《菌种操作规程》ppt课件

1、菌种操作规程Master Operation Procedure for ARA Production StrainCA/WA0012004版 1目的目的 建立菌种操作规程，确保菌种保藏、自然选建立菌种操作规程，确保菌种保藏、自然选育、消费供种操作规范性，提供优质高产的育、消费供种操作规范性，提供优质高产的消费菌种。消费菌种。2 范围范围 消费一部菌种组。消费一部菌种组。3 责任责任 菌种组操作人员担任本操作规程的实施。菌种组操作人员担任本操作规程的实施。安瓿管的制备安瓿管的制备 空白安瓿管的制备安瓿管有三种：手榴弹形、球形、直形。恣意选取一种放于重铬酸钾-浓硫酸溶液100g/mL中浸泡10h

2、，然后取出用自来水反复冲洗多次，最后用蒸馏水洗二次，烘干。将写有菌种编号及制备膜的标签放入安瓿管内，将有字的一面向管壁，塞上棉塞，121灭菌1小时。脱脂牛奶的制备 将买来的新颖牛奶倒入离心管中以3000转/分别心15分钟，去掉上层的脂，下层即为脱脂牛奶。脱脂好的牛奶倒入试管18200mm或250mL三角瓶中，置消毒锅中灭菌，灭菌温度110、时间20分钟。按10%的抽样率抽取灭菌好的脱脂牛奶作无菌实验，每支肉汤倒入约1mL左右的牛奶。然后置37恒温间培育48h察看肉汤变化情况，断定能否染菌，如无染菌，即可运用。孢子悬浮液的制备 将经过摇瓶调查目的符合要求对照的斜面孢子，制成高浓度的孢子悬浮液，用

3、无菌的毛细吸管或注射器将菌液分装于安瓿管底部，每管装0.30.5mL 预冻及速冻 灌装好的安瓿管置25冰箱预冻1h，然后置-30温度下速冻1h后取出，置真空枯燥器内。真空枯燥 将装在安瓿管的真空枯燥器接入真空泵上，在-15温度下，抽真空68h。然后再在室温抽4h。封口 将抽好的安瓿管在酒精喷灯上进展熔封边抽真空边封口。安瓿管的走漏测定 用高频火花测定仪进展测定。测定方法：将测定仪照着安瓿管管壁打一枪，假设各壁呈紫色的光即为合格，假设没有颜色，呈白光，即是不合格产品。保藏 合格安瓿管置25冰箱保藏，保藏期为110年。记录 安瓿管在保藏过程中应控制温度，每天查看温度并填写，在运用过程中应填写。砂土

4、管的制备砂土管的制备 砂的处置 普通黄沙用稀酸1N的HCL或H2SO4或稀碱1NNaOH浸泡12小时后,倒去酸水，用自来水充分冲洗至PH中性，烘干后用磁铁吸去铁屑，经60目筛过筛后备用。土的处置 取离地面1公尺以下的黄土，不含有机质打碎，加适量水充分搅拌，将上层混浊液倒出静置下层成块的土弃之使土沉淀，倒出上层清液后，再加适量水搅拌，沉淀。如此反复洗涤直到PH呈中性。沉淀出来的土烘干，碾碎，经80目筛过滤后备用 砂土管的制备 方法将处置好的沙和土按2：1(或其它比例)混合均匀，分装于10mm100mm硬质玻璃试管中，每支砂土管装量为1.5克，用新做的棉塞塞好，并外包牛皮纸，123125湿热灭菌3

5、0min，间歇灭菌6次，每隔24小时一次，最后一次消好后置145烘箱干烘一小时，然后进展抽样无菌检查，每10支砂管抽1支，将沙土倒入肉汤培育基中，3638培育48小时，假设仍有杂菌，那么需求全部重新灭菌，再作无菌实验，直至证明无菌，方可备用。砂土孢子的制备 斜面孢子的选择及质量规范 取经选育的单菌落制备的大试管斜面孢子或消费良好的茄氏瓶斜面孢子，具以下条件：孢子层生长丰满，较均匀，孢子数量较多，少水，孢子呈淡黄色。斜面孢子普通培育79天，孢子成熟。经无菌实验检查正常。发酵摇瓶实验消费才干符合要求。消费才干实验： 原那么上每批斜面孢子应作消费才干实验，尤其在大消费不正常情况下，为配合发酵工艺寻觅

6、异常缘由，每批斜面应作摇瓶调查。 7-9天 11天 斜面孢子 摇瓶发酵 放瓶目的要求： DW对照94%；TL对照94%；AA 45%，目的符合要求，方可运用，并填写和。消费斜面的制备消费斜面的制备 消费斜面消费斜面 分为子斜面和母斜面，其分为子斜面和母斜面，其PDA培育基配方如下：培育基配方如下：成分 马铃薯葡萄糖琼脂KH2PO4MgSO4配比20%2%2%0.05%0.025%规格自然分析纯生物试剂分析纯分析纯消费斜面消费斜面 选择无芽马铃薯去皮后用蒸馏水洗干净，称量所需分量，并切成边长0.5厘米左右的方形。将马铃薯碎块放在铝锅内，参与一定量的蒸馏水，置于电炉上煮沸30分钟，边煮边搅拌，防止

7、马铃薯结底。用双层纱布滤出马铃薯原液，然后按照配方将称量好的葡萄糖参与溶解，再用吸管汲取KH2PO4、 MgSO4溶液参与，用量筒定容至所需体积，PH自然。将定容后的培育液放置电炉上加热，将称量好的琼脂，边搅拌边参与，待琼脂全部融化后，取下培育基进展分装。母斜面用30200mm的大试管分装，每支大试管约20mL；子斜面用茄子瓶分装，每支约60mL，装好后，塞好棉塞，用双层纱布扎口后，再用牛皮纸扎口，放置在不锈钢筐中，盖上牛皮纸，预备消毒。将预备好的不锈钢筐放在消毒车上推入消毒柜内，按蒸汽消毒柜运用方法用蒸汽消毒，119121，保温30分钟，接种器具保温60分钟。消毒终了后，取出斜面待温度降至4

8、050时，将大试管或茄子瓶摆成斜面，空白斜面培育12天，察看无杂菌生长后，包装好备用，并填写和。母斜面接种及培育 母斜面接种由两人操作，一人为主操作安瓿管，一人为辅操作大试管。首先用消毒好的砂轮在安瓿管上端1/4处划痕，用纱布包住，掰开上端。用毛细吸管汲取0.5mL左右的无菌蒸馏水参与安瓿管中，搅拌均匀，然后汲取0.10.2mL接入大试管斜面中，每支安瓿管接3支大试管。用无菌铲将种液在斜面上划线，使之均匀分布，然后塞上棉塞，用双层纱布扎口，并将接种铲在肉汤培育基中蘸一下做无菌实验，将肉汤放置37培育间培育。将接种后的母斜面放置培育间，温度28，湿度5070%，培育79天，察看生长情况，并填写和

9、。母斜面生长成熟后，取下，无菌实验正常那么用0.1%新洁而灭溶液灭菌后再用牛皮纸扎口后放置冰箱低温保藏备用温度28，保藏期不超越15天；无菌实验不正常那么按废样液处置方法处置并填写。子斜面接种及培育 子斜面接种由两人操作，一人为主操作，一人为辅操作。首先将子斜面和母斜面的双层纱布解去，将绳子和纱布放在超净台左边待用。主操作将母斜面和子斜面的棉塞逐个翻开，并在酒精灯火焰上烧瓶口至无水雾为止。主操作用无菌铲将母斜面上的孢子和菌丝刮下，接种于子斜面中，利用子斜面的冷凝水，将孢子和菌丝打散，均匀涂布于子斜面外表，然后塞上棉塞，用双层纱布扎口，并将接种铲在肉汤培育基中蘸一下做无菌实验，将肉汤放置3638

10、培育间培育。一支母斜面接种普通接12支子斜面。将接种后的子斜面放置培育间，温度28，湿度5070%，培育79天，察看生长情况，并填写和。子斜面生长成熟后，取下，无菌实验正常那么用0.1%新洁而灭溶液灭菌后再用牛皮纸扎口后放置冰箱低温保藏备用，保藏期不超越15天；无菌实验不正常那么按废样液处置方法处置并填写。母瓶菌丝的制备母瓶菌丝的制备 母瓶培育基配方 成 份葡萄糖酵母粉PH配 比3%1.5%8.28.8规 格分析纯符合酵母粉验收规范 配制称量时，普通将不溶或难溶物质如酵母粉等和易溶解物分开称，根据母瓶培育基配方称取所需葡萄糖和酵母粉分量，葡萄糖用蒸馏水溶解，酵母粉直接按配比分装于三角瓶内。定容

11、后用10N的NaOH调理PH至8.28.8，按每瓶100mL的量分装于500mL直口三角瓶内，塞好棉塞，用双层纱布扎口后，再用牛皮纸扎口，放置在不锈钢筐中，盖上牛皮纸，预备消毒。将预备好的不锈钢筐放在消毒车上推入消毒柜内，按蒸汽消毒柜运用方法用蒸汽消毒，119121，保温30分钟，接种器具保温60分钟并填写和。母瓶接种及培育母瓶接种及培育 母瓶接种由两人操作，一人为主操作子斜面，一人为辅操作母瓶，主操作用接种铲取孢子于茄氏瓶中，一支铲子只能用于一只子斜面，将35支子斜面的孢子接入装有80mL无菌水的带玻璃珠三角瓶中，放置摇床上180220转/分钟摇1015分钟制成孢悬液。用10mL吸管汲取5m

12、L孢悬液接种于母瓶，接种后塞上棉塞，包扎纱布，置180220转/分摇床上，281培育4450小时左右，待菌丝长好后取下，预备并瓶。并瓶前应按5%的比例对母瓶进展抽查，察看菌丝的外观，测定菌浓和PH，并进展镜检，合格后才可并瓶。母瓶进罐前，要在无菌条件下并瓶，普通情况下1012瓶合并为一个种瓶，约1000200mL。 种瓶并好后，将瓶口包扎纱布和牛皮纸，等待进罐，假设母瓶不进罐，并瓶后应置于28冰箱保管，期限不超越2天。并瓶后，每五个三角瓶残液并为一瓶，接种于肉汤培育基中做无菌实验；在接种小罐后将种瓶中的残液接种于肉汤培育基中做无菌实验，将肉汤培育基放置3638培育间培育，察看变化情况，作为一种

13、无菌监测，为事后分析作预备。在发酵程度出现延续异常时，应对母瓶摇瓶进展跟踪实验。母瓶菌丝质量规范母瓶菌丝质量规范 外观 浅黄色至棕黄色、刺球状或花状。菌浓 不小于25%。菌丝阶段 阶段。PH 5.57.0。镜检 没有污染杂菌。小罐接种操作小罐接种操作 本工艺采用菌丝进罐和倾倒式接种法。接到消毒人员通知后接种。首先预备好无菌石棉手套、白任务服和帽，再预备好工业酒精、火焰圈和打火机。接种人员穿好衣服后，一人将浸泡工业酒精的火焰圈套在小罐接种口上，一人拆开种瓶包扎的牛皮纸和纱布，待消毒人员通知后点燃火焰圈，熄灭一分钟左右，当接种帽旋下后，在火焰圈内迅速翻开种瓶棉塞，将种液倾倒入小罐内，剩余种液在超净

14、台接种肉汤培育基，作无菌监测，接种终了后填写和。摇瓶实验摇瓶实验 发酵摇瓶配方发酵摇瓶配方 发酵摇瓶配制发酵摇瓶配制 发酵摇瓶接种操作发酵摇瓶接种操作 发酵摇瓶配方发酵摇瓶配方 成分葡萄糖酵母粉PH配比8%2%8.28.8规格符合验收规范符合验收规范发酵摇瓶配制发酵摇瓶配制 称量时，普通将不溶或难溶物质如酵母粉等和易溶解物分开称，根据发酵摇瓶培育基配方称取所需葡萄糖和酵母粉分量，葡萄糖用自来水溶解，酵母粉直接按配比分装于三角瓶内。定容后用10N的NaOH调理PH至8.28.8，按每瓶100mL的量分装于500mL翻口三角瓶内，塞好公用夹心纱布，用牛皮纸扎口，放置在不锈钢筐中，盖上牛皮纸，预备消

15、毒。将预备好的不锈钢筐放在消毒车上推入消毒柜内，按蒸汽消毒柜运用方法用蒸汽消毒，119121，保温30分钟，接种器具保温60分钟并填写和。发酵摇瓶接种操作发酵摇瓶接种操作 发酵摇瓶接种由两人操作，一人为主操作子斜面，一人为辅操作摇瓶，主操作用接种铲取孢子于茄氏瓶中，一支铲子只能用于一只子斜面，将35支子斜面的孢子接入装有80mL无菌水的带玻璃珠三角瓶中，放置摇床上摇1015分钟制成接种后将摇瓶瓶口纱布扯平扎紧，置180220转/分摇床上，281湿度50% 70%的条件培育11天后，下摇瓶测生物量、总油和AA的含量并填写。菌种选育和复壮菌种选育和复壮 自然分别自然分别 初筛、复筛初筛、复筛 自然

16、分别自然分别每年进展一次。先将菌株作分别培育，每年进展一次。先将菌株作分别培育，挑出假设干个单孢子菌落，将这些菌挑出假设干个单孢子菌落，将这些菌落初筛和复试，选出比出发菌株高产落初筛和复试，选出比出发菌株高产的优良菌株的优良菌株 孢子悬浮液制备：取斜面孢子于适量的有玻璃珠的无菌水的三角瓶中，放置小摇床上，时间普通为15分钟即可。分别培育基为马铃薯培育基PDA。在灭菌好的培育皿内，参与约15mL灭菌好的马铃薯培育基，置程度凝固后，一支1mL无菌吸管从孢子悬浮液中汲取1mL注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混和，然后用一支1mL无菌吸管从此试管中汲取1mL注入另一盛有9mL无菌水的试管

17、中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4 、10-5各种稀释度的孢子悬浮液注：稀释液最好提早预备，空白培育12天为好。将上述各种稀释度的溶液按照10-1、10-2、10-3、10-4 、10-5的顺序，用无菌的涂棒在培育基外表悄然地涂布均匀。将其放于281，温度50%70%的恒温间培育48小时左右，待菌落长好后挑出假设干个单孢子菌落接于斜面上，待斜面长好后，要进展摇瓶调查，初筛结果好的斜面用于消费埋砂土管，假设初筛不好，需复筛，直到选出比出发菌株高产的菌株 初筛、复筛初筛、复筛 由单孢子菌落接种的斜面孢子 摇瓶发酵 下摇瓶测试DW、TL、AA、以母株作对照选出较高菌落将其斜面埋砂

18、土 复筛每株用三个摇瓶、反复三次最后选出比出发菌株高的菌株作消费菌种，或是选出一个较高的新变种作进一步选育之用。废液样处置方法废液样处置方法 菌种废母瓶、废悬浮液，化验样余样，菌种察看菌丝及测PH多余发酵液等均不得直接倒入下水道，必需升温至100左右煮沸30分钟后，再放入下水道并填写。染色剂的配制染色剂的配制 美兰亚甲苯基兰，一种碱性染料 取0.3克美兰溶于30mL 95%酒精中，再加蒸馏水至100mL过滤即得。酚红配制 方法一：称取1克酚红于研钵中，用0.05N氢氧化钠调成糊状，研磨，再分次参与氢氧化钠溶液总量为57mL研磨，充分溶解后，加蒸馏水至100mL，过滤即成。 方法二：称取1克酚红

19、于研钵中，用43mL的95%的酒精溶解后，再次参与总量为57mL的0.05N氢氧化钠，待其充分溶解后，过滤即成。碳酸品红染色剂 碱性品红酒精饱和液：品红1克、溶于9mL 95%酒精 5%石碳酸溶液：石碳酸4.5克，溶于90mL蒸馏水中 两种溶液混合，搅匀，过滤即得。消毒剂配制消毒剂配制 1.52.0%来苏尔溶液：150200mL来苏尔加蒸馏水至10000mL。75%酒精：95%酒精79mL加蒸馏水至100mL。甲醛熏烟：40%甲醛50mL，高锰酸钾20克盛于牛皮纸中包好，带入无菌室混合，紧闭无菌室经12天后，借送风设备将甲醛高锰酸钾气体排出。丙二醇50mL加热熏烟灭菌。0.1%新洁尔灭菌溶液：

20、1mL新洁尔溶液加蒸馏水至1000mL。1%2%来苏尔溶液：将10%的来苏尔溶液稀释510倍。重铬酸钾浓硫酸100g/mL洗液配制：称取化学纯重铬酸钾100g于烧杯中，参与100mL蒸馏水，微加热，使其溶解。把烧杯放于水盆中冷却后，渐渐参与化学纯硫酸，边加边用玻璃棒搅拌，防止硫酸溅出，开场有沉淀析出，硫酸加到一定量沉淀可溶解，加硫酸至溶液总体积为1000mL 细菌培育基细菌培育基 肉汤培育基 固体培育基 肉汤培育基配制 配方 成分葡萄糖牛肉膏氯化钠 蛋白胨酚红配 比0.5%1%0.5%0.5%0.4%规 格分析纯生物试剂 分析纯 生物试剂 分析纯配制 为了称量方便，普通称牛肉膏时放玻璃棒，其它成分分别加适量的蒸馏水溶解之，混合后加足水量，再加酚红溶液，搅拌均匀，用10N的氢氧化钠调PH到7.007.40。分装 将配制好的肉汤培育基分装于18180mL试管中，装量每支约为8mL，塞棉塞，装入有牛皮纸的不锈钢筐中。消毒 在0.1MPa蒸汽压力，119121下灭菌30分钟，灭菌后置3638恒温室培育24小时后检查无杂菌生长，溶液清亮无沉淀，消后PH为7.0左右，每批运用期不超越7天，和。固体培育基配制 配