《酶组织化学应用》ppt课件

1、 酶组织化学酶组织化学 -水解酶及氧化复原水解酶及氧化复原酶酶 组织化学原理及方法组织化学原理及方法组织化学组织化学 狭义 运用化学和物理学原理在组织切片上，参与某种试剂使其与组织切片中欲检测的物质发生反响，最终构成有色沉淀，在显微镜下察看，以研讨组织细胞构造与功能之间的关系。1. 根本原理根本原理 细胞内的酶催化分解适宜的底物，生成中间产物即初级反响产物 然后其中之一再与辅助物或捕捉剂反响，生成有色不溶性的终反响产物 该反响产物堆积在原位，以显示酶的存在显示酶的组织化学方法显示酶的组织化学方法1.金属沉淀法：磷酸酶的显示金属沉淀法：磷酸酶的显示 甘油磷酸钠甘油磷酸钠 磷酸酯磷酸酯+铅铅 磷酸

2、磷酸铅铅 硫化铅硫化铅2.偶氮偶联法：显示各种酶类最重要的方偶氮偶联法：显示各种酶类最重要的方法法 酸性磷酸酶酸性磷酸酶底物底物 酶酶初级反响产物初级反响产物-不易分散不易分散重氮盐重氮盐 最终反响产物最终反响产物-呈色呈色偶氮偶联法偶氮偶联法 Gomori萘酚磷酸酯法萘酚磷酸酯法-AKP在碱性条件下将在碱性条件下将-萘基磷萘基磷酸钠水解出酸钠水解出-萘酚萘酚, 随后随后-萘酚与固蓝萘酚与固蓝B盐在酶活性部位盐在酶活性部位偶联偶联, 构成紫红至紫黑色的不溶性沉淀构成紫红至紫黑色的不溶性沉淀【孵育液】【孵育液】 -萘基磷酸钠萘基磷酸钠, 蒸馏水蒸馏水, 5%四硼酸钠四硼酸钠, 10%硫硫酸镁酸镁

3、, 固蓝固蓝B盐盐 六偶氮对品红与六偶氮对品红与-萘酚偶联萘酚偶联-以萘酚以萘酚AS-BI磷酸酯或磷酸酯或萘酚萘酚AS-TR磷酸酯与六偶氮对品红。偶联人工合成的磷酸酯与六偶氮对品红。偶联人工合成的磷酸萘酚盐经碱性磷酸酶水解后释放出萘酚，后者立刻磷酸萘酚盐经碱性磷酸酶水解后释放出萘酚，后者立刻与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素【孵育液】萘酚【孵育液】萘酚AS-BI磷酸钠磷酸钠, 二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺(DMF)或二或二甲基亚砜甲基亚砜(DMSO), Tris-cl或巴比妥醋酸缓冲液或巴比妥醋酸缓冲液, 六偶氮对六偶氮对品红品红 【操作步骤】【操作步骤】1.小块组织液氮

4、骤冷小块组织液氮骤冷, 低温冰箱切片低温冰箱切片2. 甲醛钙液甲醛钙液(Fca)固定固定5分钟分钟, 4, 然后蒸馏水洗然后蒸馏水洗, 也可也可不固定不固定3. 作用液作用液560分钟分钟, 37或室温或室温4. 蒸馏水洗蒸馏水洗5. 4%甲醛固定甲醛固定15分钟分钟2小时小时, 室温室温6. 自来水洗自来水洗, 蒸馏水洗蒸馏水洗7. 1%甲基绿甲基绿(氯仿洗过氯仿洗过)510分钟分钟, 蒸馏水洗蒸馏水洗8. 甘油明胶封片甘油明胶封片, 或丙酮或丙酮-丙酮甲苯丙酮甲苯-DPX封固封固【结果】酶活性处出现红色无定形的沉淀【结果】酶活性处出现红色无定形的沉淀, 核呈蓝绿核呈蓝绿色色 酶的种类酶的种

5、类 1. 氧化复原酶 2. 转移酶 3. 水解酶 4. 裂合酶 5. 异构酶 6. 合成酶水解酶水解酶-一类添加或去除水，催化水解反响的酶一类添加或去除水，催化水解反响的酶 AB+H2O AH+BOH一碱性磷酸酶一碱性磷酸酶alkaline phosphatase，AKP 又称碱性磷酸单酯酶又称碱性磷酸单酯酶EC3.1.3.1 在碱性环境下催化多种醇和酚的磷酸酯水解在碱性环境下催化多种醇和酚的磷酸酯水解 最适最适PH 9.29.4 激活剂激活剂: 如如Mg+, Mn+, 某些氨基酸等某些氨基酸等 抑制剂抑制剂: 氰化物、砷酸盐等氰化物、砷酸盐等 分布：广泛存在于机体组织，常见于具有活泼转分布：

6、广泛存在于机体组织，常见于具有活泼转运功运功 能的细胞膜内，如毛细血管及毛细血管动脉能的细胞膜内，如毛细血管及毛细血管动脉部分的内皮细胞，肾近曲小管刷状缘和肠上皮纹部分的内皮细胞，肾近曲小管刷状缘和肠上皮纹状缘状缘 运用：运用：1. 肝脏病、白血病的研讨诊断肝脏病、白血病的研讨诊断 2. 骨的发生和代谢疾病的研讨中骨的发生和代谢疾病的研讨中显示碱性磷酸酶的常用方法显示碱性磷酸酶的常用方法:1. 钙钴法钙钴法(Gomori-Takamatsu法法)【根本原理】【根本原理】甘油磷酸钠甘油磷酸钠 磷酸酯磷酸酯+Ca+ 磷酸钙磷酸钙 磷酸磷酸钴钴 硫化钴硫化钴【孵育液】【孵育液】2%巴比妥钠巴比妥钠,

7、 3%-甘油磷酸钠甘油磷酸钠, 2%无水无水氯化钙氯化钙, 5% 硫酸镁硫酸镁AKP 【操作步骤】 1. 新颖组织低温冰冻切片 2. 不固定切片直接进作用液, 或用1%氯化钙Formalin(Fca)固定5分钟2 小时, 4, 蒸馏水洗 3. 作用液1060分钟, 37 4. 蒸馏水洗 5. 2%硝酸钴1分钟 6. 蒸馏水洗 7. 12%硫化铵1分钟 8. 蒸馏水洗 9. 甘油明胶封片, 或脱水, 透明, 中性树胶封片【结果】碱性磷酸酶活性处有黑色的硫化钴沉淀肾曲管碱性磷酸酶肾曲管碱性磷酸酶-钙钴法钙钴法 X100肾曲管碱性磷酸酶肾曲管碱性磷酸酶-钙钴法钙钴法 X200 (二二)酸性磷酸酶酸性

8、磷酸酶(acid phosphatase, ACP) 在酸性条件下催化醇和酚类磷酸酯的水解在酸性条件下催化醇和酚类磷酸酯的水解 最适最适PH 为为4.85.2 抑制剂因组织差别而不同抑制剂因组织差别而不同: 酒石酸酒石酸, 氟化物氟化物, 0.5%甲醛甲醛 分布分布: 主要位于溶酶体内主要位于溶酶体内 运用运用: 前列腺癌和其他脏器的转移性前列腺癌前列腺癌和其他脏器的转移性前列腺癌(+) Hodgins淋巴淋巴, 胃癌胃癌, 肺癌肺癌, 乳腺癌等乳腺癌等(+) 尤文氏瘤尤文氏瘤, 成骨肉瘤等成骨肉瘤等(-)显示酸性磷酸酶的常用方法显示酸性磷酸酶的常用方法1. 酸性磷酸酶硝酸铅法酸性磷酸酶硝酸铅

9、法【根本原理】与碱性磷酸酶钙钴法的原理类似【根本原理】与碱性磷酸酶钙钴法的原理类似甘油磷酸钠甘油磷酸钠 磷酸酯磷酸酯+铅铅 磷酸铅磷酸铅 硫化硫化铅黑色铅黑色【孵育液】硝酸铅，巴比妥【孵育液】硝酸铅，巴比妥-硝酸盐缓冲液，硝酸盐缓冲液，-甘油磷甘油磷酸钠酸钠【结果】酸性磷酸酶活性处呈棕黑色【结果】酸性磷酸酶活性处呈棕黑色2. 同时偶联法同时偶联法【根本原理】【根本原理】ACP在酸性条件下水解萘酚在酸性条件下水解萘酚AS-TR磷酸磷酸酯为萘酚酯为萘酚AS-TR和磷酸和磷酸, 萘酚萘酚AS-TR和六偶氮对品红偶和六偶氮对品红偶联联, 在酶活性处构成红色的不溶性复合物在酶活性处构成红色的不溶性复合物

10、【孵育液】萘酚【孵育液】萘酚AS-TR磷酸酯磷酸酯, 六偶氮对品红六偶氮对品红ACP【操作步骤】【操作步骤】1. 新颖组织低温冰箱切片新颖组织低温冰箱切片2. 不固定或吹干后丙酮固定不固定或吹干后丙酮固定15分钟分钟3. 用孵育液置于用孵育液置于37水浴箱水浴箱12小时小时4. 流水洗流水洗, 晾干晾干(12分钟分钟)5. 用用Mayer苏木精或苏木精或1%甲基绿复染甲基绿复染6. 流水洗流水洗10分钟分钟7. 常规脱水透明常规脱水透明, 中性树胶封片中性树胶封片【结果】酸性磷酸酶活性处呈桔红色【结果】酸性磷酸酶活性处呈桔红色. 胞核兰色胞核兰色(苏木苏木精复染精复染)或绿色或绿色(甲基绿复染

11、甲基绿复染)涂片涂片-腹腔巨噬细胞腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶酸性磷酸酶 X400(三三) 5核苷酸酶核苷酸酶(5nucleotidase) 催化核糖核苷和脱氧核糖核苷在催化核糖核苷和脱氧核糖核苷在C-5位置水解位置水解磷酸酯的水解酶磷酸酯的水解酶 最适最适PH因组织而异。小鼠肾为因组织而异。小鼠肾为7.5, 睾丸、脑、睾丸、脑、肝分别为肝分别为8.5、7.58.5、8.0 激活剂：激活剂：Mg+，Mn + 抑制剂：氟化钠抑制剂：氟化钠0.1M NaF，硼酸钠，硼酸钠OHOHHOHOHHOHH碱基碱基(嘌呤、嘌呤、嘧啶嘧啶H+ H2O Pi5NaseHO-CH2OHHOHHOHHH碱基碱基CH2OP

12、HO5核苷酸酶存在于胞膜，为胞膜的标志酶核苷酸酶存在于胞膜，为胞膜的标志酶5核苷酸酶的显示核苷酸酶的显示-铅法铅法【根本原理】【根本原理】5Nase水解底物水解底物5单磷酸腺苷单磷酸腺苷AMP 磷酸磷酸+铅铅 磷酸铅磷酸铅 硫化铅硫化铅黑色黑色【留意】【留意】 5核苷酸酶在作用上和碱性磷酸酶类似核苷酸酶在作用上和碱性磷酸酶类似 5Nase AKP1. 肾组织中分布肾组织中分布 肾小管刷状缘肾小管刷状缘(+), 一切一切 仅肾小仅肾小管刷状缘管刷状缘(+) 基膜也基膜也(+)2. -甘油磷酸钠甘油磷酸钠 () (+)5Nase作为底物作为底物(四四) 葡萄糖葡萄糖-6-磷酸酶磷酸酶(glucos

13、e-6-phosphatase, G-6-p-酶酶) 肝细胞特有的功能性酶肝细胞特有的功能性酶, 分解糖原分解糖原, 维持血糖维持血糖浓度浓度, 是糖代谢的关键酶是糖代谢的关键酶 PH6时活性最强时活性最强, PH8时最稳定时最稳定, PH5时易变性时易变性 组化反响组化反响PH6.56.7 抑制剂抑制剂: 氟化物氟化物, 锌和氰离子锌和氰离子 酒精固定酒精固定, 石蜡包埋后石蜡包埋后, G6p酶被完全抑制酶被完全抑制; 经经甲醛固定而失活甲醛固定而失活 硝酸铅法显示硝酸铅法显示G6p酶酶:葡萄糖葡萄糖-6-p 葡萄糖葡萄糖+磷酸磷酸 磷酸铅磷酸铅 硫化铅硫化铅G6p酶酶(五五) 腺苷三磷酸酶

14、腺苷三磷酸酶又称又称ATP酶酶 ATP ADP + Pi + 能量能量 根据所用激活剂、抑制剂以及酶定位的不同，根据所用激活剂、抑制剂以及酶定位的不同，可分为三类可分为三类ATP酶酶1. 肌球蛋白腺苷三磷酸酶肌球蛋白腺苷三磷酸酶定位于骨骼肌定位于骨骼肌最适最适PH为为9.0 9.4被被Ca+激活激活, 而被而被Mg+抑制抑制常用作区分二型肌纤维常用作区分二型肌纤维: 型型(红肌红肌)-收缩慢收缩慢, 活动耐久活动耐久, 其酶活性其酶活性高高, 染色深染色深 型型(白肌白肌)-收缩快收缩快, 活动不耐久活动不耐久, 其酶活其酶活性低性低, 染色淡染色淡ATPase2. 膜性腺苷三磷酸酶膜性腺苷三

15、磷酸酶 又称钠又称钠-钾离子激活腺苷三磷酸酶钾离子激活腺苷三磷酸酶 最适最适PH7.2 7.5 激活剂激活剂: Mg+, Na +, K + 抑制剂抑制剂: Ca +, 苦毒毛旋花子甙苦毒毛旋花子甙 常存在于细胞膜常存在于细胞膜, 特别是分泌功能活泼的细胞膜。特别是分泌功能活泼的细胞膜。3. 线粒体腺苷三磷酸酶线粒体腺苷三磷酸酶 心肌最丰富，心肌最丰富， 肝脏次之肝脏次之 心肌的线粒体心肌的线粒体ATP酶被酶被Mg+激活，而被激活，而被Ca +抑制抑制q肝细胞线粒体肝细胞线粒体ATP酶可同时被酶可同时被Mg+、 Ca +激活激活q 心肌和肝的线粒体心肌和肝的线粒体ATP酶均可被对酶均可被对-氯

16、汞苯甲酸氯汞苯甲酸PCMB抑制抑制q 种类种类 定位定位 最适最适PH 激活剂激活剂 抑制剂抑制剂q肌球蛋白肌球蛋白ATP酶酶q膜性膜性ATP酶酶q线粒体线粒体ATP酶酶u 腺苷三磷酸酶的显示方法腺苷三磷酸酶的显示方法u 1. 镁激活的镁激活的ATP酶法酶法(铅法铅法): 在在ATP酶活性处酶活性处, 出出现棕黑色的硫化铅沉淀。主要用于显示膜性现棕黑色的硫化铅沉淀。主要用于显示膜性ATPase，也可示线粒体，也可示线粒体ATPaseu 2. 钙激活的钙激活的ATP酶法酶法(钙钴法钙钴法): 在在ATP酶活性处酶活性处, 出现黑色硫化钴沉淀。主要用于显示肌球蛋白出现黑色硫化钴沉淀。主要用于显示肌

17、球蛋白ATPase，区分红肌纤维和白肌纤维，区分红肌纤维和白肌纤维六非特异性酯酶六非特异性酯酶酯酶可分为三类酯酶可分为三类非特异性酯酶、脂酶、胆碱非特异性酯酶、脂酶、胆碱酯酶酯酶非特异性酯酶非特异性酯酶-水解短链脂肪酸的酯水解短链脂肪酸的酯脂酶脂酶-水解长链脂肪酸的酯水解长链脂肪酸的酯胆碱酯酶胆碱酯酶-水解胆碱的酯酶水解胆碱的酯酶 非特异性酯酶非特异性酯酶 最适最适PH 5.0 8.0 定位在溶酶体和内质网定位在溶酶体和内质网, 在肝、肾、胰和小肠具在肝、肾、胰和小肠具有较高的酶活性有较高的酶活性 运用运用-单核巨噬细胞、单核巨噬细胞、T淋巴、中性粒细胞都有非淋巴、中性粒细胞都有非特异性酯酶反

18、响特异性酯酶反响 1. 在急性白血病分类诊断时，非特异性酯酶含量多在急性白血病分类诊断时，非特异性酯酶含量多少、有无颗粒及颗粒大小，都有一定的诊断价值少、有无颗粒及颗粒大小，都有一定的诊断价值 2. 可作为可作为T、B淋巴细胞的鉴别淋巴细胞的鉴别显示非特异性酯酶法显示非特异性酯酶法-同时偶联法同时偶联法 用乙酸用乙酸-萘酯或萘酚萘酯或萘酚AS衍生物为底物，在酶作衍生物为底物，在酶作用下，释出用下，释出-萘酚，与固蓝萘酚，与固蓝B或六偶氮对品红偶联，或六偶氮对品红偶联，生成紫黑色或红棕色不溶的偶氮染料生成紫黑色或红棕色不溶的偶氮染料七胆碱酯酶七胆碱酯酶 乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶-神经组织、肌肉、

19、红细神经组织、肌肉、红细胞中胞中 胆碱酯酶胆碱酯酶-血浆中含量丰富血浆中含量丰富 显示乙酰胆碱酯酶的方法显示乙酰胆碱酯酶的方法Karnovsky-Rotts亚亚铁氰化铜法铁氰化铜法【根本原理】【根本原理】 碘化乙酰硫化胆碱碘化乙酰硫化胆碱 硫代胆碱硫代胆碱 + 乙酸乙酸 铁氰化钾铁氰化钾 亚铁氰化亚铁氰化钾钾 亚铁氰化亚铁氰化铜沉淀铜沉淀 乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶-SHCu+v 氧化复原酶氧化复原酶v -这是一类转移电子，催化作用物的氧化复这是一类转移电子，催化作用物的氧化复原反响的酶原反响的酶v 脱氢酶脱氢酶 如琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶如琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶v 氧化酶氧化酶 如如DOPA

20、氧化酶、细胞色素氧氧化酶、细胞色素氧化酶化酶v 一脱氢酶一脱氢酶 脱氢酶的显示：底物为脱氢酶氧化，从底物释脱氢酶的显示：底物为脱氢酶氧化，从底物释放出氢，经氢传送系统，使受氢体复原而显色放出氢，经氢传送系统，使受氢体复原而显色常以四唑盐和铁氰化钾作为受氢体常以四唑盐和铁氰化钾作为受氢体 组化示脱氢酶分为不需辅酶和必需辅酶二种组化示脱氢酶分为不需辅酶和必需辅酶二种1. 瑚珀酸脱氢酶瑚珀酸脱氢酶SDH SDH是属于琥珀酸氧化酶系统的酶。是属于琥珀酸氧化酶系统的酶。 不需辅酶的存在不需辅酶的存在 SDH存在于一切有氧呼吸的细胞，以心肌、存在于一切有氧呼吸的细胞，以心肌、肾曲管上皮细胞、肝细胞含量最丰

21、富，和线粒肾曲管上皮细胞、肝细胞含量最丰富，和线粒体膜结实结合体膜结实结合 最适最适PH 7.【显示方法】【显示方法】Pearson 二甲亚砜法二甲亚砜法【根本原理】【根本原理】琥珀酸盐琥珀酸盐 + 受氢体四唑盐受氢体四唑盐 富马酸富马酸+复原的受氢体复原的受氢体 无色无色 蓝色沉淀蓝色沉淀【作用液】【作用液】0.1M 琥珀酸钠琥珀酸钠, 0.1M 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 PH 7.6 NBT(硝基蓝四唑硝基蓝四唑), 二甲亚砜二甲亚砜(DMSO)【步骤】【步骤】 1. 新颖组织低温冰冻切片新颖组织低温冰冻切片 2. 作用液作用液1535 分钟分钟 3. 生理盐水洗生理盐水洗 4. Fca(氯化钙氯化钙Formalin)固定固定10分钟分钟 5. 入入80%乙醇乙醇5分钟分钟 6. 甘油明胶封固或脱水、透明、中性树胶封片甘油明胶封固或脱水、透明、中性树胶封片【