿龈炎、牙周病。齿龈炎、牙周病。 （2）皮肤相关螺旋体（外阴部皮脂腺分泌）皮肤相关螺旋体（外阴部皮脂腺分泌物）物） 。 （3）肠道螺旋体（结肠、直肠、粪便）参）肠道螺旋体（结肠、直肠、粪便）参与腹泻等肠病。与腹泻等肠病。 血清学试验假阳性原因（二）血清学试验假阳性原因（二） NTrAT TrAT 自身免疫病自身免疫病 + + 疟疟 疾疾 + - 免免 疫疫 接接 种种 + - 皮皮 肤肤 病病 + + 结结 核核 + - 麻麻 风风 + + 静脉注射毒品静脉注射毒品 + - 病病 毒毒 感感 染染 + - 心心 血血 管管 病病 + + NTrAT TrAT

44、热热 性性 病病 + +妊妊 娠娠 + -HIV 感感 染染 + -其他性传播病其他性传播病 + -老老 年年 人人 - +多多 次次 输输 血血 + -Lyme 病病 - +地方性密螺旋体病地方性密螺旋体病 + +技技 术术 误误 差差 + +原原 因因 不不 明明 + +梅毒实验室诊断注意事项梅毒实验室诊断注意事项 安全防护。安全防护。 血清学试验阳性只提示检出相应抗体。血清学试验阳性只提示检出相应抗体。 加强专业知识学习，结合临床病史、病加强专业知识学习，结合临床病史、病症综合分析。症综合分析。 改进技术，改进技术，TrAT要吸收处理。要吸收处理。吸收处理吸收处理 在进行在进行TrAT试

45、验时，待测血清都应先用非致病性试验时，待测血清都应先用非致病性密螺旋体的密螺旋体的Reiter株的提取物或超声处理材料和株的提取物或超声处理材料和Nichols株培养体兔睾丸提取物、兔血清等进行株培养体兔睾丸提取物、兔血清等进行吸收。吸收。 吸收目的：除去待测血清中可能存在的与其它非吸收目的：除去待测血清中可能存在的与其它非梅毒螺旋体抗原产生交叉反应的抗群、抗属或抗梅毒螺旋体抗原产生交叉反应的抗群、抗属或抗科的特异抗原或抗体。科的特异抗原或抗体。 TPHA试验还应用超声处理的绵羊和牛红细胞吸试验还应用超声处理的绵羊和牛红细胞吸收以吸除嗜异性抗体。收以吸除嗜异性抗体。 即使如此，试验的特异性仍只

46、能达即使如此，试验的特异性仍只能达99%左右。左右。梅毒的实验室诊断梅毒的实验室诊断梅毒的实验室诊断梅毒的实验室诊断（新图解）（新图解） 有不洁性史有不洁性史有病损者有病损者（下疳、皮疹、淋巴穿刺液）（下疳、皮疹、淋巴穿刺液）DFMDFATPCR阳性阳性确诊确诊治疗治疗阴性阴性无病损者无病损者（血清、血浆）（血清、血浆）NTrAT（筛选）（筛选）阳性阳性滴定滴定（评估疗效、再感染）（评估疗效、再感染）TrAT阴性阴性阳性阳性阴性阴性假阳性假阳性2周周后后复复检检继续阴性继续阴性排除排除判读实例（判读实例（2） HCV抗体的实验室检测报告抗体的实验室检测报告 对丙肝的认识时间不长（对丙肝的认识时

47、间不长（1989年），年），世界各地感染率相差很大，英国世界各地感染率相差很大，英国5/万，万，开罗却高达开罗却高达26%。全世界至少有。全世界至少有2亿感亿感染者，急性感染者中有染者，急性感染者中有20%-30%不通不通过治疗也能在过治疗也能在2-26周内，完全清除病周内，完全清除病毒，达到临床痊愈，不再复发。在血毒，达到临床痊愈，不再复发。在血透患者中，体内丙肝抗体水平可能很透患者中，体内丙肝抗体水平可能很低甚至无法检出，随着时间推移，也低甚至无法检出，随着时间推移，也可能存在反复。可能存在反复。 用化学发光法或酶联免疫法检测丙肝抗体，用化学发光法或酶联免疫法检测丙肝抗体，属于初筛试验。方

48、法本身存在一定的假阳属于初筛试验。方法本身存在一定的假阳性或假阴性，阳性结果中有性或假阴性，阳性结果中有2-3%不是真的不是真的感染丙肝；高危人群（如长期血透者）阴感染丙肝；高危人群（如长期血透者）阴性结果中有性结果中有3-5%却是真的感染了丙肝。在却是真的感染了丙肝。在疾病不同阶段这就要求临床需根据患者实疾病不同阶段这就要求临床需根据患者实际情况，持续跟踪检查，才能正确诊治病际情况，持续跟踪检查，才能正确诊治病人。而丙肝的确认试验是条带免疫印迹法，人。而丙肝的确认试验是条带免疫印迹法，由于试剂昂贵，约由于试剂昂贵，约2000元元/测试，并未应用测试，并未应用于临床实践。于临床实践。 HCV抗

49、体的出现不能确定是当前抗体的出现不能确定是当前感染还是既往感染。感染还是既往感染。 HCV抗体的确认和抗体的确认和NAT&ALT对对HCV感染的医疗评估、咨询和减感染的医疗评估、咨询和减少不必要的医疗花费与心理伤害有少不必要的医疗花费与心理伤害有着积极而深远的意义。着积极而深远的意义。HCV抗体不能常态确认的原因抗体不能常态确认的原因 未建立标准未建立标准 不了解筛查和确认实验的性能及结不了解筛查和确认实验的性能及结果的意义果的意义 确认实验成本非常之高确认实验成本非常之高HCV感染的实验室检测方法感染的实验室检测方法#筛查试验筛查试验 ELISA 测抗原测抗原 ，测抗体，测抗体 CL

50、IA GIA#确认试验确认试验 免疫印迹试剂（免疫印迹试剂（Chiron RIBA* HCV3.0） NAT初筛实验的报告初筛实验的报告 卫生部临床检验中心建议：卫生部临床检验中心建议： 除确认试剂用阴性和阳性表示外，其余都除确认试剂用阴性和阳性表示外，其余都用用有反应性有反应性或无反应性表示实验结果。或无反应性表示实验结果。 在做在做ELISA或或CLIA时，对有反应性结果的时，对有反应性结果的标本标本双孔双孔复试。任意一孔有反应性，则标复试。任意一孔有反应性，则标本被认为有重复反应性本被认为有重复反应性-筛查实验结果筛查实验结果被认为有反应性。被认为有反应性。 对对HCV抗体的测试应包括抗体筛查实抗体的测试应包括抗体筛查实验和对有重复反应性标本的更特异确验和对有重复反应性标本的更特异确认实验。认实验。 要根据筛查实验的要根据筛查实验的S/CO比值选择确认比值选择确认实验路径。实验路径。 不同人群有不同的不同人群有不同的S/CO判读标准。判读标准。 高危人群（吸毒、肝病、性病等）高危人群（吸毒、肝病、性病等） 其中低其中低S/CO比值占比值占2.44.9% 低危人群（无偿献血者、军人、医务低危人群（无偿献血者、军人、医务工作者）工作者） 其中低其中低S/CO比值占比值占21.533.5% 并且