TFF1在胃黏膜保护作用的分子生物学机制及其在胃癌的发生、发展中的作用

1、tff1在胃黏膜保护作用的分子生物学机制及其在胃癌的发生、发展中的作用田文玲王宏山东省交通医院山东济南250031摘要：目的：探讨tff1在胃黏膜保护作用的分子生物学机制及其在胃癌的 发生、发展屮的作用。方法：选取我院于2012年12月至2014年6月收治的120 例行胃镜检查的患者为研究对象，使用western blotting法检测tff1在正常胃粘 膜屮存在的分子形式，采用免疫组化法检测tff1在胃癌、正常、肠化胃粘膜、 不典型增生、食管癌等不同癌变屮的表达情况。结果：tff1在正常胃粘膜屮存 在的分子形式主要分为单聚体、二聚体和tff1复合物，其屮tff1复合物的含量 最高；tff1在

2、胃癌旁组织和不典型增生屮的表达比正常胃粘膜高，结果具有统 计学意义(p<0.05)；肠化旁组织的tff1表达比正常胃粘膜高，屮、高分化胃 癌的tfh表达低于正常胃粘膜，结果均无统计学意义(p>0.05)； tfh在低分 化胃癌、肠化、食道癌及其旁组织上无tff1表达。结论：tfh在正常胃粘膜中 主要存在的分子形式是tff1复合物，对胃粘膜有良好的保护和修复作用，与癌 症的抑制和分化机制相关。关键词：三叶因子；胃黏膜；分子形式；癌变【abstract 】objective: to study the the molecular biology protectionmechan

3、ism of tff1 in gastric mucosa and its role in the occurrence and developmentof gastric cancer. methods： from december 2012 to june 2014，the 120 patientsunderwent gastroscopy as the research object in our hospital, using western blottingmethod to detect tff1 in normal gastric mucosa molecules that ex

4、ist in the form,using immunohistochemical method to detect tff1 in stomach，normal，intestinalmucosa, atypical hyperplasia and esophageal canceration of expression. results：tff1 in normal gastric mucosa exists in the form of molecules are divided into single dimer, dimers and tff1 compounds, among the

5、m the highest content of tff1 complexes； tff1 expression in gastric cancer adjacent tissues and atypicalhyperplasia is higher than the normal gastric mucosa，the results have statistical significance(p < 0.05)； intestinal adjacent tissues of tff1 expression is higher than the normal gastric mu

6、cosa, expression of tff1 and high differentiation of gastric cancer in below the normal gastric mucosa, the results had no statistical significance(p > 0.05)； tff1 in poorly differentiated cancer of the stomach, intestine, esophageal cancer and its organizational tff1 expression. conclusion：

7、tff1 in normal gastric mucosa tff1 is the main existence form of molecular compounds, has good protection and restoration effect to gastric mucosa, related to the inhibition ofcancer and the differentiation mechanism.【key words 】trilobites factor； gastric mucosa； the molecular forms；cancerous三叶因子家族(

8、refoil factor family, tff)是一群小分子多肽，主要由胃肠道 黏液细胞分泌而成1】。三叶草因子肽(tfhtff2和tff3)是稳定的分泌蛋闩表 达在胃肠道(胃粘膜)，参与胃肠道粘膜防御和修复。tff1是一个重要的蛋白质， 参与正常窦的分化和幽门胃粘膜，对胃肠道肿瘤抑制基因具有特殊的功能。tff1 作为三叶因子家族中的重要组成，其在正常组织是是对胃体和胃窦粘膜上皮表面 细胞的表达。如果胃肠道黏膜被损或发生病变后tff1就可能整个受损的胃肠粘 膜部表达，表达与正常黏膜更明显。本文旨在探讨三叶因子1 (tff1)在正常胃 粘膜中存在的分子形式和tff1与不同癌变的关系，具体操作

9、如下。1资料与方法1.1 一般资料选取我院于2012年12月至2014年6月收治的120例行胃镜检査的患者为 研究对象，所有患者均因腹胀、腹痛进行胃镜检查，年龄分布在36-72岁之间, 平均年龄为(53.9±2.0)岁。其中24例正常胃窦粘膜患者均给予胃镜检 査其胃、十二指肠和食管，检査结果显示正常；胃癌和胃癌旁组织患者冇26例，肠化胃粘膜患者有30例，食管癌和食管癌旁组织患者奋18例，不典型增生患者 有22例。所有患者对研究知情，并同意临床资料用于研究分析。1.2试剂western blotting reagents （amersham 公司），免疫组化用、dab 显色

10、试剂 盒、s-p超敏试剂盒（福州迈新生物技术开发公司），-mercaptoethanol sds、 edta （sigma公司），羊一抗和羊二抗（北京中杉金桥生物技术冇限公司），n- 甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、蛋白测定液（bio-rad公司）。1.3方法western blotting法：把4°c预冷的匀浆缓冲液加到正常胃粘膜组织内，均匀 搅拌后提取总蛋白，并确定蛋白浓度。匀浆缓冲液的构成如下：edta 1.5mmol/l、 tris 10mmol/l、l%的 dtt 和 pmsf、-mercaptoethanol 20 mmol/l、鹿糖 0.2mmol/lo蛋白浓度确定后，在每个

11、样品内提取120克的蛋白质，并分别加入体积一样的加 样缓冲液，沸点煮5分钟，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，凝胶由20%的分 离胶和5%的积层胶构成。其中电泳的吋间控制在5h左右，分离胶电压控制在 120v,积层胶电压控制在70v。在冰浴中使用湿式转移法以电流250ma进行 lh30min的电转移。电转移结束后，把nc膜放入紧闭液中封闭半小吋，然后在 一抗中孵育3小吋，进行pbs-t洗膜，再加入14000二抗孵育3小吋，再次进行 pbs-t洗膜，在暗室中使用ecl曝光显影。免疫组化法：先使用10%的甲醛固定患者胃癌、正常胃粘膜组织、不典型 增生、肠化胃粘膜，然后把常规脱蜡至水，染色先用sp法，

12、再用苏木素第二次 染色，最后吹干。不同胃粘膜病变中tffi蛋白的表达情况观察：应用链霉菌素一生物素免疫 组化染色（s p）法。抗tfh蛋白抗体为鼠抗人单克隆抗体（mab 0231）, 免疫组化试剂盒（kit 一 9710）为福州迈新生物技术开发公司产品。0.01mol/ltbs（ph7.4）替代一抗作为每次染色的空白对照，参照sp试剂盒（福州迈新公司） 说明书进行免疫组化染色。1.4统计学分析通过spss19.0软件实现了数据库的录入及统计分析，其组构成比较用卡方 检验，组间疗效比较用等级资料的秩和检验分析，计量资料以均数标准差表示， p<0.05，表示具有统计学意义。2. 结果

13、2.1tff1在正常胃粘膜中存在的分子形式利用western blotting进行检测后，tff1在正常胃粘膜中存在的分子形式主 要包括三种，分为单聚体、二聚体和tff1和某种分子结合而成的复合物(亦称 为tff1复合物)。含量上，tff1复合物的含量最高，单聚体含量最低，见图1。3. 讨论三叶因子家族作为一种小分子多肽，主要发现了三种三叶肽，分别为解痉多 肤、乳癌相关肤和肠三叶因子2-3。这三种三叶肽都是由一种特殊的p结构域组 成，三个三叶肽中的二硫键是由38个左右的氨基酸利用6个高度保守的半胱氨 酸残基连接而成的，以促使整个肽链折叠后形成三叶状。tff1是三叶因子家族 的主要成员，每个tf

14、f1都是由60个氨基酸构成的，在对保护和修复胃肠道粘膜 起着重要作用5-6。当前国内外开始重视胃癌与胃癌癌前病变发生的关系，尤苏是胃癌与胃粘膜 肠化和不典型增生这两种较为常见的胃癌癌前病变7】。本研究结果显示，三叶 因子在正常胃粘膜中存在的分子形式主要有单聚体、二聚体和tff1复合物，tff1 复合物的含量是最高的，此后依次是二聚体、单聚体，这说明了三叶因子生物活 动性能否激活以及同源二聚体能否形成与其他蛋白质结合形成的低聚体冇一定 关联。林辉等在对tff1在正常及损伤胃黏膜中的表达改变研究中表明，tfh对 胃腺癌细胞系ags的增生有一定的抑制作用，且剂量越大，抑制作用会越强8。 本研究结果显

15、示，胃癌旁组织、不典型增生、肠化旁组织的胃粘膜阳性表达均高 于正常胃粘膜，且胃癌旁组织和不典型增生的表达与正常胃粘膜相比具奋统计学 意义(p<0.05)；低分化胃癌、肠化食道癌及其旁组织上无tff1阳性表达。这 表明tff1在人胃癌旁黏膜、消化性溃疡、不典型增生溃疡黏膜中的表达与正常 相比有所升高，tff1与癌症的抑制和分化机制相关。本研究结果与以往文献数 据相符4, 9。综上所述，三叶因子作为一种肿瘤抑制因子，在正常胃粘膜中存在的主要分 子形式是tff1复合物，二聚体和单聚体也是常见的分子形式，且三叶因子与癌 症的抑制和分化机制相关，能很好的保护和修复胃粘膜。参考文献：1】任建

16、林，罗金燕，卢雅不，等.三叶因子在正常胃黏膜中存在的分子形式 及其与癌变的关系.南方医科大学学报.2006, (08)： 1234-1236.2 moghanibashi m, mohamadynejad p，rasekhi m. et al.polymorphism of estrogen response element in tff1 gene promoter is associated with an increasedsusceptibility to gastric cancerj.gene： an international journal focusing on gene c

17、loning and gene structure and function, 2012, 492 (1): 100-103.3】任建林，卢雅不，王琳，等.tff1在正常及损伤胃黏膜中的表达改变j. 世界华人消化杂志.2003, (11)： 1809-1810.4 tomita h, takaishi s, menheniott tr et al.inhibition of gastric carcinogenesis by the hormone gastrin is mediated by suppression of tff1 epigenetic silencing.j.gastroe

18、nterology, 2011, 140 (3)： 879-891.5】李中英，张丙宏，唐荣，等.新生鼠坏死性小肠结肠炎模型中肠三叶因子 对pi3k/akt/gsk-3β通路影响及意义j.中华临床医师杂志：电子版.2013，(12)： 5392-5396.6 buache e, etique n, alpy f et al.deficiency in trefoil factor 1(tff1) increases tumorigenicity of human breast cancer cells and mammary tumor development in tffl-knockout mi