GH发酵培养实验方案

1、fhgh工艺实验方案工艺实验名称rhgh发酵提高蛋白表达量培养实验申请人姓名辛鹏杨江坤申请2011.9. 271. 实验目的目前我公司rhgh菌体在裂解工序的蛋白表达量为9g/kg, 为提高发酵菌体的蛋白表达量至10g/kg,冷备将发酵工艺控制 参数进行调整，以增加单罐蛋口表达量，同时可以降低水、电、 蒸汽、人工等生产费用支出，最终达到降低rhgh发酵生产成 本，提高产量的目的。2. 实验背景冃前裂解工序有1批gh二盐蛋白表达量达到10 g/kg, 批号为f20110603,有3批gh二盐蛋白表达量达到9. 5 g/kg 以上，批号为 f20110407、f2011050k f20110503

2、、f20110506、 f20110604、f20110606,这儿批的数据证明裂解二盐蛋口表 达量达到10g/kg是可行的。针对上述几批裂解反馈的信息，我们认为发酵t艺阶段 的控制参数可作适出调整，已达到裂解二盐蛋白表达量达到 10g/kgo3. 可行性分析 见附件4. 预期目标计划通过3批gh发酵培养，达到裂解工序10g/kg蛋白量 的冃的，并且各项参数可以稳定控制，保持批间的稳定。5. 实验过程为提高菌体收率，达到10g/kg蛋白表达量的目的，本次实 验4方面进行发酵培养控制，包括：设备、物料、控制参 数、培养吋间4个方面,具体过程如下:(1)设备设备名称规格型号生产厂家使用地点f旦温摇

3、床4330nbs种子室百级超净工作台sw-cj天津津港净化设备厂无菌室紫外分光光度计uv1240 型上海精密仪器有限公司发酵间复式光学显微镜ys100nikon发酵间150l发酵罐d100徳国贝朗公司发酵间2000l发酵罐d2000徳国贝朗公司发酵间生化分析仪ysi2700美国ysi公司发酵间离心机z-81徳国赛普发酵液离心间(2)物料150l罐发酵培养基配方名称使用数量磷酸二氢钠697g磷酸氢二钾185.5g硫酸钱306.3g硫酸镁189.4g柠檬酸三钠61.3g氯化钾91.7g葡萄糖52.5g酵母粉126g水解酪蛋白2 （11号）630g异亮氨酸（12号）24.5g微量元素溶液te35ml

4、氯化铁溶液35ml泡敌10ml纯化水70l2000l罐发酵培养基配方名称使用数量磷酸二氢钠896g磷酸氢二钾2385g硫酸鞍3938g硫酸镁2435g柠檬酸三钠788g氯化钾h79g葡萄糖675g酵母粉1620g水解酪蛋白2 （11号）8100g异亮氨酸（12号）315g微量元素溶液te450ml氯化铁溶液450ml泡敌130ml纯化水900l2000l罐补料酪素配方名称使用数量酵母粉1265g水解酪蛋白1 （10号）6147g水解酪蛋白2 （11号）3254g纯化水定容至180l2000l罐补料葡萄糖配方名称使用数量葡萄糖140kg纯化水定容至280l发酵培养控制参数工 序参数参数范围转 种

5、od14.5-15.0（尽量大些）菌体形 态均一短杆且没有杂菌发 酵温度37+0.3 °cph7.0±0.1（拐点除外）po2p02控制范围:小拐前p0&25%,小拐后p02最 低点控制在15%以上，小拐结束至拐点最高p02控制 在15%-35%；拐点最高至8h, po2控制在25%-45%； 8h 至 llh po2控制在 35%-50%； llh- 16h po2控制在 45%-60%葡萄糖酪素时间残糖浓度(m mol/l)0>2.8mmol/l30分钟1.95-0.50340分钟2.33-0.7731小时3.5-0.9631小时20分钟3.97-1.14

6、1小时40分钟3.0-02小时0.5-0从转种到培养2小时每20分钟测一次 糖，要求残糖浓度从2小时到放罐，根据溶氧的实际情况, 来调节糖流加的速度。酪素泵流加功率为36%全过程不变发酵培养时间:延长至16小时1. 二代种子od控制在2.3±0.1,以保证种子的批间 稳定性，进而达到稳定发酵过程的目的2. 发酵培养前，对2000l发酵罐培养基底糖浓度进行 测定，如果底糖浓度低于2.8 mmol/l,则手动调节 糖补料泵进行补糖，使2000l发酵罐培养基底糖浓 度达到2.8mmol/l3. 放罐时c源、n源的控制：c源的控制参照po2、 ph进行调节，n源的控制以补料体积至160l开始

7、 调节，将补n功率设置为20%4. 发酵后夜的罐压维持在0.3mpa,轻易不作调整实验培养过程(1) 、ghf20111001按7月份看罐方法看罐,培养时间延长30min(包括3批gh发酵培养)；(2) 、ghf20111002 p02残糖适当调整；p02控制范围:小拐前po2 225%,小拐后p02最低点控制在15%以上，小拐结束至拐点最高p02 控制在15%-35%；拐点最高至8h, po2控制在25%-45%； 8h至llh p02 控制在35%-50%； llh- 16h p02控制在45%-60%,补糖量最高17.5%；(3) 、ghf20111003 p02按照ghf2011100

8、2控制过程执行,补糖功率 最咼18%o实施时间:实施时间gh 12011.10.24-2011.10.25gh220110.262011.10.27gh32011.10.28-2011.10.29实验负责人辛鹏杨江坤执行人员发酵人员班组负责人车间主任生产总监附件gh裂解蛋口量达到10g/kg可行性分析通过对2011年47月份数据进行分析，认为gh裂解蛋白量达到10g/kg是可行 ft对47月份gh裂解蛋白量达到9.5g/kg以上批次进行分析。统计结果如下:批号裂解蛋白量f201104079.5g/kgf201105019.68g/kgf201105039.5g/kgf201105069.57g

9、/kgf2011060310.2g/kgf201106049.5g/kgf201106069.56g/kg针对以上齐批实际生产情况过程中的数据进行分析:发酵批号f20110603f20110604f20110606使用菌种号j20101201-n02j20101201n02j20i01201-n02h-6h-7h-9代培养od值2.4 2.32.36 2.372.31 2.34二代培养od值2.2 2.212.28 2.32.24 2.25150l罐最高ph 值7.287.267.29150l罐人拐时间5小时16分5小时11分5小时15分2000l罐转种后od值1.41.41.5开始补糖时间(

10、h)28分25分25分拐点最咼ph7.477.447.45拐点最低po2值15.915.614.5最高补糖功率171717.5放罐时补糖量(l)159.1161.5164放罐时补氮量(l)153.6145149总补糖量(l)178.8180.5183.3总补酪素量(l)175.6174.1174.2收获菌体量(kg)125.4125.4124.4发酵批号f20110501f20110503f20110506f20110407使用菌种号j20101201-no)h-39j20101201-n02h-3j20101201-no)h-42j20101201-no)h-34一代培养od值2.312.3

11、22.35 2.362.31 2.332.35 2.34二代培养od值2.16 2.152.32 2.312.3 2.282.24 2.23150l罐最高ph值7.347.287.247.31150l罐大拐时间5小时19分5小时19分5小时15分5小时20分2000l罐转种后od值1.41.51.51.4开始补糖时间(h)30分28分25分27分拐点最咼ph7.437.367.427.37拐点最低po2值17.217.217.31&3最高补糖功率17171717放罐时补糖量(l)156.3156.7157.1158.2放罐时补氮量(l)149.2150149.1154.5总补糖量(l)

12、171.6175174.4177.8总补酪素量(l)172.4173.1173.4182.2收获菌体量(kg)122122126.7126通过以上各罐关注点数据进行分析得出:共性：1 都使用同一批菌种j201012012. 代od2.3左右3. 二代 od2.2523 之间4.150l罐最高ph值7.3左右5. 150l罐大拐时间在5小时15-20分居多，各时间段补糖及时关注。6.2000l转种后od都大于1.4, 150l发酵转种od接近于15,或大于15.7.2000l底糖较高，大于2.8mmol/l, 0.5小时前应根据实际耍求进行补糖，一般提前5分左右。&拐点最咼ph值7.40左右。不打压最咼点ph值，尽量在3.5小时或 3.5小时5分内达最高点。9. 拐点最低溶氧控制应高于15%以上。10. 最高补糖功率可适当调整171&11. 放罐时补糖体积控制在155l以上，不能少了。12. 放罐时补酪素量150l