生物化学技术6凝胶过滤课件

1、第六章第六章 凝凝 胶胶 过过 滤滤 凝胶过滤是凝胶过滤是20C-60Y20C-60Y发展起来的一种分离纯化方发展起来的一种分离纯化方法；法；又称分子筛层析、排阻层析又称分子筛层析、排阻层析原理：原理：凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被阻挡在外部，从而使混合内部，而大分子物质却被阻挡在外部，从而使混合溶液中各种组分按分子质量不同进行筛分溶液中各种组分按分子质量不同进行筛分特点：特点：设备设备简单，操作方便、重复性好、回收率简单，操作方便、重复性好、回收率高高用途：用途：分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等，分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激

2、素等，测定蛋白质分子质量、样品的浓缩和脱盐等测定蛋白质分子质量、样品的浓缩和脱盐等 生物化学技术6凝胶过滤目目 的的n掌握凝胶的分类和性质掌握凝胶的分类和性质n掌握凝胶过滤的基本原理掌握凝胶过滤的基本原理n熟悉凝胶过滤的操作与应用熟悉凝胶过滤的操作与应用生物化学技术6凝胶过滤第一节第一节 凝胶的分类及性质凝胶的分类及性质 生物化学技术6凝胶过滤 凝胶是一类不溶于水，但在水中有较大膨胀度和较凝胶是一类不溶于水，但在水中有较大膨胀度和较好分子筛作用的化合物好分子筛作用的化合物 目前主要有目前主要有葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶、天然琼脂糖天然琼脂糖和和交联琼脂糖交联琼脂糖；其次，还有其次，还有聚丙烯酰胺凝胶

3、聚丙烯酰胺凝胶（生物胶）、（生物胶）、交联葡聚糖交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚凝胶与双丙烯酰胺共聚凝胶，以及，以及交联琼脂糖与葡聚糖共交联琼脂糖与葡聚糖共价结合的凝胶价结合的凝胶等等生物化学技术6凝胶过滤生物化学技术6凝胶过滤生物化学技术6凝胶过滤商品名称：商品名称：Sephadex，由葡聚糖由葡聚糖右旋糖酐右旋糖酐(G型型)和和3-氯氯-1，2环氧丙烷环氧丙烷(交联剂交联剂)以醚键交联而成以醚键交联而成 在交联葡聚糖在交联葡聚糖G-25、G-50中加入羟丙基后，即可构成烷中加入羟丙基后，即可构成烷基化（基化（LH型）葡聚糖凝胶型）葡聚糖凝胶 一、葡聚糖凝胶一、葡聚糖凝胶生物化学技术6凝胶过滤生物

4、化学技术6凝胶过滤性状：性状：外观为白色珠状颗粒，在显微镜下可见表面为外观为白色珠状颗粒，在显微镜下可见表面为网状网状皱纹皱纹溶解性：溶解性：带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀溶液中极易膨胀 型号：型号：Sephadex G-nSephadex G-n（n n越大，则交联度越小，而膨胀度、吸越大，则交联度越小，而膨胀度、吸水量和筛孔直径则越大水量和筛孔直径则越大应用：应用：1.1.理化性质理化性质凝胶过滤层析：凝胶过滤层析：以以G G型型SephadexSephadex为固定相，水为流动为固定相，水为流动相，对水溶性物质进

5、行分离相，对水溶性物质进行分离凝胶渗透层析：凝胶渗透层析：以以LHLH型型SephadexSephadex为固定相，以有机为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离生物化学技术6凝胶过滤 在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的中是稳定的、不溶解的 强酸或氧化剂强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂 在室温下长期保存时，应加入适量的在室温下长期保存时，应加入适量的防腐防腐剂如剂如CHClCHCl3 3、0.050.05NaNNaN3 3或或2020Et

6、OHEtOH等等 2.2.稳定性稳定性生物化学技术6凝胶过滤含少量的羧基基团，为含少量的羧基基团，为弱酸性弱酸性物质。能与带物质。能与带正电荷的分正电荷的分离物离物如碱性蛋白质等发生吸附如碱性蛋白质等发生吸附克服方法：克服方法：提高提高洗脱液的洗脱液的离子强度离子强度至至0.050.05以上，可克服以上，可克服此非特异性吸附此非特异性吸附 常用含有常用含有NaClNaCl的缓冲液作洗脱液。的缓冲液作洗脱液。新购得葡聚糖凝胶新购得葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附性能，对蛋白质往往有不可逆的吸附性能，虽然吸附的数量较少，但在定量测定或者分离纯化极难得虽然吸附的数量较少，但在定量测定或者分离纯化

7、极难得到的物质时，也需先用易得到的蛋白质进行到的物质时，也需先用易得到的蛋白质进行预层析预层析，以便，以便消除其影响消除其影响 3.吸附性吸附性生物化学技术6凝胶过滤葡聚糖凝胶对葡聚糖凝胶对芳香族化合物芳香族化合物或或杂环化合物杂环化合物以及以及某些某些凝集素凝集素具有较强的吸附作用，若采用凝胶过滤层析分具有较强的吸附作用，若采用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是吸附性能，而不是排阻原理离它们时，往往利用的是吸附性能，而不是排阻原理 生物化学技术6凝胶过滤生物化学技术6凝胶过滤琼脂糖是从琼脂中分离出来的一种由琼脂糖是从琼脂中分离出来的一种由D-D-半乳糖和半乳糖和3,63,6脱水脱水的的L-

8、L-半乳糖连接而成的多糖。其商品名因生产厂家不同而异半乳糖连接而成的多糖。其商品名因生产厂家不同而异瑞典、中国瑞典、中国 ：SepharoseSepharose美国：美国：Bio-gel A Bio-gel A 15m15m，排阻分子量小于排阻分子量小于1515millionmillion的分子，的分子，即即15 15 10 106 6 （排阻限度）（排阻限度） 英国：英国：SegavacSegavac，粉状、颗粒状粉状、颗粒状丹麦：丹麦：GelaroseGelarose除除SegavacSegavac外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售 二、琼脂糖凝胶二、琼脂糖凝

9、胶生物化学技术6凝胶过滤1.1.性性 质质高温时呈液态，经凝集即成琼脂糖凝胶高温时呈液态，经凝集即成琼脂糖凝胶对尿素、盐酸胍等具有较强的抵抗力，在对尿素、盐酸胍等具有较强的抵抗力，在pH4.0pH4.09.09.0缓缓冲液中稳定冲液中稳定层析流速较高层析流速较高干胶易脱水破裂，一般存放于含防腐剂的水溶液中，干胶易脱水破裂，一般存放于含防腐剂的水溶液中，避免剧烈搅拌避免剧烈搅拌生物化学技术6凝胶过滤Sepharose 2B(2)、4B(4)和和6B(6) Sepharose 6B的机械强度大于的机械强度大于2B，但是筛孔小于但是筛孔小于2B Sepharose与与1，3-二溴异丙醇二溴异丙醇(1

10、,3-dibromopropanol)在强碱在强碱性条件下反应后，即生成性条件下反应后，即生成CL型交联琼脂糖型交联琼脂糖 ( Sepharose CL） 这种琼脂糖的筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，但这种琼脂糖的筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，但耐热、耐酸碱。但是在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生耐热、耐酸碱。但是在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生解聚（解聚（稳定性提高稳定性提高） 2.2.应用形式（按浓度分）应用形式（按浓度分）生物化学技术6凝胶过滤3.3.特特 点点 机械强度和筛孔的机械强度和筛孔的稳定性稳定性都比葡聚糖凝胶好；且层析都比葡聚糖凝胶好；且层析时时流速较快流速较

11、快生物化学技术6凝胶过滤商品名称：商品名称：Bio-gel（生物胶）。以生物胶）。以甲撑双丙烯酰胺甲撑双丙烯酰胺(双体双体)作交联剂，以作交联剂，以过硫酸铵过硫酸铵作催化剂，在作催化剂，在N，N，N，N-四甲基四甲基乙二胺乙二胺(TEMED)加速剂的作用下（化学催化），将加速剂的作用下（化学催化），将丙烯酰胺丙烯酰胺(单体单体)聚合而成聚合而成 当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产物。商品聚当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产物。商品聚丙烯酰胺凝胶型号有丙烯酰胺凝胶型号有Bio-gel P-2到到P-300，其阿拉伯数字表示其阿拉伯数字表示排阻限度排阻限度 如如 Bio-gel P-1

12、50的排阻限度为小于的排阻限度为小于150 103 Da三、聚丙烯酰胺凝胶三、聚丙烯酰胺凝胶生物化学技术6凝胶过滤 聚丙烯酰胺凝胶一般制成珠状颗粒，使用前必须溶胀。聚丙烯酰胺凝胶一般制成珠状颗粒，使用前必须溶胀。能能忍受浓的盐、尿素和胍盐等溶液的浸泡；耐酸碱忍受浓的盐、尿素和胍盐等溶液的浸泡；耐酸碱，但要避免长，但要避免长期与强酸和强碱接触，如果与其接触并在高温条件下，酰胺基期与强酸和强碱接触，如果与其接触并在高温条件下，酰胺基将迅速发生分解将迅速发生分解 聚丙烯酰胺凝胶对聚丙烯酰胺凝胶对芳香族芳香族的、的、酸性和碱性的化合物酸性和碱性的化合物稍有稍有吸吸附附现象现象 克服吸附的方法：提高洗脱

13、液的离子强度克服吸附的方法：提高洗脱液的离子强度 生物化学技术6凝胶过滤SephacrylSephacryl是由是由烯丙烷基葡聚糖烯丙烷基葡聚糖与与甲撑双丙烯酰胺甲撑双丙烯酰胺共价交联共价交联制成。此凝胶属制成。此凝胶属硬性凝胶硬性凝胶，它具有一定大小的筛孔和少量的羧，它具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团基基团耐酸碱、耐去污剂、耐解离剂，甚至可用去污剂、盐酸胍或耐酸碱、耐去污剂、耐解离剂，甚至可用去污剂、盐酸胍或尿素溶液作洗脱剂尿素溶液作洗脱剂 多用于多用于蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖的分离纯化，也用于的分离纯化，也用于病毒颗粒病毒颗粒的分离的分离四、四、Sepha

14、crylSephacryl生物化学技术6凝胶过滤 由高交联度的琼脂糖与葡聚糖共价结合而成由高交联度的琼脂糖与葡聚糖共价结合而成特点：特点：具有良好的分子筛特性和理化具有良好的分子筛特性和理化稳定性稳定性。溶液的酸碱。溶液的酸碱度可在度可在pH3pH3 1212范围内变化；溶液中加入去污剂范围内变化；溶液中加入去污剂( (如如1 1SDS)SDS)和和( (或或) )解离剂解离剂( (如如8 8mol/Lmol/L尿素、尿素、6 6mol/Lmol/L盐酸胍盐酸胍) )时，也不会时，也不会影响分离效果影响分离效果 五、五、SuperdexSuperdex生物化学技术6凝胶过滤SuperoseSu

15、perose：高交联度的多孔琼脂糖珠高交联度的多孔琼脂糖珠玻璃珠：玻璃珠：有大量的网孔，且分布均一。机械性能良好，有大量的网孔，且分布均一。机械性能良好，在较高的层析流速下，分辨率并不受影响，其在较高的层析流速下，分辨率并不受影响，其缺点缺点是对蛋是对蛋白质等物质有白质等物质有吸附吸附能力能力聚苯乙烯凝胶聚苯乙烯凝胶五、其五、其 他他生物化学技术6凝胶过滤第二节第二节 基本原理基本原理生物化学技术6凝胶过滤一、基本原理一、基本原理 凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径较一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可完全或部分排径较一致，且呈珠

16、状颗粒的物质。这种物质可完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而小分子化合物则可以在阻某些大分子化合物于筛孔之外，而小分子化合物则可以在筛孔中自由扩散和渗透。某种组分凝胶层析柱中被排阻的程筛孔中自由扩散和渗透。某种组分凝胶层析柱中被排阻的程度用度用 表示表示avkotoeavVVVVk 洗脱体积；洗脱体积； 外水体积；外水体积； 凝胶床体积凝胶床体积eVoVtV 在一定层析条件下，在一定层析条件下， 和和 均为固定值，而均为固定值，而 随着被分离物分子量的随着被分离物分子量的变化而变化。组分分子量越大，则洗脱更容易（排阻越多），变化而变化。组分分子量越大，则洗脱更容易（排阻越多）， 越小，

17、越小， 越小越小tVoVeVeVavk生物化学技术6凝胶过滤 各组分间的各组分间的 值差异越大，分离效果越好；值差异越大，分离效果越好； 差异越小差异越小, ,则分离效果很差，或根本无法分离则分离效果很差，或根本无法分离 流出物用部分收集器等量或等时收集，检测后分段合并流出物用部分收集器等量或等时收集，检测后分段合并相同组分的各管流出物，得到分子量不同的各种组分相同组分的各管流出物，得到分子量不同的各种组分avkavk生物化学技术6凝胶过滤 1、当、当Kav=0时，则时，则Ve=Vo ，即对于根本，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质全排阻，不能进入凝胶内部的大分子物质全排阻，洗脱体积等于空

18、隙体积即外水体积（图洗脱体积等于空隙体积即外水体积（图中组分中组分） 2、当、当Kav=1时，时，Ve=Vo+Vi 。即小分子即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内水体积之和。空隙体积与内水体积之和。Ve=Vo+Vi （图中组分（图中组分） 生物化学技术6凝胶过滤3 3、当、当0 0K Kavav1 1时，时，V Ve e= =V Vo o+ + K Kavav（V Vi i V Vg g ）。）。表示固定相表示固定相中只有一部分可被组分扩散渗入，一部分被排阻，中只有一部分可被组分扩散渗入，一部分被排阻，V Ve e即在即在V Vo o与与V

19、Vo o+ +V Vi iV Vg g之间变化（图中组分之间变化（图中组分）4 4、有时、有时K Kavav1 1，表示凝胶对组分有吸附作用表示凝胶对组分有吸附作用 （从内水中从内水中洗脱出来的含量下降），此时洗脱出来的含量下降），此时V Ve eV Vo o+ +V Vi iV Vg g。例如一些芳例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在Sephadex Sephadex G-25G-25中的洗脱体积远超出理论计算的最大值中的洗脱体积远超出理论计算的最大值生物化学技术6凝胶过滤二、二、 值的测定值的测定avkotoeavVVVVk只要测出只要

20、测出 、 和和 ，即可计算出，即可计算出 值值 eVoVtVavktV 的测定：的测定：（1 1）计算法：）计算法： （2 2）测定法：）测定法：hRVt2itiggitVVVVVVVVV00相比可忽略，故与由于生物化学技术6凝胶过滤 的测定：的测定：用蓝色的葡聚糖用蓝色的葡聚糖20002000（M=200M=200万），在万），在SephadexSephadex中被完全排阻，并借助其本身的颜色，采用肉中被完全排阻，并借助其本身的颜色，采用肉眼或分光光度计检测（眼或分光光度计检测（210210、260260或或620nm620nm）洗脱体积）洗脱体积 的测定：的测定：用用 、N-N-乙酰酪氨酸

21、或其他小分子乙酰酪氨酸或其他小分子物质作为洗脱对象。由于分子量小，且无吸附，故洗脱物质作为洗脱对象。由于分子量小，且无吸附，故洗脱体积刚好是体积刚好是 （ =1=1） 当分子大小在凝胶孔径的上、下限之间时，则当分子大小在凝胶孔径的上、下限之间时，则 介于介于 和和 之间（即之间（即 =0 =0 1 1） oVoV424)(SONHtVtVavkeVoVtVavk生物化学技术6凝胶过滤生物化学技术6凝胶过滤第三节第三节 操操 作作生物化学技术6凝胶过滤（一）凝胶的选择（一）凝胶的选择 1.1.型号：型号：凝胶型号不一样，筛分范围亦不相同凝胶型号不一样，筛分范围亦不相同如：如：Sephadex G

22、 Sephadex G 型多用于分离蛋白质；型多用于分离蛋白质； 生物胶和生物胶和 SephacrylSephacryl等多用于分离核酸；等多用于分离核酸； 要除去蛋白质中的盐类，多用要除去蛋白质中的盐类，多用Sephadex G-25Sephadex G-252.2.粒度：粒度：粒度与交联度无关。与粗颗粒相比，细颗粒凝胶粒度与交联度无关。与粗颗粒相比，细颗粒凝胶之间空间小，装柱易均匀，分离效果好，但流速慢；而粗之间空间小，装柱易均匀，分离效果好，但流速慢；而粗颗粒凝胶流速快，宜用小颗粒直径的层析柱颗粒凝胶流速快，宜用小颗粒直径的层析柱 一、凝胶的选择与处理一、凝胶的选择与处理生物化学技术6凝

23、胶过滤生物化学技术6凝胶过滤（二）凝胶用量计算（二）凝胶用量计算 膨胀度）干凝胶用量（hrg2 由于凝胶在处理过程中会有一部分损失，故用此法计算由于凝胶在处理过程中会有一部分损失，故用此法计算出的凝胶用量需增加出的凝胶用量需增加101020%20%生物化学技术6凝胶过滤（三）凝胶的处理（三）凝胶的处理 将所用的干胶置于将所用的干胶置于5 51010倍量的倍量的D.WD.W中，充分浸泡（表中，充分浸泡（表6-26-2溶胀时间），用倾斜法去除表面悬浮的小颗粒，再用溶胀时间），用倾斜法去除表面悬浮的小颗粒，再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl0.5mol/LNaOH-0.5mol/

24、LNaCl室温浸泡室温浸泡0.5h0.5h，抽滤除去碱液，抽滤除去碱液，用用D.WD.W洗至中性。再用抽气方法以洗至中性。再用抽气方法以D.WD.W或平衡液除去凝胶颗或平衡液除去凝胶颗粒之间的气泡粒之间的气泡生物化学技术6凝胶过滤1 1柱子的选择柱子的选择当直径相同时，柱长长者比柱长短者分辨率高当直径相同时，柱长长者比柱长短者分辨率高柱长相同时，直径大者比小者分辨率高柱长相同时，直径大者比小者分辨率高床体积相同时，柱长长者比短的分辨率高床体积相同时，柱长长者比短的分辨率高一般理想的层析柱直径与长度之比是一般理想的层析柱直径与长度之比是1 1：25251 1：100100；层析；层析柱外面最好有

25、夹套，柱外面最好有夹套，能控制温度（柱温箱）能控制温度（柱温箱） ，以保证结果的，以保证结果的重复性重复性 2 2装柱：装柱：常用湿装法（第三章）常用湿装法（第三章）3 3凝胶柱的鉴定凝胶柱的鉴定 二、凝胶柱的制备二、凝胶柱的制备生物化学技术6凝胶过滤流速、柱长对分离的影响流速、柱长对分离的影响 生物化学技术6凝胶过滤 加样量与层析柱床体积及检测方法的灵敏度有关。床体加样量与层析柱床体积及检测方法的灵敏度有关。床体积越小、方法灵敏度越高时，加样量越少积越小、方法灵敏度越高时，加样量越少 层析的目的在于分析时，加样量占床体积的层析的目的在于分析时，加样量占床体积的12 ，作，作制备、脱盐用时，占

26、制备、脱盐用时，占2030 一般来说，加样量越少，分辨率越高。具体加样体积由一般来说，加样量越少，分辨率越高。具体加样体积由分配系数分配系数(Kav)或洗脱体积或洗脱体积(Ve)来决定来决定三、加样与洗脱三、加样与洗脱（一）加（一）加 样样生物化学技术6凝胶过滤生物化学技术6凝胶过滤 V VeAeA、V VeBeB：组分组分A A、B B的洗脱体积的洗脱体积 K KavAavA、K KavBavB：组分：组分A A、B B的分配系数的分配系数 V Vs s：A A、B B两组分的洗脱体积之差（又称为分离体积）两组分的洗脱体积之差（又称为分离体积）V Vs s= V= VeA eA V VeBe

27、B当样品体积当样品体积V Vp pV Vs s时，理论上的洗脱图形是两种物质恰好分开时，理论上的洗脱图形是两种物质恰好分开( (图图中中)。但由于样品流过柱时的扩散作用，其体积会逐渐增大，致使其。但由于样品流过柱时的扩散作用，其体积会逐渐增大，致使其洗脱体积远比原来大洗脱体积远比原来大加样量（加样量（V Vp p）的确定）的确定生物化学技术6凝胶过滤 图图、 中中A A、B B两种物质有一定程度的交叉，这表明两种物质有一定程度的交叉，这表明二者只是部分分开。因此，当二者只是部分分开。因此，当V Vp p等于或大于等于或大于V Vs s时，时，A A、B B两种两种物质就不能完全分开物质就不能完

28、全分开( (图中图中) 当当V Vp pV Vs s时，时，A A、B B两种物质就能分开两种物质就能分开( (图中图中) ) 根据根据 V Ve e = V = Vo o + K + Kavav（V Vt t V Vo o） 又又 V Vs s = V= VeAeAV VeB eB = = （ K KavAavAK KavB avB ）（）（V Vt t V Vo o）生物化学技术6凝胶过滤 V Vs s = = （ K KavAavAK KavB avB ）（）（V Vt t V Vo o） = = （ K KavAavAK KavB avB ）（）（V Vi i +V +Vg g） A

29、A、B B两种物质能分开的最低限：两种物质能分开的最低限：V Vp pV Vs s最大最大V Vs s时的必要条件：时的必要条件：K KavAavAK KavB avB 最大，为最大，为1 10 01 1 V Vi i +V +Vg g最大，一般为最大，一般为V Vt t/2/2则：则：最大理论加样量最大理论加样量V Vp pV Vs sV Vt t/2/2最大理论加样量的计算最大理论加样量的计算生物化学技术6凝胶过滤 为提高分离效果，除了缩小加样体积以外，样品的为提高分离效果，除了缩小加样体积以外，样品的黏度也一般以小于黏度也一般以小于2 2cp(cp(厘帕，厘帕，P= N/mP= N/m2

30、 2s s) )，或者与洗或者与洗脱液的黏度相当为宜脱液的黏度相当为宜 葡聚糖使粘度上升葡聚糖使粘度上升 黏度的影响黏度的影响生物化学技术6凝胶过滤粘度对柱层析的影响粘度对柱层析的影响 生物化学技术6凝胶过滤1.1.洗脱液的选择原则洗脱液的选择原则 能溶解被洗脱物质而又不使其变性或失活能溶解被洗脱物质而又不使其变性或失活 一般以单一缓冲液（如一般以单一缓冲液（如PBSPBS、Tris-HClTris-HCl缓冲液等）或盐溶液，缓冲液等）或盐溶液，有时甚至用有时甚至用D.WD.W作为洗脱液作为洗脱液 2.2.洗脱速度洗脱速度 若流速不均匀，收集的每一部分洗脱体积不恒定，若流速不均匀，收集的每一部

31、分洗脱体积不恒定，K Kavav就难以就难以确定确定 最好的装置是最好的装置是恒流泵恒流泵( (微量泵、蠕动泵微量泵、蠕动泵) )，可以使流速在较大，可以使流速在较大范围内恒定。若无此装置，可用控制操作压的办法进行，其装范围内恒定。若无此装置，可用控制操作压的办法进行，其装置可使用恒压瓶置可使用恒压瓶 一般，洗脱速度慢，分离效果就好；但若太慢，由会因扩散一般，洗脱速度慢，分离效果就好；但若太慢，由会因扩散加剧而影响分离效果加剧而影响分离效果( (二二) )洗洗 脱脱生物化学技术6凝胶过滤。生物化学技术6凝胶过滤Sephadex G-50Sephadex G-50及其以下（交联度大）的流速与操作

32、压及其以下（交联度大）的流速与操作压之间的关系遵守之间的关系遵守DarcysDarcys规律规律LPKuu u：线性流速：线性流速( (ml/cmml/cm2 2h)h)K K：常数：常数( (粗、中、细颗粒的各不相同粗、中、细颗粒的各不相同) )P P：操作压：操作压( (cp)cp)L L：柱长柱长流速与操作压流速与操作压生物化学技术6凝胶过滤LPKuo K Ko o仅与凝胶的性质有关，而与柱子直径基本无关。仅与凝胶的性质有关，而与柱子直径基本无关。 但是但是G-75G-75以上各种型号交联葡聚糖的流速还与柱直径以上各种型号交联葡聚糖的流速还与柱直径大小有关大小有关 当洗脱液的黏度为当洗脱

33、液的黏度为lcplcp时的表达式时的表达式生物化学技术6凝胶过滤生物化学技术6凝胶过滤 一般，洗脱流速慢，则分离效果就好；但太慢又会因扩一般，洗脱流速慢，则分离效果就好；但太慢又会因扩散加剧而影响分离效果散加剧而影响分离效果生物化学技术6凝胶过滤四、凝胶柱的再生及保存四、凝胶柱的再生及保存（一）再生（一）再生 使用过一次或几次的凝胶柱，通常用使用过一次或几次的凝胶柱，通常用3 34 4倍床体积的洗倍床体积的洗脱液冲洗，再用平衡液平衡即可；但使用过多次后，凝胶脱液冲洗，再用平衡液平衡即可；但使用过多次后，凝胶床体积变小、流动速度下降、杂质过多床体积变小、流动速度下降、杂质过多等，其处理方法是等，

34、其处理方法是 先用水反复进行逆向冲洗（反冲），再用缓冲液进行先用水反复进行逆向冲洗（反冲），再用缓冲液进行平衡；平衡； 把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行处理，然后重新装柱处理，然后重新装柱生物化学技术6凝胶过滤膨胀状态膨胀状态 即在水相中保存。可加入即在水相中保存。可加入0.02%0.02%的叠氮钠（的叠氮钠（NaNNaN3 3）溶液等溶液等防腐剂或加热灭菌后于低温短时间保存。防腐剂或加热灭菌后于低温短时间保存。 一般不用氯仿、丁醇、甲苯等为防腐剂。因为它们能引一般不用氯仿、丁醇、甲苯等为防腐剂。因为它们能引起凝胶颗粒的收缩，同时还能

35、进入层析仪器的塑料部件，使起凝胶颗粒的收缩，同时还能进入层析仪器的塑料部件，使塑料变软，造成不良后果塑料变软，造成不良后果（二）保（二）保 存存生物化学技术6凝胶过滤生物化学技术6凝胶过滤半收缩状态：半收缩状态： 用完后水洗净，然后再用用完后水洗净，然后再用60% 60% 70% 70%乙醇洗，则凝胶乙醇洗，则凝胶体积缩小，于低温较长时间保存体积缩小，于低温较长时间保存干燥状态：干燥状态： 用水洗净后，加入含乙醇的水洗，并逐渐加大含醇量，用水洗净后，加入含乙醇的水洗，并逐渐加大含醇量，最后用最后用95%95%乙醇洗，则凝胶脱水收缩，再用乙醚洗去乙醇，乙醇洗，则凝胶脱水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽

36、滤至干，于抽滤至干，于60608080烘干后长时间保存烘干后长时间保存不脱水而直接烘干会黏结成块不脱水而直接烘干会黏结成块生物化学技术6凝胶过滤第四节第四节 应应 用用生物化学技术6凝胶过滤原理：原理：盐类小分子物质进入凝胶筛孔，而大分子物质则被盐类小分子物质进入凝胶筛孔，而大分子物质则被排阻在外排阻在外（分子筛原理）（分子筛原理）优点：优点：与透析相比，速度快，不会引起大分子物质变性与透析相比，速度快，不会引起大分子物质变性材料：材料：细颗粒葡聚糖凝胶细颗粒葡聚糖凝胶G-25G-25 一、脱盐和浓缩一、脱盐和浓缩生物化学技术6凝胶过滤分离对象：分离对象：溶解度、带电性等理化性质相似而分子质量

37、不溶解度、带电性等理化性质相似而分子质量不 同，或者是聚合度不等的混合物溶液同，或者是聚合度不等的混合物溶液实例：实例：Sephadex G-200Sephadex G-200层析纯化层析纯化AFPAFP 制备制备Ag-AbAg-Ab复合物复合物 溶于少量溶于少量0.1mol/L Gly-HCl0.1mol/L Gly-HCl缓冲缓冲液中，并用本液透析液中，并用本液透析2h 2h 上上Sephadex G-200Sephadex G-200柱柱 得得AFPAFP峰峰 置置0.1mol/L0.1mol/L柠檬酸柠檬酸- -磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH4.8pH4.8）透析）透析 上柱洗脱上柱洗脱

38、 AFPAFP纯品纯品二、分离生命物质二、分离生命物质生物化学技术6凝胶过滤生物化学技术6凝胶过滤生物化学技术6凝胶过滤热源物质：热源物质：指微生物产生的指微生物产生的分子量很大分子量很大的某些多糖蛋白复的某些多糖蛋白复 合物等，能使人体发热的物质合物等，能使人体发热的物质材料：材料：Sephadex G-25Sephadex G-25（8080120120目目 ） 特点：特点：比活性炭吸附、离子交换吸附等方便比活性炭吸附、离子交换吸附等方便 实例：实例：用用Sephadex G-25Sephadex G-25凝胶层析除去氨基酸粗品中的热源凝胶层析除去氨基酸粗品中的热源质：利用热源（大分子蛋白类）的质：利用热源（大分子蛋白类）的K Kavav=0=0，而氨基酸的，而氨基酸的K Kavav11，将试剂量控制在柱体积的将试剂量控制在柱体积的202030%30%，能实现完全分离，能实现完全分离三、去热源物质三、去热源物质生物化学技术6凝胶过滤 原理：原理： Kav = b lgM + c 或或lgM = adKav