离心技术PPT课件

1、1 离心技术1.1 基本原理基本原理离心技术（离心技术（centrifugal technique）是根据颗）是根据颗粒在作匀速圆周运动时粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一的行为而发展起来的一种分离技术。种分离技术。第1页/共88页 应用：各种生物样品的分离和制备。如分离收集细胞、细胞器及生物大分子物质；提纯、鉴定生物大分子；分离化学反应的沉淀物。 生物样品悬浮液在离心力作用下使悬浮的微小颗粒以一定速度沉降，从而与溶液分离，其沉降速度与颗粒的质量、大小和密度相关。第2页/共88页相对离心力相对离心力离心力因离心半径不同而不同，因此用离心力因离心半径

2、不同而不同，因此用“相相对离心力对离心力” （relative centrifugal force，RCF）表示离心力，若）表示离心力，若RCF值不变，一个样值不变，一个样品可在不同的离心机上获得相同的结果。品可在不同的离心机上获得相同的结果。第3页/共88页 Dole和Cotzias制作了与转子速度和半径相对应的离心力的转换列线图。 在用图将离心机转数换成相对离心力时，先在离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在转数标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的离心力数值。第4页/共88页 例已知离心机转数为2500rpm，离心机的半径为，将两点连

3、接起来交于RCF标尺，此交点500g即是RCF值。 RCF(g)=1.11910-5rrpm2。第5页/共88页第6页/共88页1.2 离心分类 根据离心原理，按照实际工作的需要，设计了许多离心方法，大致可分三类。 差速离心法(differential velocity centrifugation) 速率区带离心法（rate zonal centrifugation） 等密度离心法（isopycnic centrifugation）第7页/共88页1.2.1 差速离心法 利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、

4、形状不同的粒子分部沉淀。 操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。 第8页/共88页 差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。 关键是选择适合于各分离物的离心力。 例如用差速离心法分离已破碎的细胞各组份。第9页/共88页 差速离心分离细胞组分第10页/共88页第11页/共88页1.2.2 速率区带离心法 速率区带离心法是在离心前于离心管内先预装密度梯度介质（如蔗糖、甘油、CsCl等），将待分离的样品铺一薄层在梯度液的顶部进行离心

5、。第12页/共88页第13页/共88页 离心后在近旋转轴处（r1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（r2）介质的密度最大； 但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即Pm。第14页/共88页 根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。第15页/共88页 梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。第16页/共88页 由于Pm可知S0，因此该离心法的离心时间要严格控制。 如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有有足够的

6、时间使在介质中分离形成区带。 由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。 常用的梯度液有聚蔗糖（Ficoll）、硅溶胶（例如，Percoll）及蔗糖。第17页/共88页第18页/共88页 离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速率向管底沉降。离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，形成一系列界面清楚的不连续区带。 沉降系数越大，沉降越快。离心必须在沉降最快的颗粒（大颗粒）到达管底前或刚到达管底时结束，使颗粒处于不完全的沉降状态，而出现在某一些特定的区带内。第19页/共88页 离心过程中区带的位置和形状（或带宽）随时间而改变，

7、因此，区带的宽度不仅取决于样品组分的数量、梯度的斜率、颗粒的扩散作用和均一性，也与离心时间有关。 离心时间越长，区带越宽。适当增加离心力可缩短离心时间，并可减少扩散导致的区带加宽现象，增加区带界面的稳定性。 较长的离心管有助于提高分辨率。第20页/共88页1.2.3 等密度离心法 等密度离心是依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的。第21页/共88页 等密度离心可在离心前预先配制介质的密度梯度，也可依靠离心力来形成梯度（自形成梯度），此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚至可与梯度液混在一起。第22页/共88页 在离心过程中由于样

8、品各单一成份向自己的等密度区靠扰即达到了分离纯化的目的。等密度离心法中，梯度液的初始最大密度常常超过样品各组份的密度，利用每个单一组份沉降或上浮到它们各自的等密度区来达到分离的目的。第23页/共88页 当管底介质的密度大于粒子的密度，即mP时粒子上浮；在管顶处Pm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即Pm，此时dr/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带。第24页/共88页 沉降与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关。 体系到达平衡状态后，延长离心时间和提高转速也不能改变粒子的成带位置。 第25页/共88页 但提高转速可缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒

9、到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。 此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用的梯度液是CsCl。第26页/共88页第27页/共88页1.2.4 梯度溶液的制备 梯度材料的选择原则 理想梯度材料具备的特点： 化学稳定性好，与被分离的生物材料不发生反应，对被分离样品渗透很少，且易与所分离的生物粒子分开。 溶解度高，可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。第28页/共88页 不会对离心设备发生腐蚀作用。 容易纯化，价格便宜或容易回收。 较低的光吸收特性，有光折射率的对照资料，浓度便于测定。 物理性质、热力学性质应该是已知的

10、。 但很难找到一种适合于各种密度梯度离心的完美梯度液。第29页/共88页 基本符合原则的梯度材料： 糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原 无机盐类：CsCl、RbCl（氯化铷）、NaCl、KBr等 有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等 硅溶胶：如Percoll 蛋白质：如牛血清白蛋白 重水 非水溶性有机物：如氟代碳等第30页/共88页第31页/共88页 梯度材料的应用范围 蔗糖：水溶性大，性质稳定，其最高密度，价格低易制备。但渗透压较高，高浓度时粘度较大。线性梯度范围是520%W/V或1040%W/V。 用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有

11、较大的渗透压，以及较高的渗透性，不宜用于细胞的分离。 第32页/共88页 聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400（相对分子重量400000），Ficoll渗透压低，而粘度特别高，与泛影葡胺混合可降低粘度。用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。 第33页/共88页 CsCl：为离子性介质、水溶性大，最高密度可达。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。 卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天

12、然或变性的DNA。第34页/共88页 Percoll：商品名，是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，不穿透生物膜，对细胞无毒害，对生物材料的影响小，颗粒稳定。在冷却和冻融情况下稳定，粘度高，在酸性pH和高离子强度下不稳定。用于细胞、细胞器和病毒的分离。 蔗糖适宜做速率区带离心的材料，而等密度离心，不同的生物样品对梯度材料的要求有较大差异。 第35页/共88页材料名称DNARNA 核蛋白膜亚细胞器 细胞病毒蔗糖差差可用较好较好可用较好Ficoll差差不适合可用可用最佳较好CsCl最佳较好最佳差差差较好Percoll差差差可用较好较好可用Nycodenz可用可用最佳最佳最

13、佳较好较好常用于等密度离心梯度材料第36页/共88页 密度梯度液可用梯度仪制备线性梯度，也可人工辅设阶梯型梯度，离心管静置一定时间后也可以形成近线性梯度。 阶梯型不连续梯度多适用于从组织的匀浆中分离整细胞或亚细胞器，或用于某些病毒的纯化。 连续梯度由于其密度平滑地变化，多用于某些生物样品的多种成份组合的分离。第37页/共88页第38页/共88页第39页/共88页 选择自形成梯度还是预形成梯度，主要取决于材料的性质。如果些胶体硅材料（Percoll或Ludox）可在1000020000g的离心场中离心30min就可以自形成梯度。但CsCl或Meterizamide需要50000500000g的离

14、心场中离心数少时甚至数十小时才能自形成梯度.第40页/共88页 如用CsCl做质粒DNA分离，梯度液中加EB和Triton x-100，在490000g需要离心4hr，才能利用CsCl的自形成梯度分离出质粒DNA，染色体DNA，RNA和蛋白质。第41页/共88页第42页/共88页预形成梯度的优点是离心时间较短，因为只要考虑样品中某个组份到达其等密度区所需要的时间。预形成梯度常被用来分离较大颗粒，如100S的样品。预形成梯度缺点是被分离样品的容量较少；对某些样品如细胞或病毒会因单向沉降而产生颗粒聚结，从而减少了样品回收率和纯度；预先制备样度液需较长时间，较繁复。第43页/共88页 自形成梯度：某

15、些梯度材料能够在离心过程中形成密度梯度，Ludox、Percoll中的胶体硅颗粒可较快地形成梯度，而另一些材料如CsCl、Cs2SO4和Metrizamide等则在沉降过程中受到其反向浓度扩散的影响，达到平衡的时间就比较长。如果为了提高分辨率，自形成梯度是很难使梯度曲线变得陡一些的。第44页/共88页1.3 离心设备离心机分为工业用和实验用离心机分为工业用和实验用离心机。实验用离心机又分离心机。实验用离心机又分为制备性和分析性离心机。为制备性和分析性离心机。制备性离心机主要用于分离制备性离心机主要用于分离各种生物材料和分子，分离各种生物材料和分子，分离的样品容量比较大。的样品容量比较大。分析性

16、离心机一般都带有光分析性离心机一般都带有光学系统，用于研究生物大分学系统，用于研究生物大分子和颗粒的理化性质。分析子和颗粒的理化性质。分析性离心机都是超速离心机。性离心机都是超速离心机。 第45页/共88页1.3.1 离心机的种类普通离心机普通离心机转速转速20006000rpm，RCF可达可达6000g；容量为几十毫；容量为几十毫升至几升，分离形式是固液升至几升，分离形式是固液沉降分离，转子有角式和外沉降分离，转子有角式和外摆式，转速控制不严格，一摆式，转速控制不严格，一般无制冷系统，用于收集易般无制冷系统，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。球、酵母细

17、胞等。第46页/共88页普通离心机以交流电动机驱普通离心机以交流电动机驱动，电机碳刷易磨损，利用动，电机碳刷易磨损，利用电压调压器调节转速，起动电压调压器调节转速，起动电流大，速度升降不均匀，电流大，速度升降不均匀，一般转头是置于一个硬质钢一般转头是置于一个硬质钢轴上，因此必需进行精确平轴上，因此必需进行精确平衡，以免损坏离心机。衡，以免损坏离心机。第47页/共88页高速离心机高速离心机：转速：转速2000025000rpm，RCF可达可达89000g，最大容量可达，最大容量可达3升，分离形式升，分离形式是固液沉降分离。是固液沉降分离。第48页/共88页 转头配有各种角式转头、荡平式转头、区带

18、转头、垂直转头和大容量连续流动式转头。一般有制冷系统，以消除转头与空气摩擦而产生的热量（温度040），转速、温度和时间都可严格准确地控制。通常用于微生物菌体、大细胞器、蛋白质硫铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作。第49页/共88页 超速离心机：转速5000080000rpm，RCF可达600000g；离心容量由几十ml至2L，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，可进行亚细胞器分级分离，病毒、核酸、蛋白质和多糖等生物大分子的分离。 按性能可分为分析型、制备型和分析制备型三种。第50页/共88页第51页/共88页 超速离心机主要由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四部分组成。 驱动装

19、置是由水冷或风冷电动机通过精密齿轮箱或皮带变速，或直接用变频感应电机驱动，由微机控制。 驱动轴较细，在旋转时有一定的弹性弯曲以适应转头轻度的不平衡。 具有过速保护系统，防止转速超过转头最大规定转速而引起转头的撕裂或爆炸，离心腔用装甲钢板密闭。第52页/共88页 温度控制是由安装在转头下面的红外线射量感受器直接并连续监测离心腔的温度，以保证更准确更灵敏的温度调控，红外线温控比高速离心机的热电偶控制装置敏感和准确。第53页/共88页 超速离心机装的真空系统：离心机的速度2000 rpm时，转头与空气磨擦产生的热量很少，速度20000 rpm时，磨擦生热显著增大，当速度40000 rpm时，磨擦生热

20、则非常严重，因此，将超速离心机的离心腔密封，并由机械泵和扩散泵串联工作的真空泵系统抽成真空，温度的变化容易控制，磨擦力很小，这样才能达到所需的超高转速。第54页/共88页1.3.2 离心机的组成及使用 离心机一般由：主机、转头、离心管组成。第55页/共88页 转头有不同容量和性能可供选择，按离心管与离心机转轴的夹角可分为角转头和水平转头。 高速离心机和超高速离心机的转头都有使用一定的寿命。第56页/共88页 角式转头：离心管腔与转轴成一定倾角的转头。它是由一块完整的金属制成的，其上有412个装离心管用的孔，孔的中心轴与旋转轴间有2040夹角，角度越大沉降越结实，分离效果越好。第57页/共88页

21、 角转头的优点：容量较大、重心低、运转平衡、寿命较长。是各种离心机的最高速转头。 主要用于差速离心，在高速离心机上也可用于等密度离心，例如DNA平衡等密度离心，自形成梯度，常用转速4000060000rpm，离心时间较短，分离纯度也较高。第58页/共88页 缺点：由于颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管，然后沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积而产生“壁效应”，壁效应易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱而影响分离效果。第59页/共88页 由于壁效应影响很大，用于速率区带离心时回收率低，纯度也受影响，一般只用于差速离心和等密度离心，离心时间较短。第60页/共88页 荡平式转头：转头是由吊

22、着的4或6个自由活动的离心套管构成。当转头转速达到200800rpm时，吊桶荡至水平位置，适用于密度梯度区带离心。第61页/共88页 优点：梯度物质可放在保持垂直的离心管中，离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴，有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带。 缺点：颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。第62页/共88页 壁效应少，适合做等密度离心实验，优点是回收率高，分辨能力强。由于结构的原因最高转速较低（一般在60000rpm以下），因而离心时间很长，对某些长离心管，1015ml容量的转头最高转速在4000041000rpm，用作自形成CsCl梯度的质粒DNA离心往往需要5070hr。第63

23、页/共88页 细长离心管用于速率区带离心可获得较高的纯度和分辨率，且容易控制离心时间。 25000rpm30000rpm的甩平转头适用于亚细胞器的离心分离，4000042000rpm的甩平转头适合用于核酸、蛋白、病毒类物质的分离。第64页/共88页垂直转头垂直转头：其离心管是垂直放置，样品颗粒：其离心管是垂直放置，样品颗粒的沉降距离最短，离心所需时间也短，最适的沉降距离最短，离心所需时间也短，最适合用于密度梯度区带离心和等密度梯度离心。合用于密度梯度区带离心和等密度梯度离心。第65页/共88页 转头转速很高，转速可达100000rpm（70000g），离心时间最短，分离纯度高，样品容量较大（垂

24、直剖面积最大）。 第66页/共88页 近垂直转头：管轴与旋转轴间倾角79，沉降距离比垂直转头稍大，离心时间比角式，甩平转头短。由于有了倾角，沉淀可沿管壁滑向低部，基本上消除了沉淀与浮动区带转换间的干扰，用于速率区带离心和生物大分子（如质粒DNA）的自形成梯度等密度离心。 用于DNA、RNA和蛋白质等的等密度离心，转头的最高转速达90000rpm（近650000g），离心时间相比垂直转头稍长。第67页/共88页离心管主要以塑料、玻璃或不锈钢制成，塑离心管主要以塑料、玻璃或不锈钢制成，塑料离心管常用材料有聚乙烯（料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸），聚碳酸酯（酯（PC），聚丙烯（），聚丙烯（

25、PP）等，）等，PP管性能较管性能较好。好。第68页/共88页1.4 分析性超速离心 与制备性超速离心的不同在于：分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程。 第69页/共88页1.4.1 工作原理 分析性超速离心机主要由一个椭圆形的转子、一套真空系统和一套光学系统所组成。 该转子通过一个柔性的轴联接成一个高速的驱动装置，此轴可使转子在旋转时形成自己的轴。 转子在一个冷冻的真空腔中旋转，其中容纳二个小室：分析室和配衡室。第70页/共88页 配衡室是一个经过精密加工的金属块，作为分

26、析室的平衡用。 分析室的容量一般为1ml，呈扇形排列在转子中，其工作原理与一个普遍水平转子相同。 分析室有上下二个平面的石英窗，离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质，可以通过对紫外光的吸收（如对蛋白质和DNA）或折谢率的不同对沉降物进行监视。第71页/共88页 原理：当光线通过一个具有不同密度区的透明液，在区带界面上产生光折射。在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面就象一个折射的透镜，结果在检测系统的照相底板上产出一“峰”。由于沉降不断进行，界面向前推进，“峰”也在移动，从峰移动的速度可得到物质沉降速度的指标。第72页/共88页第73页/共88页 分

27、析性超速离心系统图示第74页/共88页第75页/共88页1.4.2 分析性超速离心的应用 测定生物大分子的相对分子量 利用沉降速度法测定相对分子量。超速离心机的高速度使得任意分布的粒子通过溶剂从旋转的中心辐射地向外移动，在清除了粒子的那部分溶剂和尚含有沉降物的那部分溶剂之间形成一个明显的界面，该界面随时间的移动而移动，这就是粒子沉降速度的一个指标。 照相记录，即可求出粒子的沉降系数。第76页/共88页 生物大分子的纯度估计 分析性超速离心可应用于分析DNA制剂、病毒和蛋白质的纯度。用沉降速度的技术来分析沉降界面是测定制剂均质性的最常用方法之一，出现单一清晰的界面一般认为是均质的，如有杂质则在主

28、峰的一侧或二侧出现小峰。第77页/共88页 分析生物大分子中的构象变化 分析性超速离心已成功地用于检测大分子构象的变化。 例如DNA可能以单股或双股出现，其中每一股在本质上可能是线性的，也可能是环状的，如果遇到某种因素（温度或有机溶剂）DNA分子可能发生一些构象上的变化，这些变化也许可逆、也许不可逆。 这些构象上的变化可以通过检查样品在沉降速度上的差异来证实。第78页/共88页1.5 使用离心机的注意事项 离心时要保证离心管的对称平衡。例如，当离心转速达1000050000rpm时，如果对称管相差1g，转头半径5cm，根据离心力公式： F=mRCF，查表10000rpm时的RCF=6000，代入公式 F=16000=6kg 50000rpm时RCF=150000，F=150kg 此时引起两边不平衡可达6150kg，对离心机将造成很大的损伤，缩短离心机的使用寿命。第79页/共88页1.5.1 普通离心机注意事项 离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物。 离心管必