chapter 3-2 蛋白质

1、v蛋白质是由一条或多条多肽蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide) 链以特殊方式结合而成的生物大分子。链以特殊方式结合而成的生物大分子。v通常是将分子量在通常是将分子量在6000以上的多肽称为以上的多肽称为蛋白质。蛋白质。v蛋白质分子量变化范围很大蛋白质分子量变化范围很大, 从大约从大约6000到到1000 000，甚至更大。，甚至更大。3.4.1 蛋白质的分类和性质蛋白质的分类和性质1.1.蛋白质的分类蛋白质的分类(1) (1) 依据蛋白质的组成依据蛋白质的组成(composition)(composition)分类分类v简单蛋白简单蛋白(simple protein):(simp

2、le protein):只含由只含由 - -氨氨基酸组成的肽链，不含其它成分。基酸组成的肽链，不含其它成分。v结合蛋白结合蛋白(conjugated protein):(conjugated protein):由简单由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成。蛋白与其它非蛋白成分结合而成。结合蛋白结合蛋白v色蛋白：色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。v糖蛋白：糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。膜中的糖蛋白等。v脂蛋白：脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成

3、。由简单蛋白与脂类结合而成。 如血如血清清 - -， - -脂蛋白等。脂蛋白等。v核蛋白：核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。核中的核糖核蛋白等。(2)(2)依据蛋白质的外形依据蛋白质的外形(shape)(shape)分类分类球状蛋白球状蛋白(globular proteins)(globular proteins): : 外形外形接近球形或椭圆形，溶解性好，能形成接近球形或椭圆形，溶解性好，能形成结晶。如：免疫球蛋白、血红蛋白等。结晶。如：免疫球蛋白、血红蛋白等。纤维状蛋白纤维状蛋白(fibrous proteins)(fibrous

4、proteins)：分子：分子类似纤维或细棒。又分为可溶性纤维蛋类似纤维或细棒。又分为可溶性纤维蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。如：白质和不溶性纤维状蛋白质。如： - -角角蛋白、丝心蛋白等。蛋白、丝心蛋白等。2.蛋白质的性质蛋白质的性质 具有多肽的一切性质。此外，蛋白质还具有多肽的一切性质。此外，蛋白质还具有一些特殊的性质：具有一些特殊的性质：1)1)蛋白质的两性解离和电泳现象蛋白质的两性解离和电泳现象蛋白质的性质蛋白质的性质v蛋白质的两性解离：蛋白质的两性解离：蛋白质与多肽一样，蛋白质与多肽一样，能够发生两性解离，也有等电点。在等电能够发生两性解离，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，

5、在电场中不点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。移动。v蛋白质电泳现象：蛋白质电泳现象：在在pHpH大于等电点溶液中，大于等电点溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在动；在pHpH小于等电点溶液中，蛋白质粒子小于等电点溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)(Electrophoresis)。蛋白质的性质蛋白质的性质（1 1）蛋白质的两性离解和电泳现象）蛋白质的两性离解和电泳现象v由于蛋白质的分子量很大，它在水中能由于蛋白质的分

6、子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。运动等。v由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。分子杂质除去。蛋白质的性质蛋白质的性质v蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。大小、所带的电荷和水化作用有关。v改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质。性质。v在适当的条件下，蛋白

7、质能够从溶液中在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。沉淀出来。蛋白质的性质蛋白质的性质v在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pHpH或电或电荷状况荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。离。v在沉淀过程中，结构和性质都没有发生在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。沉淀。v可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂

8、沉淀法等剂沉淀法等。蛋白质的性质蛋白质的性质v在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。沉淀不可能再重新溶解于水。v由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以性质的变化，所以又称为变性沉淀又称为变性沉淀。v如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。淀。蛋白质的性质蛋白质的性质v抗体和抗原蛋白通过

9、相互识别和结抗体和抗原蛋白通过相互识别和结合而发生的沉淀现象。是生物体免合而发生的沉淀现象。是生物体免疫功能的基础。疫功能的基础。抗体抗体-抗原沉淀：抗原沉淀：蛋白质的性质蛋白质的性质v某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。并导致其生理活性丧失。这种现象称为这种现象称为蛋白质的变性蛋白质的变性( (denaturation)。蛋白质的性质蛋白质的性质v变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性

10、其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。搅拌以及强酸和强碱等。蛋白质的性质蛋白质的性质v大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。酸、酪氨酸和色氨酸。v这三种氨基酸的在这三种氨基酸的在280nm 280nm 附近有最大吸附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在收。因此，大多数蛋白质在280nm 280nm 附近附近显示强的吸收。显示强的吸收。v利用这个性质，可以对

11、蛋白质进行定性利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。鉴定。蛋白质的性质蛋白质的性质3.4.2 蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化u所有的分离和纯化过程都必须在温和的所有的分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行条件下进行。1. 蛋白质的分离蛋白质的分离 粗品的制备过程：粗品的制备过程：机械破碎机械破碎溶剂抽提溶剂抽提离心离心盐析、等电点沉淀等盐析、等电点沉淀等粗制品粗制品3. 蛋白质分离纯化的基本方法蛋白质分离纯化的基本方法（1）根据分子大小不同的分离方法）根据分子大小不同的分离方法 透析法：透析法：利用蛋白质分子不能透过半透利用蛋白质分子不能透过半透膜，使它与其它小分子化合物，如无机膜，使

12、它与其它小分子化合物，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等分离。面活性剂等分离。 半透膜：玻璃纸或高分子合成材料。半透膜：玻璃纸或高分子合成材料。蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化2. 蛋白质的纯化蛋白质的纯化纯化原理纯化原理：根据蛋白质具有不同的：根据蛋白质具有不同的分子大分子大小、溶解度、电荷和吸附性质小、溶解度、电荷和吸附性质等。等。 离心沉降法离心沉降法-最常用的蛋白质分离方法最常用的蛋白质分离方法原理：原理：蛋白质溶液在离心机的离心管内进蛋白质溶液在离心机的离心管内进行离心时，在强离心力作用下，蛋白质分行离心时，在强离心力作用下，蛋白

13、质分子会发生沉降，并与溶液分离。沉降速率子会发生沉降，并与溶液分离。沉降速率取决于离心机转子的速度以及蛋白质颗粒取决于离心机转子的速度以及蛋白质颗粒的大小、密度、分子的形状、溶液的密度的大小、密度、分子的形状、溶液的密度和性质等。通过控制不同的离心速度，达和性质等。通过控制不同的离心速度，达到分离蛋白质的目的。到分离蛋白质的目的。方法：方法：先加入适当先加入适当 的沉淀剂（如中性饱和的沉淀剂（如中性饱和硫酸铵溶液、酸、碱等），将蛋白质溶液硫酸铵溶液、酸、碱等），将蛋白质溶液转变成悬浮液，在不同的离心速度下，使转变成悬浮液，在不同的离心速度下，使不同大小和密度的蛋白质颗粒分离。不同大小和密度的蛋

14、白质颗粒分离。蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化 凝胶色谱法凝胶色谱法( (Gel Gel filtration filtration column)column)介质：交联葡萄糖、介质：交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶颗粒。胺形成的凝胶颗粒。凝胶颗粒的内部是凝胶颗粒的内部是多孔的网状结构。多孔的网状结构。方法：方法： 等电点沉淀法等电点沉淀法v蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。v当蛋白质混合溶液的当蛋白质混合溶液的pHpH被调到某一成分等

15、电点时，被调到某一成分等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉淀出来。则该蛋白质大部或全部将沉淀出来。 盐析法盐析法v蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀。常用的破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀。常用的盐为硫酸铵。盐为硫酸铵。v不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。同的蛋白质加以分离。蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化(2)(2)利用溶解度不同的分离方法利用溶解度不同

16、的分离方法等电点沉淀法、盐析法、等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 有机溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法：v在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。蛋白质的溶解度降低而沉淀。常用的有常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。v为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高，而且需要在低有机溶剂浓度不能太高，而且需要在低温条件下进行。

17、温条件下进行。蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化离子交换色谱法、电泳法离子交换色谱法、电泳法蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化离子交换离子交换色谱法色谱法 常用的是阳常用的是阳离子交换树离子交换树脂（如羧甲脂（如羧甲基纤维素）。基纤维素）。Cation-exchangecolumn电泳法电泳法v在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动。移动的速率：相反的电极移动。移动的速率：fEqv E:电场强度电场强度q: 所带的净电荷所带的净电荷f f : 摩擦系数取决于蛋摩擦系数取决于蛋白质颗粒的大小白质颗粒的大小使使Eq值接近一个常数，则蛋白质

18、颗粒在电场值接近一个常数，则蛋白质颗粒在电场中移动的速率就只与摩擦系数即分子大小有中移动的速率就只与摩擦系数即分子大小有关。关。蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化vSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法是目前广泛应用聚丙烯酰胺凝胶电泳法是目前广泛应用的一种方法。的一种方法。vSDS（十二烷基磺酸钠）：一种阴离子型表（十二烷基磺酸钠）：一种阴离子型表面活性剂，能够与蛋白质多肽链中的氨基酸面活性剂，能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约残基按大约1:2 比例结合。这样，每一个蛋白比例结合。这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的

19、电荷则可以的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。因此，忽略。因此，Eq值接近一个常数。值接近一个常数。蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化方法：方法：蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化(4) 根据吸附性质不同的分离方法根据吸附性质不同的分离方法吸附色谱法：吸附色谱法：某些物质对不同种类的蛋白某些物质对不同种类的蛋白质具不同程度的吸附能力。利用这种吸附质具不同程度的吸附能力。利用这种吸附能力的差异，可以将蛋白质进行分离。在能力的差异，可以将蛋白质进行分离。在蛋白质提纯中应用最广的吸附剂是结晶磷蛋白质提纯中应用最广的吸附剂是结晶磷酸钙。洗脱液为不同浓度和

20、不同酸钙。洗脱液为不同浓度和不同 pH的磷的磷酸缓冲溶液。酸缓冲溶液。亲和色谱法（亲和色谱法（Affinity chromatography）是一种高效分离纯是一种高效分离纯化蛋白质的方法化蛋白质的方法蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化v原理：原理：将某种配基与将某种配基与载体共价连接。当含载体共价连接。当含有待纯化的蛋白质溶有待纯化的蛋白质溶液通过色谱柱时，该液通过色谱柱时，该蛋白质即与配基发生蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附特异性结合而被吸附在色谱柱上，而其它在色谱柱上，而其它蛋白质则流出柱外。蛋白质则流出柱外。被结合的蛋白质，可被结合的蛋白质，可以用适当的洗脱液洗以用适当的洗脱液洗

21、脱。脱。v常用配基：常用配基：抗体、抗抗体、抗原、激素、或受体蛋原、激素、或受体蛋白等。白等。色谱柱载体色谱柱载体为为琼脂糖凝胶等。琼脂糖凝胶等。蛋白质是由一条或多条多肽链以特殊方式组蛋白质是由一条或多条多肽链以特殊方式组合而成合而成, 结构层次结构层次:u一级结构：氨基酸顺序一级结构：氨基酸顺序u二级结构：主干的空间走向二级结构：主干的空间走向u三级结构：肽链在空间的折叠和卷曲三级结构：肽链在空间的折叠和卷曲形成的形状，所有原子在空间的排布。形成的形状，所有原子在空间的排布。u四级结构：多条肽链之间的作用。四级结构：多条肽链之间的作用。1. 蛋白质的一级结构及蛋白质的一级结构及其生物学意义其

22、生物学意义 一级结构包括：组成蛋一级结构包括：组成蛋白质的白质的多肽链数目多肽链数目、 多肽链的氨基酸顺序多肽链的氨基酸顺序，以及多以及多肽链内或链间二肽链内或链间二硫键的数目和位置硫键的数目和位置。最。最重要的是多肽链的氨基重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。物功能的基础。u蛋白质氨基酸顺序的改变，不仅将影响蛋蛋白质氨基酸顺序的改变，不仅将影响蛋白质的高级结构，而且将直接影响其生物白质的高级结构，而且将直接影响其生物功能。如果某种蛋白质正常的氨基酸顺序功能。如果某种蛋白质正常的氨基酸顺序发生改变，则可能产生异常功能或病变。发生改变，则可能产生异常功能或病

23、变。u例例:镰形细胞贫血的遗传性疾病，变异的血镰形细胞贫血的遗传性疾病，变异的血红蛋白与正常蛋白的差异红蛋白与正常蛋白的差异:Hb A Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Hb S Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys- 1 2 3 4 5 6 7 8Segments of -Chain in HbA and HbS.3.5.2 蛋白质的三维结构蛋白质的三维结构v研究蛋白质三维结构的方法研究蛋白质三维结构的方法: X-射线衍射法射线衍射法;高分辨核磁共振技术高分辨核磁共振技术v稳定蛋白质三维结构的作用力稳定蛋白质三维结构的作用力 氢键（氢键

24、（ Hydrogen bonds ）、范德华力）、范德华力（Van der waals interaction）、）、疏水疏水作用（作用（ Hydrophobic interactions 、静、静电引力（电引力（Electrostatic interactions）、）、二硫键二硫键v蛋白质的二级蛋白质的二级(Secondary)(Secondary)结构是指肽链结构是指肽链的主链在空间的排列。它只涉及的主链在空间的排列。它只涉及肽链主肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键链的构象及链内或链间形成的氢键。v主要有主要有 - -螺旋、螺旋、 - -折叠、折叠、 - -转角。转角。v肽链主链的构象

25、是由肽键的特殊结构决肽链主链的构象是由肽键的特殊结构决定的定的v维持主链空间排列的另一个重要因素是维持主链空间排列的另一个重要因素是氢键。在各种可能的构象中，能够形成氢键。在各种可能的构象中，能够形成氢键最多的构象最稳定。氢键最多的构象最稳定。(1) -螺旋螺旋 ( -Helix)v主链按右手方向盘绕主链按右手方向盘绕成螺形。成螺形。v从从N-N-末端出发，氢键末端出发，氢键是由每个肽基的是由每个肽基的-C=O-C=O基与其前面第基与其前面第3 3个肽个肽基的基的- -N-HN-H之间形成的。之间形成的。氢键的取向几乎与螺氢键的取向几乎与螺旋中心轴平行。旋中心轴平行。14523v1950年，年

26、，Pauling等提等提出，每圈螺旋包括出，每圈螺旋包括3.6个个氨基酸残基，高度为氨基酸残基，高度为0.54 nm，每个氨基酸，每个氨基酸残基沿轴上升残基沿轴上升0.15 nm，绕轴旋转绕轴旋转100o。v一般来说，氨基酸残基一般来说，氨基酸残基的的R R基团比较小，不带电基团比较小，不带电荷，则有利于荷，则有利于 - -螺旋的螺旋的形成和稳定。多肽链只形成和稳定。多肽链只要存在脯氨酸，要存在脯氨酸， - -螺旋螺旋即发生中断。即发生中断。(2) (2) - -折叠折叠( ( -Pleated sheets) -Pleated sheets) v - -折叠是由两条或多条折叠是由两条或多条几

27、乎完全伸展的肽链平几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构的主链呈锯齿状折叠构象。象。v在在 - -折叠中，几乎所有肽键都参与链内氢键的折叠中，几乎所有肽键都参与链内氢键的交联。因此，折叠结构一般比较牢固。交联。因此，折叠结构一般比较牢固。v氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。氢键与链的长同一肽链的不同部分之间形成。氢键与链的长轴接近垂直。轴接近垂直。v - -折叠有两种类型：一种为平行式，即所有肽折叠有两种类型：一种为平行式，即所有肽链的链的

28、N-N-端都在同一边。另一种为反平行式，即端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。相邻两条肽链的方向相反。v在在 - -转角部分，由四个转角部分，由四个氨基酸残基组成氨基酸残基组成; ;v弯曲处的弯曲处的第一个氨基酸第一个氨基酸残基的残基的 -C=O -C=O 和第四个和第四个残基的残基的 N-H N-H 之间形成之间形成氢键氢键，形成一个不很稳，形成一个不很稳定的环状结构。定的环状结构。v这类结构主要存在于球这类结构主要存在于球状蛋白分子中。状蛋白分子中。（1 1）三级结构）三级结构( (Tertiary Structure) )v是指在二级结构基础上，是指在二级结构基础上

29、，肽链在空间进肽链在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构构象在内的特征三维结构。v维系这种特定结构的力主要有氢键、疏维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。尤其是疏水键、离子键和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。用。v定义：定义：具有三级结构的多肽链按一定的空间排具有三级结构的多肽链按一定的空间排列方式，通过非共价键缔合在一起形成蛋白质列方式，通过非共价键缔合在一起形成蛋白质大分子。四级结构即指各个大分子。四级结构即指各个亚基亚基在这些蛋白质在这些蛋白质中的

30、空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。v维持亚基之间的化学键主要是疏水力。维持亚基之间的化学键主要是疏水力。v由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白。白。v例如：马血红蛋白的四级结构是由四条螺旋肽例如：马血红蛋白的四级结构是由四条螺旋肽链（每一条螺旋链与一个血红素结合）组成。链（每一条螺旋链与一个血红素结合）组成。Interactions that maintain tertiary structure.2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定自从自从19531953年年英国英国F.SangerF.Sa

31、nger测定了胰岛素的两条多测定了胰岛素的两条多肽链的氨基酸顺序。现在已经有上千种不同蛋肽链的氨基酸顺序。现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。白质的一级结构被测定。测定蛋白质的一级结构的要求测定蛋白质的一级结构的要求v样品必需纯（样品必需纯（97%97%以上）；以上）；v知道蛋白质的分子量；知道蛋白质的分子量；v知道蛋白质由几个亚基组成；知道蛋白质由几个亚基组成；v测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。每种氨基酸的个数。v测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一

32、级结构的测定v(1).多肽链的拆分。多肽链的拆分。v由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。(肌球素肌球素)2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定v(1).多肽链的拆分多肽链的拆分。v几条多肽链借助非共价键连接在一起，几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L8mol/L尿尿素或素或6mol/L6mol/L盐酸胍盐酸胍处理，即可分开多肽处理，即可分开多肽链链( (亚基亚基).).2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定v(2).测定蛋白质分子中多肽链的

33、数目。测定蛋白质分子中多肽链的数目。v通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。链的数目。2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定v(3)(3)，二硫键的断裂，二硫键的断裂vReduction or Oxadation :应用应用过甲酸氧过甲酸氧化法化法或或 - -巯基乙醇巯基乙醇还原法拆分多肽链间的二还原法拆分多肽链间的二硫键。硫键。然后用烷基化试剂保护生成的巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。以防止它重新被氧化。2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定1

34、作用：作用：这些反应可用于巯基的保护这些反应可用于巯基的保护。-OOCCHCH2SHNH3+CH2OCClO-OOCCHCH2SNH3+OCCH2OCH2ClCH2-OOCCHCH2SNH3+ICH2CNH2OCH2CNH2O-OOCCHCH2SNH3+2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定(4)(4)测定每条多肽链的氨基酸组成测定每条多肽链的氨基酸组成v分离、纯化的多肽链一部分样品分离、纯化的多肽链一部分样品进行完全水解，测定它的氨基酸进行完全水解，测定它的氨基酸组成，组成，并计算出各种氨基酸的分并计算出各种氨基酸的分子比；子比；2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定(4)(

35、4)测定测定每条每条多肽多肽链的链的氨基氨基酸组酸组成成2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定v( (5)5)分析多肽链的分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端。末端。2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定v多肽链端基氨基酸分为两类：多肽链端基氨基酸分为两类：N-N-端氨基端氨基酸和酸和C-C-端氨基酸。端氨基酸。v在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定vSanger Reagent。O2NNO2FH2N+CHRC弱碱中O2NNO2NH CHRCOOHDNP

36、氨基酸（黄色）O2NNO2NH CHRCOOH+H2ODNP-多肽+氨基酸(游离状态)溶剂抽提TLC,HPLC分离,分析鉴定2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定v优点优点: :是丹磺酰是丹磺酰- -氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到度可以达到1 1 1010-9-9molmol。DNS-DNS-氨基酸不需提取氨基酸不需提取, ,直接用纸直接用纸电泳或电泳或TLCTLC鉴定。鉴定。N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰

37、氨基酸pH 8,9H+,2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定v此法是多肽链此法是多肽链C-C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，水条件下加热，C-C-端氨基酸即从肽链上解离出来，端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与醛缩合成不溶于水的物质而与C-C-端氨基酸分离端氨基酸分离。H2NCH CROHNCH CROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCH CRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸2

38、. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定( (6)6)多肽链断裂成多个肽段多肽链断裂成多个肽段。v可采用两种或多种不同的断裂方法将多可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。并将其分离开来。2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 1 2 3 4 5v 酶解法酶解法: :v条件条件: 选择性强选择性强, 反应产率高反应产率高v胰蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶多肽链的选择性降解多肽链的选择性降解CNRmCHHNOCHRnHC

39、ON N- -端端C C- -端端水水解解位位置置2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定v 化学法：化学法：(Cyanogen bromide) -对相对分子质对相对分子质量大的蛋白质量大的蛋白质v常用的有常用的有溴化氰水解法溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。氨酸的羧基所形成的肽键。COHCNHHNCH2CHRCCH2SOH3CBrCNBr-+COHCNHHNCH2CHRCCH2OH3CSCNSCNH3CCOHCNHHNH2CCHRCCH2OCOHCNH3HNH2CCHRCCH2OO高高丝丝氨氨酸酸内内酯酯+ H2O+2. 蛋白质一级结

40、构的测定蛋白质一级结构的测定 肽段的纯化：肽段的纯化： 凝胶过滤、凝胶电泳、凝胶过滤、凝胶电泳、HPLC2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定v( (7)7)测定每个肽段的氨基酸顺序。测定每个肽段的氨基酸顺序。2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定EdmanEdman氨基酸顺序分析法氨基酸顺序分析法Edman(苯苯异硫氰酸酯异硫氰酸酯法）法）氨基酸氨基酸顺序分析法顺序分析法实际上也是实际上也是一种一种N-端分端分析法。此法析法。此法的特点是能的特点是能够不断重复够不断重复循环，将肽循环，将肽链链N-端氨基端氨基酸残基逐一酸残基逐一进行标记和进行标记和解离。解离。NCS+NHCH

41、HR1CONHHCR2COpH 9HNCNHCHR1COHNHCR2COSHNHCNHCHR1COSNCNHCHR1SCOCF3COOH无无水水噻噻唑唑啉啉酮酮苯苯胺胺NH3CHR1CONHHCR2CO去去掉掉了了N N- -端端氨氨基基酸酸的的多多肽肽P PT TC C- -多多肽肽P PI IT TC C多多肽肽H+PTH-氨氨基基酸酸2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定EdmanEdman氨基酸顺序分析法氨基酸顺序分析法2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定(8)(8)确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序利用两套或多套肽段的

42、氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。的氨基酸顺序。2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定(9)(9)确定原多肽链中二硫键的位置确定原多肽链中二硫键的位置。2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定v一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，的多肽链，v再利用双向电泳技术分离出各个肽段，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，及顺序分析，v然后同其它方法分析的肽段进行比较，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位

43、置。确定二硫键的位置。2. 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定1 1纤维状蛋白纤维状蛋白(fibrous protein)(fibrous protein)v纤维状蛋白质广泛地分布于脊椎和无脊纤维状蛋白质广泛地分布于脊椎和无脊椎动物体内，是动物体的椎动物体内，是动物体的基本支架和外基本支架和外保护成分保护成分，占脊椎动物体内蛋白质总量，占脊椎动物体内蛋白质总量的一半或一半以上。的一半或一半以上。v外形呈纤维状或细棒状外形呈纤维状或细棒状，分子是有规则，分子是有规则的线型结构，这与其多肽链的有规则二的线型结构，这与其多肽链的有规则二级结构有关。级结构有关。v不溶性不溶性( (硬蛋白硬蛋白)

44、 )：如，角蛋白、胶原蛋白如，角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白等。和弹性蛋白等。v可溶性：可溶性：如，肌球蛋白和纤维蛋白原等如，肌球蛋白和纤维蛋白原等纤维状蛋白纤维状蛋白v角蛋白广泛角蛋白广泛存在于动物存在于动物的皮肤及皮的皮肤及皮肤的衍生物肤的衍生物，如毛发、甲、如毛发、甲、角、鳞和羽角、鳞和羽等，属于结等，属于结构蛋白。角构蛋白。角蛋白中蛋白中主要主要的是的是 - -角蛋角蛋白。白。纤维状蛋白纤维状蛋白v - -角蛋白主要由角蛋白主要由 - -螺旋构象的多肽链组螺旋构象的多肽链组成。一般是由三条右手成。一般是由三条右手 - -螺旋肽链形成螺旋肽链形成一个原纤维，原纤维的肽链之间有二硫一个原纤维，

45、原纤维的肽链之间有二硫键交联以维持其稳定性键交联以维持其稳定性v例如毛的纤维是由多个原纤维平行排列，例如毛的纤维是由多个原纤维平行排列，并由氢键和二硫键作为交联键将它们聚并由氢键和二硫键作为交联键将它们聚集成不溶性的蛋白质。集成不溶性的蛋白质。v - -角蛋白的伸缩性能很好，当角蛋白的伸缩性能很好，当 - -角蛋白角蛋白被过度被过度- -拉伸时，则氢键被破坏而不能复拉伸时，则氢键被破坏而不能复原。此时原。此时 - -角蛋白转变成角蛋白转变成 - -折叠结构，折叠结构，称为称为 - -角蛋白角蛋白。纤维状蛋白纤维状蛋白v 一根毛发周围是一层一根毛发周围是一层鳞状细胞鳞状细胞(scale (sca

46、le cell)cell)，中间为皮层，中间为皮层细胞细胞(cortical (cortical cell)cell)。皮层细胞横。皮层细胞横截面直径约为截面直径约为20 20 m m。在这些细胞中，大纤在这些细胞中，大纤维沿轴向排列。所以维沿轴向排列。所以一根毛发具有高度有一根毛发具有高度有序的结构。序的结构。v毛发性能就决定于毛发性能就决定于 螺旋结构以及这螺旋结构以及这样的组织方式。样的组织方式。纤维状蛋白纤维状蛋白原纤丝原纤丝中间细丝中间细丝初原纤丝初原纤丝纤维状蛋白纤维状蛋白v丝心蛋白丝心蛋白(fibroin)(fibroin)是蚕丝和蜘蛛丝的一是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白具

47、有抗张强度高，质种蛋白质。丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性。地柔软的特性。纤维状蛋白纤维状蛋白v丝心蛋白是由伸展的肽链沿纤维轴平行排列成丝心蛋白是由伸展的肽链沿纤维轴平行排列成反向反向 - -折叠结构。分子中不含折叠结构。分子中不含 - -螺旋。螺旋。v丝蛋白的肽链通常是由多个六肽单元重复而成。丝蛋白的肽链通常是由多个六肽单元重复而成。这六肽的氨基酸顺序为：这六肽的氨基酸顺序为：v - -（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-AlaGly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n n- -纤维状蛋白纤维状蛋白v由于每隔一个氨基酸即为由于每隔一个氨基酸即为GlyGly，所以在折叠片层

48、，所以在折叠片层一边的所有侧链均为氢原子（一边的所有侧链均为氢原子（GlyGly的侧链）的侧链）, ,另一另一边的侧链则主要是甲基（边的侧链则主要是甲基（AlaAla的侧链），结构紧的侧链），结构紧凑。凑。v链间主要以氢键连接，层间主要靠范德华力维系。链间主要以氢键连接，层间主要靠范德华力维系。纤维状蛋白纤维状蛋白v球状蛋白是结构最复杂，功能最多的一类球状蛋白是结构最复杂，功能最多的一类蛋白质。蛋白质。v这类蛋白结构紧密，分子的外层多为亲水这类蛋白结构紧密，分子的外层多为亲水性残基，能够发生水化；内部主要为疏水性残基，能够发生水化；内部主要为疏水性氨基酸残基。因此，许多球蛋白分子的性氨基酸残基

49、。因此，许多球蛋白分子的表面是亲水性的，而内部则是疏水性的。表面是亲水性的，而内部则是疏水性的。典型的球蛋白是血红蛋白。典型的球蛋白是血红蛋白。v血红蛋白是脊椎动血红蛋白是脊椎动物红细胞内的呼吸物红细胞内的呼吸蛋白。由四条肽链蛋白。由四条肽链组成，即两条组成，即两条 - -链链和两条和两条 - -链。链。The six coordinationThe six coordinationbonds of the ferrous bonds of the ferrous iron (Feiron (Fe2+2+) )v血红蛋白是一种结血红蛋白是一种结合蛋白，每一条肽合蛋白，每一条肽链各与一个血红素链

50、各与一个血红素（）相连接。）相连接。血红素血红素v血红素同肽链的连接是血红素的血红素同肽链的连接是血红素的Fe原子以配原子以配价键与肽链分子中的组氨酸咪唑基的氮原子价键与肽链分子中的组氨酸咪唑基的氮原子相连。相连。v主要功能：是运输氧和二氧化碳主要功能：是运输氧和二氧化碳v血红蛋白中，血红素血红蛋白中，血红素FeFe原子的第六配价键可以原子的第六配价键可以与不同的分子结合：无氧存在时，与水结合，与不同的分子结合：无氧存在时，与水结合，生成去氧血红蛋白生成去氧血红蛋白(Hb(Hb) )；有氧存在时，能够与；有氧存在时，能够与氧结合形成氧合血红蛋白氧结合形成氧合血红蛋白(HbO(HbO2 2) )

51、。v血红蛋白与氧的结合不牢固，容易离解。氧的血红蛋白与氧的结合不牢固，容易离解。氧的分压和分压和pHpH较高时，有利于血红蛋白与氧的结合，较高时，有利于血红蛋白与氧的结合，反之，则有利于离解。反之，则有利于离解。 HbHHbH+ + O+ O2 2 HbO HbO2 2 + H + HHbOHbO2 2 + H + H+ +CO+CO2 2 HbHCO HbHCO2 2+O+O2 2pH=7.2（肌肉）（肌肉）pH=7.6（肺）（肺）碳酸血红蛋白碳酸血红蛋白v血红蛋白还能够血红蛋白还能够对血液的对血液的pHpH起缓冲作用起缓冲作用。因为因为HbOHbO2 2在释放出一分子氧的同时，结合在释放出

52、一分子氧的同时，结合一个氢质子。这样就可以消除由于呼吸一个氢质子。这样就可以消除由于呼吸作用产生的作用产生的COCO2 2引起引起pHpH的降低。的降低。HbOHbO2 2 + H + H+ +CO+CO2 2 HbHCO HbHCO2 2+O+O2 2pH=7.2（肌肉）（肌肉）pH=7.6（肺）（肺）碳酸血红蛋白碳酸血红蛋白v一氧化碳（一氧化碳（COCO）也能与血红素）也能与血红素FeFe原子结原子结合。由于合。由于COCO与血红蛋白结合的能力与血红蛋白结合的能力是是O O2 2的的200200倍，因此，人体吸入少量的倍，因此，人体吸入少量的COCO即可即可完全抑制血红蛋白完全抑制血红蛋白

53、与与O O2 2的结合，从而造的结合，从而造成缺氧死亡。成缺氧死亡。v急救方法是尽快将病人转移到富急救方法是尽快将病人转移到富含含O O2 2的的环境中（如新鲜空气、纯氧气或高压氧环境中（如新鲜空气、纯氧气或高压氧气），使与血红素结合的气），使与血红素结合的COCO被被O O2 2置换出置换出来。来。 v免疫球蛋白是一类血浆糖蛋白免疫球蛋白是一类血浆糖蛋白(serum (serum glycoprotein)glycoprotein)。糖蛋白中的蛋白质与糖是共价。糖蛋白中的蛋白质与糖是共价联接的。联接的。v免疫球蛋白是被脊椎动物作为抗体合成的。主免疫球蛋白是被脊椎动物作为抗体合成的。主要在脾、

54、肝和淋巴等组织的细胞内合成。要在脾、肝和淋巴等组织的细胞内合成。v免疫反应免疫反应：当外来的被称为抗原的物质，如多：当外来的被称为抗原的物质，如多糖、核酸和蛋白质等侵入机体时即引起抗体的糖、核酸和蛋白质等侵入机体时即引起抗体的产生，这就是所谓免疫反应。产生，这就是所谓免疫反应。v高度特异性和多样性高度特异性和多样性v高度特异性高度特异性就是一种抗体一般只能与引起它产就是一种抗体一般只能与引起它产生的相应抗原发生反应。抗原生的相应抗原发生反应。抗原抗体复合物往抗体复合物往往是不溶的，因此常从溶液中沉淀出来。在体往是不溶的，因此常从溶液中沉淀出来。在体外，沉淀反应已被广泛用于研究抗原外，沉淀反应已

55、被广泛用于研究抗原抗体反抗体反应，并成为免疫学的基础。应，并成为免疫学的基础。v多样性多样性就是不同的抗原可以诱导产生不同的抗就是不同的抗原可以诱导产生不同的抗体。抗原种类的多样性决定了抗体的多样性。体。抗原种类的多样性决定了抗体的多样性。v一般说来，一个抗原与接受该抗原的动物关系一般说来，一个抗原与接受该抗原的动物关系愈远，则产生抗体所需的时间愈短，抗体反应愈远，则产生抗体所需的时间愈短，抗体反应也愈强。也愈强。v 人的抗体蛋白分人的抗体蛋白分5类：类： IgAIgA( (存在于分泌液中的一类主要抗体存在于分泌液中的一类主要抗体) ) IgD IgD（功能尚未知）（功能尚未知） IgEIgE

56、（对寄生虫的免疫）（对寄生虫的免疫） IgGIgG（血液中存在的主要抗体）（血液中存在的主要抗体） IgMIgM（可与入侵的微生物结合）（可与入侵的微生物结合）v抗体蛋白抗体蛋白G(IgGG(IgG) )是一类最简单的免疫球蛋白。是一类最简单的免疫球蛋白。IgGIgG含有两条相同的高分子量的重链含有两条相同的高分子量的重链(heavy (heavy chain)chain)和两条相同的低分子量的轻链和两条相同的低分子量的轻链(light (light chain)chain)。v四条链通过二硫键共价联四条链通过二硫键共价联接成接成Y Y字形结构。每一抗字形结构。每一抗体蛋白分子含有二个抗原体蛋

57、白分子含有二个抗原结合部位，它们位于结合部位，它们位于Y Y形形结构的二个顶点。结构的二个顶点。vIgG分子在未分子在未与抗原结合时呈与抗原结合时呈T型结构，含有型结构，含有三个活性区，即三个活性区，即两个两个Fab区和一区和一个个Fc区。区。v抗体蛋白在与抗原结合过程中，分子的抗体蛋白在与抗原结合过程中，分子的构型将发生变化。构型将发生变化。 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1972for their discoveries for their discoveries concerning the concerning the chemic

58、al structure chemical structure of antibodiesof antibodiesGerald M. Edelman Rockefeller University USAb. 1929Rodney R. PorterUniversity of Oxford United KingdomB. 1917 19581958年年, ,八肽八肽- -催产素的合成催产素的合成19651965年年, ,结晶牛胰岛素的合成结晶牛胰岛素的合成肽的人工合成肽的人工合成: :a.a.不同氨基酸按照一定顺序的控制合成不同氨基酸按照一定顺序的控制合成b.b.一种或两种氨基酸聚合或共聚合

59、一种或两种氨基酸聚合或共聚合控制合成的困难控制合成的困难: :接肽反应所需的试剂能同时和其它接肽反应所需的试剂能同时和其它不应参加接肽的功能团发生作用。因此不应参加接肽的功能团发生作用。因此, ,接肽以前必接肽以前必须首先把这些基团加以封闭或保护须首先把这些基团加以封闭或保护, ,以免和接肽试剂以免和接肽试剂发生作用而生成不需要的肽键或其他键。同时还要发生作用而生成不需要的肽键或其他键。同时还要对羧基进行活化对羧基进行活化. .3.6.1 3.6.1 氨基的保护方法氨基的保护方法 常用保护氨基的方法是酰化。酰化基团的选择原常用保护氨基的方法是酰化。酰化基团的选择原则：能够在温和的条件下酰化及去

60、酰基化。则：能够在温和的条件下酰化及去酰基化。（1 1）叔丁氧基酰基）叔丁氧基酰基(t-Boc(t-Boc) )vt-Boct-Boc是常用的氨基保护基。二叔丁基二碳酸酯是常用的氨基保护基。二叔丁基二碳酸酯与氨基酸作用，形成与氨基酸作用，形成t-Boct-Boc- -氨基酸，可以有效地氨基酸，可以有效地保护氨基。保护氨基。CCH3H3CCH3OCOOCCCH3CH3CH3OOCHH2NCOO-R+CCH3H3CCH3OCOCHNHCOO-R碱氨基酸t-Boc-氨基酸二叔丁基二碳酸酯氨基的保护方法氨基的保护方法vT-BocT-Boc 基可以在温和的酸性条件下，以气态形基可以在温和的酸性条件下，以