常规根系测定指标及方法.doc

1、常规根系测定指标及方法烟草根系常见测定指标及实验方法一、烟草根系发生特点烟草根属直根系，由主根、侧根和不定根三部分组成。烟草由苗床栽入大田后，主根受人为控制，经常萎缩，而侧根和不定根迅速发展成一庞大根群。1级、2 级侧根的增长及根长密度在时间、空间上的动态变化与其地上地下关系的变化是一致的。烟草的根系数量的增加和活力的提高存在双峰现象：第1 次出现在团棵期至旺长期。移栽后 40d 前(团棵期 )，烟草的生长中心在地下部，根系生长迅速，并且所形成的根分布在较浅的土层中。旺长期，生长中心从地下部转移到地上部， 010cm 土层出现了大量不定根，因此 010cm 内 1 级、 2 级侧根根长密度表现

2、为增长趋势。而其它各土层内由于物质供应的减少，根长密度表现为缓慢增长，甚至呈下降的趋势；第 2 次出现在打顶后的圆顶期。圆顶期，由于打顶使根系生长又出现一次高峰，各土层 1 级、 2 级侧根根长密度均表现出增长的趋势。因此打顶具有诱发侧根数量的增加和活力提高的作用。到后期，随着烟叶的逐渐成熟，根系开始死亡，根系生长速度减缓，根长密度变化不大。烟草生育后期下层分枝密度减少，下层较细的侧根有机物质供应不足，导致衰老死亡而出现的相对减少。二、衡量根系的指标1、 根系生物量根鲜重在植物营养研究方面很有应用价值。养分吸收大多用根鲜重作参量。根鲜重容易测定，但准确程度与根外粘附水分有关，故受操作影响较大。

3、根干重对于养分和水分吸收不是个理想的参数，因为老而粗的根所占的重量很大，而吸收养分和水分的能力很小。但当了解植物地下部的生产力时，干重常作为估计的标准。在估算根冠比（R/S）时，也要用根干重。测定根干重一般采用烘干重量法。根系干重和鲜重：烟草根系从土壤中挖出、洗净后，用吸水纸或滤纸吸干根表面水分，用电子天平称取根鲜重。获得鲜重数据后装入牛皮带放入烘箱内，在80下烘干，称其干重。2、 根系形态根系形态特征包括根系体积、几何形状、长度、分布深度、根密度、分枝状况、根重、根表面积、根毛数量和根尖数等。根系形态与养分、水分的吸收能力有密切关系。在植物营养研究中，常用的根形态参数主要有根长、根表面积、根

4、体积、根直径等。2.1 根数：根基部的根数。在洗净根系去掉地上部分后，先数基部的根数。2.2 根长：每个根的长度累计为根长度。在平整桌面上用铅笔画上1 米的长度然后倒少量水保持浅水层，将湿根置于上，把根拉直，累计每条根的长度，得到样品的总根长。2.4 根粗：随机选取 10 个根，在有少量水的桌面上紧密排成一排，并用小刀修齐顶端。用小尺测量十个根的粗度，并记录下来。表 1 不同根茎根系粗细划分直径（ mm ） 0.50.5-2.0粗细分类很细细2.0-5.0小5.0-10.0中10.0-20.0 粗 20.0很粗2.5 根体积：根系体积的测定一般采取排水法测定，因为根系的体积等于其所排出同体积水

5、的量。取 1L 的量筒，（具体的量筒规格根据样品的根系大小而定）。注入 500ml 左右水，记下量筒读数。用滤纸吸干洗净的根系表面的水，揉成团放入量筒内，用玻棒将根系全部沉入水里，再次记下量筒读数，两次之差即为样品根体积。2.6 根系表面积：根据根系对某种物质的吸附量来测定根的吸收面积。一般常用甲烯蓝作为被吸附物质，其被吸附的数量可以根据供试液浓度的变化用比色法准确地测出。当根系在甲烯监溶液中已达吸附饱和而仍留在溶液中时，根系的活跃部分能把原来吸附的物质吸收到细胞中去，因而可继续吸附甲烯蓝。从后一个吸附量可求出活跃吸收面积。2.7 比根长：衡量根直径的重要参数之一，比根长值越大， 说明根越细小

6、。根系长度和根干质量的比值为比根长，单位为m·g-1 。2.8 根 /冠比（ R/S）：是地下部与地上部干重的比值，即：R/S根系干重/地上部干重R/S 是描述根系与地上部生长相互关系的参数，通过测定根 /冠比，可以了解植物地下部与地上部的分布及二者之间的关系。 一般地 S R，故 R/S1。在缺磷情况下，R/S 增大。植物根系的生长具有 “趋肥性 ”，即根系能够迅速伸展到土壤养分相对丰富的地方，以扩大吸收养分的范围。在一定的土壤养分含量范围内，养分含量偏低，促进根系伸展而抑制地上部生长， R/S 比较大；反之，养分含量偏高， 根系较短，促进地上部生长， R/S 比下降。3、 根系活

7、力与酶活性根系活力需要用挑取足量新鲜根系洗净，放入冰盒或液氮内带回实验室， -80 冰箱内保存备用。3.1 根系活力采用 -萘胺法或者氯化三苯基四氮唑（TTC ）还原法测定。3.2 丙二醛（ Malondialdehyde ，MDA ）植物在逆境或衰老条件下，会发生膜脂的过氧化作用。丙二醛（ MDA ）是膜脂过氧化产物之一，其浓度表示脂质过氧化强度和膜系统伤害程度，所以丙二醛是逆境生理指标。通过测定丙二醛的多少可以直接作物的受逆境压迫的程度。含量采用硫代巴比妥酸法测定。3.3 根的阳离子交换量植物根系的阳离子交换量（cationexchangecapacity ，简称 CEC ）是指每 100

8、0g干根所能吸收的全部交换性阳离子的厘摩尔数（cmol(+)/kg ），是根系的重要生理生化指标之一。其大小与植物种类、品种、根细胞壁果胶的羧基含量等有关。三、实验方法1、 根系活力（ -萘胺法）一， 测定的意义及原理：植物的根系能氧化吸附在根表面的 -萘胺，生成红色的 -羟基 -1-奈胺，沉淀于有氧化力的根表面， 使这部分根染成红色。 根对 -萘胺氧化能力与其呼吸强度有密切关系， 日本人相见、松中等人认为 -萘胺氧化的本质就是过氧化物酶的作用，该酶的活力愈强，对 -萘胺的氧化力也愈强， 染色也愈深。所以，可以根据染色深浅定性的判断根的活力。-萘胺在酸性环境中与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成红

9、色的偶氮染料， 可供比色测定 -奈胺含量。二，药品：（1）40ppm（ug/ml ）-萘胺溶液：精确称取 0.10g 分析纯 -萘胺，先用 2ml95% 酒精溶解，加约 50ml 蒸馏水移入 100ml 容量瓶中，然后稀释至刻度，保存于棕色瓶中，置于低温暗处保存。用前稀释 25 倍（40ml 稀释至 1000ml）即为 40ppm 溶液。（ 2）对氨基苯磺酸溶液：称 1对氨基苯磺酸溶于 100ml30% 乙酸（醋酸）中。（ 3）100ppm 亚硝酸钠溶液：称 0.10g 亚硝酸钠溶于 1000ml 蒸馏水中。（ 4）0.067mol/LpH7.0 磷酸缓冲液分子量 0.067mol PH7.0

10、(1000ml 磷酸缓冲液 )所需量（）a2HPO 4.2H2O 178.057.1184ga2HPO 4.12H2O 358.22 14.4004gKH 2PO4136.09 3.6292ga2HPO 4.2H2O 7.1184g (或 a2HPO 4.12H2O 14.4004g)+ KH 2PO4 3.6292g 定容到 1000ml 容量瓶中。三，方法与步骤：(1) -萘胺标准曲线的绘制： 用 40ppm-萘胺溶液配制成 0、 5、10、20、30、40ppm 各浓度 -萘胺的配制：用 40ppm 溶液配制混匀，置室温（ 2025 度）下分钟使之显色，最后加入蒸馏水，使整个容积为 25

11、ml,摇匀，在 20-60 分钟内用 510nm 波长进行比色， 以对照光密度为，读取光密度，以 -萘胺含量作横坐标，光密度作纵坐标绘制标准曲线。(2)将待测根系吸净吸干附着水称取 1g 放入 100ml 三角瓶中，加 40ppm 的 -萘胺溶液和磷酸缓冲液各 25ml，混匀。(3)静置 5-10 分钟后（根吸附以完毕），从瓶中取 2ml 溶液放入 25ml 容量瓶。将其余的溶液塞好瓶塞后，放在震荡器上，在25下震荡 3-6小时（如无震荡器时要在反应期间，定时的摇动），反应时间完毕后，再取2mL 溶液放入另一刻度试管，因为 -萘胺溶液会自动氧化， 所以要同时做无根的同样操作的空白试验（根样最好

12、用整根；用切碎的根， -萘胺溶液的氧化量会意外增加）。(4)在上述两次及空白试验所吸取的 2ml 测定液中，各加入 10ml 蒸馏水，混匀后再加入 1% 对氨基苯磺酸 1ml 和 100ppm 的亚硝酸钠溶液 1ml ，混匀，置于室温下 5 分钟使之显色，然后加入蒸馏水，使整个容积为 25ml，在 20-60 分钟内用 510nm 波长进行比色，读取光密度，由标准曲线查出 -萘胺含量。也可以将根系烘干， 以干重计算根系活力（更为准确些）。(5)结果计算根系对 -萘胺的生物氧化量 Y（ug.g-1.h-1）按下式进行计算Y= （A-B ）-（C-D ）*E/ （t*W ）式中： A-第一次取液测

13、定值（ ug.ml -1），作为开始值，这是根表面氧化物质的氧化作用而不是根的酶促反应；B-第二次取液测定值，是根的酶促反应后（如 3 小时）剩余的 -萘胺浓度（ ug.ml -1）。A-B 即 -萘胺氧化总量；C-第一次空白测定值（ ug.ml -1）；D-第二次空白测定值；C-D 即 -萘胺自发氧化量；E-稀释倍数 24（48/2）（因从 48ml 中又取 2ml）； t-3 小时；W- 样品鲜重（也可以用干重计算）；2、根系活力（ TTC 法）一、原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV 的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲（TTF），

14、如下式：生成的三苯甲（TTF）比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC 还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC 还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）试剂1. 乙酸乙酯（分析纯） 。2. 次硫酸钠（ Na2S2O4，分析纯），粉末。3.1 TTC 溶液：准确称取TTC1.0g ，溶于少量水中，定容到100mL。用时稀释至需要的浓度。4. 磷酸缓冲液（1/15mol/L， pH7.0 ）。5.1mol/L硫酸：用量筒取比重1.84 的浓硫酸55mL

15、，边搅拌边加入盛有500mL 蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000mL。6.0.4mol/L琥珀酸：称取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100mL 即成。（二）仪器设备小烧杯 3 个，研钵1 个，移液管：0.5mL1 支、 10mL1 支、 5mL3 支，刻度试管6 支，分光光度计，分析天平（感量0.1mg ），电子顶载天平（感量0.1g ），温箱，试管架，药勺，石英砂适量，滤纸。三、实验步骤1. 定性测定（ 1）配制反应液把1 TTC溶液、 0.4mol L 的琥珀酸和磷酸缓冲液按1:5:4比例混合。（ 2）把根仔细洗净，把地上部分从茎基部切除。将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，

16、置 37左右暗处放 1 3h，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。2. 定量测定（ 1）TTC 标准曲线的制作取0.4 TTC 溶液 0.2mL 放入大试管中，加 9.8mL 乙酸乙酯， 再加少许Na2S2O4粉末摇匀，则立即产生红色的 TTF。此溶液浓度为每毫升含有 TTF80g。分别取此溶液 0.25mL 、0.50mL、1.00mL 、1.50mL 、2.00mL 置 10mL刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF20g、40g、80g、120g、160g的系列标准溶液，以乙酸乙酯作参比，在485nm 波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

17、（ 2）称取根尖样品0.5g，放入小烧杯中，加入0.4 TTC溶液和磷酸缓冲液（pH7.0 ）各5mL，使根充分浸没在溶液内，在 37下暗保温1 2h，此后立即加入1mol/L硫酸 2mL，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，37下暗保温后不加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上） 。（ 3）把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯3 4mL，充分研磨，以提出TTF。把红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2 3 次，皆移入刻度试管，最后加乙酸乙酯使总量为10mL，用分光光度计在波长485nm 下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出TTC还

18、原量。四、结果计算根系活力 =C/(1000*W*h)mgTTF/（g?h） 式中： C四氮唑还原量， g。W根重， g。h时间， h。3、丙二醛（ MDA ）含量测定一，测定丙二醛的意义植物在逆境或衰老条件下， 会发生膜脂的过氧化作用。丙二醛（ MDA ）是膜脂过氧化产物之一，其浓度表示脂质过氧化强度和膜系统伤害程度，所以丙二醛是逆境生理指标。 通过测定丙二醛的多少可以直接作物的受逆境压迫的程度。二，丙二醛的测定原理丙二醛是常用的膜脂过氧化指标， 在酸性和高温条件下，可以与硫代巴比妥酸 （ABA ）反应生成红棕色的三甲川， 其最大吸收波长在 532nm。但是测定组织中 MDA 时受多种物质的

19、干扰， 其中最主要的是可溶性糖，糖与 TBA 显色反应产物的最大吸收波长在 450nm 处， 532nm 处也有吸收。因此测定组织中 MD-TBA 反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。三，仪器设备紫外可见分光光度计（或普通分光光度计）；离心机；水浴锅；研钵； 10cm 试管。四，操作步骤1.10%的三氯乙酸（ TCA ：无色结晶，易燃）溶液的配制：称取 100g 三氯乙酸，用蒸馏水溶解定容至 1000ml。2.0.6%硫代巴比妥酸 （TBA ：微黄色或微粉红色结晶）溶液的配制：称 6g 硫代巴比妥酸，溶于约 400ml 煮沸的蒸馏水中，另称取 100g 三氯乙酸用 30ml 左右蒸馏水溶解

20、后倒入硫代巴比妥酸中，冷却至室温下定容至 100ml。3.MDA 的提取：称取剪碎的叶片（衰老或逆性环境下的叶片） 1g，加入 10%TCA2ml 和少量石英砂，研磨至匀浆，再加 8mlTCA 进一步研磨，匀浆以 4000rpm 离心 10min ，上清液为样品提取液。4.（1）空白：取 3ml10%TCA 于 10ml 试管中，加入 3ml0.6%TBA ，混合后于沸水浴上反应15min ，冷却后离心（ 4000r，10min ），取上清液调零、调百。（ 2）显色反应和测定：吸取离心的上清液 3ml 加入 3mlTBA 溶液，于沸水浴反应 15min ，冷却后离心，取上清液测定 532、60

21、0、450 波长下的消光度。五，结果计算与分析MDA（ mol/L ）=6.45*（D532-D600）-0.56D450然后以材料的鲜重（ FW ，干重为 DW ）表示丙二醛的含量： MDA 。本实验中，提取液总量为 10ml ，即 10ml 中为 1g 鲜样。最后 MDA 含量为：MDA=6.45* （D532-D600）-0.56D450/100* 样品重量（因为样品是 10ml，而 MDA 的量是每 L ，所以上公式需要除以 100）六，实验结果偏离的原因分析及其注意事项。1，尽量取直接称量，避免冰箱保存后由于水汽冷凝造成的称量误差。2，研磨过程中要尽量避免 TCA 的损失，努力保证

22、10 提取液的分量。3，TCA 易燃，具有腐蚀性，实验过程中或玻璃仪器清洗过程中避免直接与皮肤和衣服接触， 否则会发生严重皮肤脱皮现象。4、根的阳离子交换量（一）样品的采集与处理1选择有代表性的植株，将根系连同土壤一起掘出。先用水冲去大部分土块，然后放在筛子上（孔径0.5mm ），用流水结合轻微振动将根系洗净，并注意保证根系的完整。2洗净的根立即放在80的烘箱中（预先使烘箱温度升高至90）保持恒温，烘810 小时至干。3趁热将样品放入粉碎机中磨碎，并全部通过0.51.0mm 筛孔过筛 ,然后将样品充分混合,务必使样品均匀。（二）测定1.H 根的制备：（1）准确称取 0.1000 克(双子叶植物 )或 0.2000 克 (单子叶植物 )样品放入 250ml 的烧杯中。（2）在样品中加几滴蒸馏水使其湿润，防止加入HCl 后样品飘浮，影响测定结果。待样品完全湿润后，加入0.1m