高效液相色谱分析

1、第三章 高效液相色谱分析1、 概述2、3、 5、6、毛细管电泳3-1 概述概述n高效液相色谱（HPLC）是一种以液体为流动相的快速分离分析色谱技术，采用细微粒固定相、高压输液泵和高灵敏度检测器，具有高压、高速、高效、高灵敏度的特点，对于那些沸点高，热稳定性差，相对分子质量大的有机化合物如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物(类固醇化合物) 、蛋白质、氨基酸、核酸等均可进行分离分析。3-1-1 HPLC类型n液液分配色谱：流动相和固定相都是液体。n吸附色谱（液固色谱）：流动相为液体，固定相为吸附剂。n离子交换色谱：此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。n离子

2、对色谱法：将与溶质分子电荷相反的离子加入固定相或流动相，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，控制溶质离子的保留行为。n离子色谱法：分离水溶液中混合阴离子快速、灵敏、准确的最有效分析方法 。n尺寸排阻色谱：基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分离的。3-1-2高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较n高压：HPlC供液压力和进样压力都很高（150350X105Pa）。高压是的一个突出特点。n高速：HPLC采用高压输液设备，流速大大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。n高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻

3、力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。n高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV10-9g, 荧光检测器10-11g。3-1-3 HPLC3-1-3 HPLC与与GCGC的比较的比较n分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定有机化合物（占总数的20%）；HPLC可分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定有机化合物（占80%）。n流动相的选择：GC采用的流动相为几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合（供选择的机会多）。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分

4、离。n操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。2dp 含义与GC一样。n纵向扩散项：液体的扩散系数Dm比气体小4个数量级,当流动相线速度u0.5cmS-1时可忽略.n传质阻力项：三个部分组成，固定相传质阻力项，流动的流动相阻力项及滞留的流动相阻力项。根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。n固定相：原则上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：,-氧二丙腈（ODPN)、聚乙二醇（PEM）、角鲨

5、烷（SQ）。通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相。n化学键合固定相：通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点 。n流动相：根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱和反相分配色谱。n正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离。n反相分配色谱：流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离。正相色谱正相色谱低极性流动相低极性流动相反相色谱反相色谱谱谱高极性流动相高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间时间时间时间时间待测物极性：待测物极性

6、：ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系吸附色谱（液固吸附色谱） n原理：是基于各组分在固体吸附剂表面上具有不同吸附能力而进行分离。n以固体吸附剂为固定相，如极性的硅胶、氧化铝、分子筛和非极性的活性炭等（较常使用硅胶）。n流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。宜于分离极性不同或含极性基团相同但数目不同的试样，也适于分离异构体，但不宜于分离同系物。吸附色谱色谱法n此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。n 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换

7、能力）的差别来实现分离的。OHXNRRXOHNR-R:阴离子交换HMSORMHSO-R:阳离子交换33-3-3色谱法n2. 固定相：按离子交换剂类型分四种： 类型类型 官官能能团团 强强阳阳离离子子交换交换剂剂 -SO3- 阳阳离离子子交换交换剂剂 弱弱阳阳离离子子交换交换剂剂 -CO2- 强强阴阴离离子子交换交换剂剂 -NR3+ 阴阴离离子子交换交换剂剂 弱弱阴阴离离子子交换交换剂剂 -NH2+ n流动相：离子交换色谱流动相为无机酸或无机碱的盐类缓冲溶液（有一定pH和离子强度），通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比k，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测

8、物的分离。色谱法（IPC）n主要用来分离强极性有机酸和有机碱。n原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。n原理原理: n采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；n在分离柱后，用另外一支抑制柱来消除淋洗液的高本底电在分离柱后，用另外一支抑制柱来消除淋洗液的高本底电流流;n采用电导检测器检测流出组分。快速分离分析微量无机离采用电导检测器检测流出组分。快速分离分析微量无机离子混合物子混合物;n各种抑制装

9、置及无抑制方法的出现，发展迅速。各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。n例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应：量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应： R+OH + HCl(流动相流动相)R+Cl- + H2O R+OH + MCl(待测物待测物) R+Cl + M+OH- 可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待测离子可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度的碱。转化为具有更大淌度的碱。n以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象。n分析速度快：可在数分钟内

10、完成一个试样的分析；n分离能力高：在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；n 分离混合阴离子（NO3、NO2、SO42、PO43等）惟一快速、灵敏、准确的最有效分析方法 。n缺点：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。n又称凝胶（渗透）色谱，主要用于大分子的分子分离。它是基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分离的。n分离原理：固定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似于分子筛，但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小（分子量大小）先后从柱中流出。n流

11、动相：能溶解样品且与凝胶相似(润湿凝胶)、粘度小（增加扩散速度）。类型类型 材料材料 型号型号 特点特点 流动相流动相 葡萄糖凝胶葡萄糖凝胶 Sephadax 水水 软性凝胶软性凝胶 聚苯乙烯聚苯乙烯 Bio-head-S 溶胀溶胀,小分小分子分离子分离 有机溶剂有机溶剂 聚苯乙烯聚苯乙烯 Styragel 有机溶剂有机溶剂 半刚性凝胶半刚性凝胶 聚乙酸酯聚乙酸酯 Emgel(OR) 溶胀溶胀较小较小流速较小流速较小 有机溶剂有机溶剂 玻璃珠玻璃珠 CPG-10 有机溶剂和水有机溶剂和水 刚性凝胶刚性凝胶 多孔硅胶多孔硅胶 Porasil 刚性大、刚性大、高高流速分离流速分离 有机溶剂和水有机

12、溶剂和水 nHPLC仪器包括：高压输液装置 进样系统 分离系统 检测系统. 此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置.梯梯度淋洗度淋洗高压输液系统n贮液器：贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器，其孔径约的玻璃瓶，配有溶剂过滤器，其孔径约2 m，可防止颗粒物进入泵内。可防止颗粒物进入泵内。n脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。n高压泵：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、高压泵：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输

13、液泵种类分为恒压型和恒流型。耐腐蚀。输液泵种类分为恒压型和恒流型。n梯度淋洗装置：作用是在分离过程中，按一定的程序连续梯度淋洗装置：作用是在分离过程中，按一定的程序连续改变流动相中多种不同性质溶剂的配比，以改变流动相的改变流动相中多种不同性质溶剂的配比，以改变流动相的极性、离子强度或酸度等，从而提高试样的分离效率，缩极性、离子强度或酸度等，从而提高试样的分离效率，缩短分析时间，使色谱峰形得到改善，提高测定的灵敏度和短分析时间，使色谱峰形得到改善，提高测定的灵敏度和定量的准确度。定量的准确度。高压输液系统高压泵结构进样系统n隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性

14、差。装入样装入样品品出口出口进样进样采样环采样环泵入溶剂泵入溶剂进样系统n高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好。色谱柱n要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为1530cm，内径为45mm；n柱的填充：主要采用匀浆法。填充时，将制作好的匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快（防凝聚、沉降或结块）、且无空气进入（影响填充均匀性）。n紫外检测器：依据被分析组分对特定紫外光的选择性吸收。最小检测量10-9gmL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱

15、。波长波长可的松可的松氟美松氟美松皮质酮皮质酮n示差折光检测器n原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同。为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。nP88,图3-12光源光源调零调零光学零光学零参比参比样品样品平面镜平面镜透镜透镜光电转换光电转换记录仪记录仪放大器放大器遮光板遮光板n荧光检测器: 根据某些物质受激后能产生一定强度荧光的性质，可制成灵敏度极高的荧光检测器。它是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高23个数量级。适合于稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、色素、蛋白质等荧光物质的测定。 n电导检测

16、器: 基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。主要用于离子色谱的检测。一般可根据试样相对分子质量范围、溶解度及分子结构等进行分离方法的初步选择。n一、根据相对分子质量选择n二、根据溶解性选择n三、根据分子结构选择分子量分子量 水溶水溶性性 方方 法法 流动相流动相 可溶可溶 排阻色谱排阻色谱 水水 2000 不溶不溶 排阻色谱排阻色谱 水水 分配色谱分配色谱(同系物同系物) 各种各种 吸附色谱吸附色谱(异构物异构物) 各种各种 不溶不溶 排阻色谱排阻色谱(分子大小分子大小) 各种各种 反相液液色谱反相液液色谱 各种各种 可溶但不解离可溶但不解离 排阻色谱

17、排阻色谱 水水 阳离子交换色谱阳离子交换色谱(碱碱) 缓冲液缓冲液 可溶且不解离可溶且不解离 阴离子交换色谱阴离子交换色谱(酸酸) 缓冲液缓冲液 3时时, 形成双电层，在高电场的作用下，双电层中的水合形成双电层，在高电场的作用下，双电层中的水合阳离子引起毛细管中的溶液整体向负极移动，速度阳离子引起毛细管中的溶液整体向负极移动，速度V电渗流毛细管区带电泳（CZE）n最普遍、最基本的一种分离模式。最普遍、最基本的一种分离模式。n正电粒子与电渗流方向一致正电粒子与电渗流方向一致, ,速度是速度是2 2者矢量和者矢量和, ,首先出峰首先出峰; ;n中性粒子与电渗流速度一样中性粒子与电渗流速度一样; ;n电渗流速度大于电泳速度电渗流速度大于电泳速度, ,负电粒子最后出峰负电粒子最后出峰. .毛细管凝胶电泳（CGE）n将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、DNA等。3-6-5毛细管胶束电动力学色谱（MECC）n用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。n缓冲液相与胶束相之间的两相分配缓冲液相与胶束相之间的两相分配.电渗流速电渗流速胶束移动胶束移动n药物分析中应用较广药