noggin基因诱导骨髓基质干细胞分化为神经细胞的相关研究盛年

1、noggin基因诱导骨髓基质干细胞基因诱导骨髓基质干细胞 分化为神经细胞的相关研究分化为神经细胞的相关研究周盛年周盛年山东大学齐鲁医院山东大学齐鲁医院 关键词关键词: 1 骨髓基质干细胞骨髓基质干细胞2 noggin 基因基因3 诱导诱导 立项依据立项依据在骨髓中存在两大类干细胞：在骨髓中存在两大类干细胞： 造血干细胞造血干细胞 骨髓基质干细胞骨髓基质干细胞1.造血干细胞造血干细胞可以增殖并分化为其他血液细胞，能够重建宿主可以增殖并分化为其他血液细胞，能够重建宿主的血液系统的血液系统.通过限制性分化过程，使其子代细胞通过限制性分化过程，使其子代细胞逐渐成熟，产生红细胞、血小板、单核细胞、粒逐渐

2、成熟，产生红细胞、血小板、单核细胞、粒细胞等成熟细胞，不断补充血液细胞细胞等成熟细胞，不断补充血液细胞.一般认为在一般认为在人体内人体内cd34阳性细胞、鼠内为阳性细胞、鼠内为sca1阳性细胞富含阳性细胞富含hsc。 骨髓基质干细胞（骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells ,bmscs)又称骨髓间充质干细胞又称骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell ，mscs ）即是指骨髓基质系统中所含有的一类多能干细胞，它即是指骨髓基质系统中所含有的一类多能干细胞，它不表达造血细胞的相关标志，具有向多种中胚层和神不表达造血细胞的相关标志，具有向多种中胚层和神

3、经外胚层来源的组织细胞分化的能力经外胚层来源的组织细胞分化的能力。 骨髓基质干细胞特性骨髓基质干细胞特性 1.具有具有自我更新的能力和多向分化潜能自我更新的能力和多向分化潜能，处在不同的微环境，处在不同的微环境中能分化成多个细胞系中能分化成多个细胞系,形成多种间充质细胞形成多种间充质细胞,包括成骨细胞、包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等,特别是能够特别是能够横向分化横向分化为神经为神经细胞和胶质细胞。细胞和胶质细胞。 2.bmscs 具有具有易于获得、培养、增殖易于获得、培养、增殖,多次传代后仍保多次传代后仍保持干细胞特性并能定向分化为所需细胞持干细胞特

4、性并能定向分化为所需细胞,移植后内能长期存移植后内能长期存活活,诱发的诱发的免疫反应较弱免疫反应较弱等特点等特点,并且可以促进胚胎干细胞和并且可以促进胚胎干细胞和神经干细胞增殖和分化神经干细胞增殖和分化,在神经损伤修复、基因治疗、造血在神经损伤修复、基因治疗、造血重建等实验和临床研究中皆具有良好的应用前景。重建等实验和临床研究中皆具有良好的应用前景。骨髓基质干细胞特性骨髓基质干细胞特性 3. bmscs 在体外可以在体外可以大量扩增大量扩增、自体移植自体移植可以避免免疫可以避免免疫排斥反应和具有强大的可塑性排斥反应和具有强大的可塑性. 4. 可作为多种疾病细胞替代治疗和可作为多种疾病细胞替代治

5、疗和基因治疗的载体基因治疗的载体,使使bmscs 成为当今生命科学领域研究的热点之成为当今生命科学领域研究的热点之骨髓基质干细胞特性骨髓基质干细胞特性noggin noggin基因是基因是1992年年california大学的大学的harland ,r.m.和和 smith ,w.c.从非洲蟾蜍的胚胎中分离出来的。此后发现从非洲蟾蜍的胚胎中分离出来的。此后发现该基因在胚胎发育中有重要该基因在胚胎发育中有重要神经诱导作用神经诱导作用，尤其是诱导外胚，尤其是诱导外胚层的背侧发育；亦表达于出生后及成年哺乳动物中枢神经系层的背侧发育；亦表达于出生后及成年哺乳动物中枢神经系统内，调控成年海马、室下区神经

6、干细胞的增殖和分化，在统内，调控成年海马、室下区神经干细胞的增殖和分化，在学习和记忆的形成过程中有重要的作用学习和记忆的形成过程中有重要的作用 noggin noggin基因是目前在体内与体外均被证实有基因是目前在体内与体外均被证实有神经神经诱导诱导作用的神经诱导剂。其神经诱导功能主要是通作用的神经诱导剂。其神经诱导功能主要是通过拮抗过拮抗骨形成蛋白骨形成蛋白（bone morphogenetic protein-4,bmp4）的作用实现的。）的作用实现的。bmp可促进胶质可促进胶质细胞的分化而抑制神经发生，而细胞的分化而抑制神经发生，而noggin蛋白则促进蛋白则促进神经发生神经发生 诱导

7、因骨髓基质干细胞有良好的可塑性，在外界诱导因子刺因骨髓基质干细胞有良好的可塑性，在外界诱导因子刺激下可分化为各类神经细胞。激下可分化为各类神经细胞。 目前一般有三种方法可以诱导分化目前一般有三种方法可以诱导分化bmscs为神经细胞为神经细胞抗抗氧化剂、生长因子和转基因诱导。氧化剂、生长因子和转基因诱导。在转基因诱导法中我们引在转基因诱导法中我们引入了入了noggin基因基因神经诱导基因。神经诱导基因。 课题思路 我们构建带有我们构建带有noggin基因的载体，并将它转染到基因的载体，并将它转染到bmscs中，预期它能够诱导中，预期它能够诱导bmscs分化为神经细胞，并对分化为神经细胞，并对分化

8、后的神经元样细胞进行检测。在细胞形态、分子、基因、分化后的神经元样细胞进行检测。在细胞形态、分子、基因、电生理水平均可证实为神经细胞电生理水平均可证实为神经细胞1.骨髓基质干细胞培养 用用percoll淋巴细胞分离液分离出大鼠骨髓基质干细淋巴细胞分离液分离出大鼠骨髓基质干细胞，并用含胞，并用含20%胎牛血清的胎牛血清的dmem/f12培养液培养，胰培养液培养，胰酶消化传代，扩增大鼠骨髓基质细胞。显微镜下观察形酶消化传代，扩增大鼠骨髓基质细胞。显微镜下观察形态态bmscs 细胞多为梭形、星形,核椭圆。细胞培养至集落间相互汇合时,传代培养, 3代以后细胞均一性好,成漩涡状生长。2.扩增带有nogg

9、in基因的表达载体 将构建好的带有目的基因将构建好的带有目的基因noggin的质粒转化感受态大肠的质粒转化感受态大肠杆菌株杆菌株dh5，挑菌落提取质粒后进行重组体测序鉴定。经，挑菌落提取质粒后进行重组体测序鉴定。经酶切、酶切、pcr鉴定。鉴定。 3.将带有将带有noggin基因的表达载体导入基因的表达载体导入骨髓基质细胞内诱导其为神经细胞骨髓基质细胞内诱导其为神经细胞 取第四代、第六代取第四代、第六代bmsc，用脂质体转染法介导，用脂质体转染法介导noggin基因进入到骨髓基质细胞内。观察细胞形态的改变。基因进入到骨髓基质细胞内。观察细胞形态的改变。形态学观察形态学观察4.检测与鉴定检测与鉴定

10、1.利用免疫细胞化学技术鉴定分化细胞是否表达神经利用免疫细胞化学技术鉴定分化细胞是否表达神经细胞特异性标记细胞特异性标记;2.利用利用rt-pcr技术检测部分参与神经细胞生理功能技术检测部分参与神经细胞生理功能的基因的基因.3.利用膜片钳技术检测诱导后的神经细胞是否具有电利用膜片钳技术检测诱导后的神经细胞是否具有电生理功能。生理功能。1).免疫细胞化学技术 转染后细胞nse阳性（100） 转染后细胞map-2阳性（100） 免疫荧光 转然后细胞 nse染色 转然后细胞map-2染色 2) rt-pcr空白对照组 空质粒对照组 noggin诱导组marker自上而下依次是自上而下依次是100，2

11、00，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000; 基因排列顺序及大小为基因排列顺序及大小为ncam-295,gfap-792,-actin-314，syn-1577,gap-43-229,noggin7603)膜片钳技术原理：膜片钳技术是以微弱电流信号测量为基础的，利用玻原理：膜片钳技术是以微弱电流信号测量为基础的，利用玻璃微电极与细胞膜封接，可测量多种膜通道电流，是一种典璃微电极与细胞膜封接，可测量多种膜通道电流，是一种典型的低噪声测量技术，可以说达到当今电子测量的极限型的低噪声测量技术，可以说达到当今电子测量的极限 操作步骤 1微电极的制备 拉制 电极优化

12、处理 电极充灌2全细胞跨膜总电流的记录 施加正压 电极入水 高阻封接 破膜预期结果预期结果应用膜片钳技术对骨髓基质干细胞分化的神经元样细胞进行应用膜片钳技术对骨髓基质干细胞分化的神经元样细胞进行了电生理特性检测。了电生理特性检测。预期结果证实神经元样细胞具有活跃的电生理特性。且与骨预期结果证实神经元样细胞具有活跃的电生理特性。且与骨髓基质干细胞的电生理特性有明显差异。髓基质干细胞的电生理特性有明显差异。bmscnoggin神经元样细胞免疫荧光rt-pcr膜片钳免疫组化质疑和争论质疑和争论 骨髓基质细胞分化为神经细胞被认为是一种跨骨髓基质细胞分化为神经细胞被认为是一种跨胚层发育，不少学者对细胞的

13、这种跨胚层分化表示胚层发育，不少学者对细胞的这种跨胚层分化表示质疑，认为这是由于其他原因导致产生的一种假象。质疑，认为这是由于其他原因导致产生的一种假象。质疑与争论的焦点主要集中在以下三个方面：质疑与争论的焦点主要集中在以下三个方面：1.诱导剂的细胞毒性作用诱导剂的细胞毒性作用2.细胞融合细胞融合3.骨髓组织内是否存在其他干细胞骨髓组织内是否存在其他干细胞1诱导剂的细胞毒性作用诱导剂的细胞毒性作用 有学者认为细胞的这种有学者认为细胞的这种 “神经细胞样神经细胞样”变化（即折光性变化（即折光性增强，胞体变圆，轴突形成），并不是干细胞分化为了神经增强，胞体变圆，轴突形成），并不是干细胞分化为了神经

14、细胞，而是细胞对外界毒性环境的一种保护性反应，是细胞细胞，而是细胞对外界毒性环境的一种保护性反应，是细胞发生了皱缩，是细胞骨架改变的结果发生了皱缩，是细胞骨架改变的结果2 细胞融合细胞融合 在对移植过男性骨髓的女性白血病患者进行研究时，发在对移植过男性骨髓的女性白血病患者进行研究时，发现宿主的少数神经细胞含有现宿主的少数神经细胞含有y染色体，说明这些细胞是供者骨染色体，说明这些细胞是供者骨髓来源的。进一步研究发现，在这些细胞里面，部分细胞含髓来源的。进一步研究发现，在这些细胞里面，部分细胞含有两个以上的性染色体，提示可能为细胞融合的结果。对于有两个以上的性染色体，提示可能为细胞融合的结果。对于

15、发生融合的细胞来说，如果不进行染色体分析，仅仅检测移发生融合的细胞来说，如果不进行染色体分析，仅仅检测移植细胞表达神经细胞特异性标识物，那么就会误认为移植细植细胞表达神经细胞特异性标识物，那么就会误认为移植细胞分化成了神经细胞，产生一种假象胞分化成了神经细胞，产生一种假象 3.骨髓组织内是否存在其他干细胞骨髓组织内是否存在其他干细胞 骨髓基质细胞是一种异质体，包含有许多未知种类的骨髓基质细胞是一种异质体，包含有许多未知种类的细胞，其中就有可能为多能干细胞和异位神经干细胞。即细胞，其中就有可能为多能干细胞和异位神经干细胞。即便是这些细胞的数量非常少，在试验的条件下也可以分化便是这些细胞的数量非常

16、少，在试验的条件下也可以分化为神经细胞。这种干细胞的分化能力很强，在特定诱导条为神经细胞。这种干细胞的分化能力很强，在特定诱导条件下，可以分化为肌肉细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪件下，可以分化为肌肉细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞及神经细胞等。另外也报道证实在成年动物细胞、肝细胞及神经细胞等。另外也报道证实在成年动物的肠内发现有神经脊干细胞，这些细胞可以分化为神经细的肠内发现有神经脊干细胞，这些细胞可以分化为神经细胞。但目前尚缺乏证据证明骨髓内存在这样的神经干细胞胞。但目前尚缺乏证据证明骨髓内存在这样的神经干细胞总结和展望总结和展望我们研究发现携带我们研究发现携带noggin基因的骨髓基质细胞在体外可以分基因的骨髓基质细胞在体外可以分化为神经元样细胞。化为神经元样细胞。若这些细胞分布在脑卒中组织内，表达若这些细胞分布在脑卒中组织内，表达noggin蛋白，