细胞培养绪论PPT学习教案

1、会计学1细胞培养绪论细胞培养绪论第一章第一章 绪绪 论论 第1页/共54页 细胞是一切生命现象的基石和载体，事实上人细胞是一切生命现象的基石和载体，事实上人体诸多的奥秘，包括生理的和病理的都是从细胞的体诸多的奥秘，包括生理的和病理的都是从细胞的活动中揭示出来。细胞的信息传递、代谢、增殖、活动中揭示出来。细胞的信息传递、代谢、增殖、遗传、变异、分化、疾病、衰老和死亡等无一不是遗传、变异、分化、疾病、衰老和死亡等无一不是整个机体生命过程的反映，甚至是缩影。整个机体生命过程的反映，甚至是缩影。 细胞的发现和细胞学的创立是细胞的发现和细胞学的创立是“十九世纪三大发十九世纪三大发现之一现之一”；“每一个

2、生物学问题的关键最终必然从每一个生物学问题的关键最终必然从细胞中去寻找细胞中去寻找”。 研究细胞有多种方式、多条途径以及不同层次，研究细胞有多种方式、多条途径以及不同层次，但最重要的是对单个或群体细胞的观察与分析。其但最重要的是对单个或群体细胞的观察与分析。其中细胞培养几乎可以最直接、最简单和最准确地反中细胞培养几乎可以最直接、最简单和最准确地反第2页/共54页第3页/共54页一、体外培养的概念一、体外培养的概念 体外培养技术是一门以模拟体内生长条件体外培养技术是一门以模拟体内生长条件为基础而建立的为基础而建立的“活体活体”实验技术。其相对于实验技术。其相对于体内试验，具有能够简化细胞生长环境

3、、明确体内试验，具有能够简化细胞生长环境、明确生长条件、便于施加实验因素、容易获得活体生长条件、便于施加实验因素、容易获得活体直接观测结果以及方便控制培养产物等优点。直接观测结果以及方便控制培养产物等优点。第4页/共54页第5页/共54页组织培养组织培养: 指从生物体内取出活的组织指从生物体内取出活的组织(多指组织块）在体外进行培养的方法。多指组织块）在体外进行培养的方法。 组织培养的对象在体外可以发生分化并保持组织的结构和功能，但不具备器官的结构和功能特点。组织培养的对象在体外可以发生分化并保持组织的结构和功能，但不具备器官的结构和功能特点。细胞培养细胞培养：指将活细胞：指将活细胞(尤其是分

4、散的细胞尤其是分散的细胞)在体外进行培养的方法。在体外进行培养的方法。 细胞培养强调在培养过程中分散的细胞不在形成组织。包括单细胞的培养、细胞克隆化培养。细胞培养强调在培养过程中分散的细胞不在形成组织。包括单细胞的培养、细胞克隆化培养。 器官培养器官培养：指从生物体内取出活的器官：指从生物体内取出活的器官(一般是胚胎器官一般是胚胎器官) 、器官的一部分在体外进行培养的方法。、器官的一部分在体外进行培养的方法。 器官培养的对象在体外环境下也可能发生一定程度的分化，但始终保持器官的基本结构和功能特征。器官培养的对象在体外环境下也可能发生一定程度的分化，但始终保持器官的基本结构和功能特征。 事实上，

5、三种培养方法没有截然的界限。事实上，三种培养方法没有截然的界限。第6页/共54页第7页/共54页 组织培养过程中，培养组织不能在体外长期组织培养过程中，培养组织不能在体外长期维持其结构和功能，培养的时间长，经过反复传代维持其结构和功能，培养的时间长，经过反复传代，细胞出现，细胞出现单一化现象单一化现象趋向单一类型的细胞趋向单一类型的细胞最终成为细胞培养。同样细胞在体外培养时也是最终成为细胞培养。同样细胞在体外培养时也是相互依存的，而不是各自为政，表现为一定的相互依存的，而不是各自为政，表现为一定的“组组织织”特征，故组织培养和细胞培养实为同义词。特征，故组织培养和细胞培养实为同义词。 是否有体

6、内培养是否有体内培养(in vivo culture)？第8页/共54页 体内培养体内培养(in vivo culture)：将活体结构将活体结构成分成分(如活体组织、活体细胞、活体器官等如活体组织、活体细胞、活体器官等)甚至活的个体从体内或其寄生体内取出，放甚至活的个体从体内或其寄生体内取出，放在其他生物体内让其生长和发育的方法。在其他生物体内让其生长和发育的方法。 最常见的体内培养方式就是移植最常见的体内培养方式就是移植(trans-Plantation)。第9页/共54页第10页/共54页第11页/共54页（一）体外培养技术的创立（一）体外培养技术的创立1907年，实验胚胎学家年，实验胚

7、胎学家R Harrison在研究神经突起的在研究神经突起的起源时进行了一项著名的体外培养实验：起源时进行了一项著名的体外培养实验： 实验对象：蛙胚髓管部的小片组织实验对象：蛙胚髓管部的小片组织 营养成分：蛙的淋巴液营养成分：蛙的淋巴液 实验方法：盖玻片覆盖凹窝悬滴培养法实验方法：盖玻片覆盖凹窝悬滴培养法 实验结果：将实验结果：将蛙胚髓管部的小片组织在体外培养了数周之久，并蛙胚髓管部的小片组织在体外培养了数周之久，并观察到有神经突起从种植的神经组观察到有神经突起从种植的神经组织块长出。织块长出。 贡贡 献：献：Harrison的工作较为完善地建立了体外的工作较为完善地建立了体外培养活体组织的培养

8、体系，第一次较为系统地观察了体培养活体组织的培养体系，第一次较为系统地观察了体外培养活体组织的结果。被公认为是体外培养技术的开外培养活体组织的结果。被公认为是体外培养技术的开始，始，标志着体外培养技术的创立，标志着盖玻片悬滴培养法的建立，标志着神经组织体外培养的开始，也标志着神标志着体外培养技术的创立，标志着盖玻片悬滴培养法的建立，标志着神经组织体外培养的开始，也标志着神经突起是由神经细胞长出的这一重大理论的诞经突起是由神经细胞长出的这一重大理论的诞生。生。第12页/共54页第13页/共54页第14页/共54页 第15页/共54页第16页/共54页（二）体外培养技术的发展（二）体外培养技术的发

9、展u发展主要包括：发展主要包括：探讨体外培养的营养条件探讨体外培养的营养条件 试图建立化学成分明确的人工合成培养基配方以代替成分不明确的天然物质。最终导致人工合成培养基的诞生。试图建立化学成分明确的人工合成培养基配方以代替成分不明确的天然物质。最终导致人工合成培养基的诞生。试图培养不同类别的生物体组织细胞试图培养不同类别的生物体组织细胞 19131913年，年，SteinhardSteinhard以血浆凝块悬滴培养法分离培养痘苗病毒，为体外培养技术在病毒学上的应用奠定了基础。以血浆凝块悬滴培养法分离培养痘苗病毒，为体外培养技术在病毒学上的应用奠定了基础。 19151915年，年，Goldsch

10、midtGoldschmidt最早进行无脊椎动物组织的体外培养，成功培养了鳞翅目昆虫组织。最早进行无脊椎动物组织的体外培养，成功培养了鳞翅目昆虫组织。建立不同的培养技术建立不同的培养技术第17页/共54页u发展时期：以发展时期：以20世纪世纪50年代为界分为三个时期年代为界分为三个时期50年代前是培养技术在多个领域广泛发展的时期年代前是培养技术在多个领域广泛发展的时期 1933年，年，GO Gey创立了旋转管培养法，并以此建立了许多细胞系。如创立了旋转管培养法，并以此建立了许多细胞系。如1951年年Gey等以肿瘤组织为材料成功建立了等以肿瘤组织为材料成功建立了Hela细胞系。细胞系。 1948

11、年，年，KK Sanford创立了分离细胞培养法，第一次成功地从单层细胞分离出单个细胞，使得建立遗传性状相同的细胞株成为可能。创立了分离细胞培养法，第一次成功地从单层细胞分离出单个细胞，使得建立遗传性状相同的细胞株成为可能。 1949年，年，Polge等发现了甘油能够用于保护低温下贮存的细胞。等发现了甘油能够用于保护低温下贮存的细胞。第18页/共54页50年代是培养技术迅猛发展时期，多种培养技术相继年代是培养技术迅猛发展时期，多种培养技术相继被建立被建立1950年，年，JF Morgan等提出等提出199配方。配方。1951年，年，JE Shannon和和Earle建立建立T瓶（瓶（ Earl

12、e瓶）培养法。瓶）培养法。 CM Pomerat改良和设计了结构简单且易于消毒的灌流小室，改良和设计了结构简单且易于消毒的灌流小室，使得体外培养的细胞能在不断更新的培养液中生长。使得体外培养的细胞能在不断更新的培养液中生长。1954年，年， Earle等建立了悬浮培养法。等建立了悬浮培养法。1955年，年，H Eagle等建立著名的等建立著名的Eagle培养基配方。培养基配方。1957年，年，Dulbecco等开始采用胰蛋白酶消化处理来分离细胞的方法以等开始采用胰蛋白酶消化处理来分离细胞的方法以及应用液体培养基的方法，使得体外培养单层细胞成为可能。及应用液体培养基的方法，使得体外培养单层细胞成

13、为可能。1959年，年，Lovelock等发现了一种新的化学冷冻保护剂等发现了一种新的化学冷冻保护剂-二甲基亚砜。二甲基亚砜。1960年，年，G Barski等在两种不同类型的细胞混合培养物中，发现不同细等在两种不同类型的细胞混合培养物中，发现不同细胞间存在自发融合现象。胞间存在自发融合现象。第19页/共54页第20页/共54页50年代后是体外培养技术与生命科学其它技术结合年代后是体外培养技术与生命科学其它技术结合发展的新时期，诞生了多种培养的应用技术发展的新时期，诞生了多种培养的应用技术 以体外培养技术为基础的应用杂交瘤技术制备单克隆抗体的技术、动物细胞大规模培养技术、微生物制药技术、基因转

14、染与细胞融合以及细胞转化等细胞工程技术。以体外培养技术为基础的应用杂交瘤技术制备单克隆抗体的技术、动物细胞大规模培养技术、微生物制药技术、基因转染与细胞融合以及细胞转化等细胞工程技术。 1967年，年，AL Van Wezel创立了微载体技术用于体外大规模培养。创立了微载体技术用于体外大规模培养。 1972年，年，RA Knazek等创立了中空纤维细胞培养技术，模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的等创立了中空纤维细胞培养技术，模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的“毛细血管毛细血管”中空纤维给体外培养的细胞提供物质代谢条件。标志着体外培养技术从过去以二维生长条件跨越到以三维生长条件进行体

15、外培养的新阶段。中空纤维给体外培养的细胞提供物质代谢条件。标志着体外培养技术从过去以二维生长条件跨越到以三维生长条件进行体外培养的新阶段。 第21页/共54页 现代组织培养的三个阶段现代组织培养的三个阶段第一阶段第一阶段 悬滴培养悬滴培养 悬滴培养法具有简便的特点，其次由于培养基中有纤维蛋白构成的支悬滴培养法具有简便的特点，其次由于培养基中有纤维蛋白构成的支架，可供细胞向四面八方生长，培养物是立体的。在此环境中，细胞不架，可供细胞向四面八方生长，培养物是立体的。在此环境中，细胞不仅能增殖生长，也能发生分化，如心肌发生搏动等。仅能增殖生长，也能发生分化，如心肌发生搏动等。 缺陷：空间狭小、气体不

16、足、培养液少、难以大量繁殖细胞，观察不缺陷：空间狭小、气体不足、培养液少、难以大量繁殖细胞，观察不方便等。方便等。第二阶段第二阶段 单层培养单层培养 单层细胞培养和体内细胞比仍然有很大差距单层细胞培养和体内细胞比仍然有很大差距(缺少细胞基质、血液供缺少细胞基质、血液供应、调控因子应、调控因子) 。细胞只有长和宽二维结构，大多细胞会失去原体内时立。细胞只有长和宽二维结构，大多细胞会失去原体内时立体的形态，也是细胞生物学性状发生改变的主要原因。细胞在形态、功体的形态，也是细胞生物学性状发生改变的主要原因。细胞在形态、功能上与体内时不同，多数不能充分表达原基因产物。能上与体内时不同，多数不能充分表达

17、原基因产物。第三阶段第三阶段 三维培养三维培养(立体培养立体培养) 为培养细胞提供与体内相似的支架系统，创建与原体内类似的条件，为培养细胞提供与体内相似的支架系统，创建与原体内类似的条件，不仅能促进细胞增殖，也可使细胞发生分化和表达体内时的某些产物。不仅能促进细胞增殖，也可使细胞发生分化和表达体内时的某些产物。第22页/共54页u 现代组织培养的重要标志：现代组织培养的重要标志： 培养液的改变培养液的改变 培养容器的改变培养容器的改变 培养方法的改进：培养方法的改进： 1948年年Sanford创立了单细胞分离培养法创立了单细胞分离培养法 1957年蛋白酶消化组织，分离细胞年蛋白酶消化组织，分

18、离细胞 液体培养基的应用液体培养基的应用 细胞培养用的多种材料都已商品化、规范化和细胞培养用的多种材料都已商品化、规范化和系列化。系列化。 低温冷冻技术的应用，可将已建立的多种细胞低温冷冻技术的应用，可将已建立的多种细胞系和细胞株长期冻存。系和细胞株长期冻存。第23页/共54页第24页/共54页 （三）我国细胞培养技术的发展（三）我国细胞培养技术的发展20世纪世纪30年代细胞培养传入我国，年代细胞培养传入我国，50年代以后组织培年代以后组织培养在我国逐渐开展起来。养在我国逐渐开展起来。李继侗、沈同李继侗、沈同(银杏胚胎的培养银杏胚胎的培养)、罗宗洛和罗士伟、罗宗洛和罗士伟(玉米根尖生长锥的培养

19、玉米根尖生长锥的培养)是植物组织培养的先驱者。是植物组织培养的先驱者。细胞学家张钧、鲍鉴清和杨敷海等则最早将动物组织培养引入我国。细胞学家张钧、鲍鉴清和杨敷海等则最早将动物组织培养引入我国。病毒分离培养：汤飞凡、郭辉玉、顾方舟等病毒分离培养：汤飞凡、郭辉玉、顾方舟等昆虫组织培养：高尚荫、刘年翠等昆虫组织培养：高尚荫、刘年翠等肿瘤培养：曾毅、鄂征、潘琼婧、何申、姚开泰等肿瘤培养：曾毅、鄂征、潘琼婧、何申、姚开泰等神经细胞培养：鲍璇、邵文钊、郭畹华等神经细胞培养：鲍璇、邵文钊、郭畹华等干细胞培养：姚鑫、吴祖泽等干细胞培养：姚鑫、吴祖泽等第25页/共54页三、体外培养技术的主要类别三、体外培养技术的

20、主要类别 按照体外培养的对象，可分为按照体外培养的对象，可分为全部培养全部培养和部和部分培养两大类：分培养两大类：全部培养：全部培养：指对生物个体进行培养。对象一般是指对生物个体进行培养。对象一般是微小的生物个体，如微生物、寄生虫等。微小的生物个体，如微生物、寄生虫等。部分培养：部分培养：指对生物个体的一部分进行培养的技指对生物个体的一部分进行培养的技术。术。 组织培养、器官培养、细胞培养组织培养、器官培养、细胞培养第26页/共54页四、体外培养技术的应用四、体外培养技术的应用在组织学与胚胎学上的应用：培养胚胎器官，研究其分化和发育过程。是研究胚胎发生、发育过程中诱导现象、发育潜能、胚胎致畸作

21、用、环境诱变等衍生、演化生长行为及其机制的重要手段。在组织学与胚胎学上的应用：培养胚胎器官，研究其分化和发育过程。是研究胚胎发生、发育过程中诱导现象、发育潜能、胚胎致畸作用、环境诱变等衍生、演化生长行为及其机制的重要手段。在细胞生物学上的应用：广泛由于细胞形态学、细胞生理、细胞遗传学研究。在细胞生物学上的应用：广泛由于细胞形态学、细胞生理、细胞遗传学研究。肿瘤学方面的研究：肿瘤细胞生物学特性研究肿瘤学方面的研究：肿瘤细胞生物学特性研究 肿瘤发病机制研究肿瘤发病机制研究 异种移植研究异种移植研究第27页/共54页在微生物学领域的应用：病毒学、细菌学在微生物学领域的应用：病毒学、细菌学在免疫学方面

22、的应用：抗体的产生、单克隆抗体的制备在免疫学方面的应用：抗体的产生、单克隆抗体的制备在药理学领域的应用：药物筛选、细胞毒性和活性检测在药理学领域的应用：药物筛选、细胞毒性和活性检测动物细胞与微生物大规模培养技术在生产实践上的应用：疫苗、单克隆抗体、干扰素、激素、生长因子、酶制剂等动物细胞与微生物大规模培养技术在生产实践上的应用：疫苗、单克隆抗体、干扰素、激素、生长因子、酶制剂等在现代医学领域的应用：以培养细胞移植修复骨和软骨缺损、体外受精产生试管婴儿、转基因动物、干细胞移植、器官移植等。在现代医学领域的应用：以培养细胞移植修复骨和软骨缺损、体外受精产生试管婴儿、转基因动物、干细胞移植、器官移植

23、等。第28页/共54页第29页/共54页 可同时方便获得大量细胞类型单一、细胞周期同步、生物学性状基本相同并对实验因素反应一致的细胞群。可同时方便获得大量细胞类型单一、细胞周期同步、生物学性状基本相同并对实验因素反应一致的细胞群。 能够进行大规模生物制品的生产。利用体外培养技术可以大量繁殖动物细胞或微生物以生产生物制品。能够进行大规模生物制品的生产。利用体外培养技术可以大量繁殖动物细胞或微生物以生产生物制品。 与体内环境相比，体外培养细胞在一定程度上失去了组织联系及相互作用，缺乏在体内时的血运和神经体液调节作用，因此不能将体外实验结果一并推至体内，即不能轻易下结论与体内环境相比，体外培养细胞在

24、一定程度上失去了组织联系及相互作用，缺乏在体内时的血运和神经体液调节作用，因此不能将体外实验结果一并推至体内，即不能轻易下结论。第30页/共54页六、组织培养常用术语六、组织培养常用术语第31页/共54页 3.Cell culture(细胞培养细胞培养)：细胞在体外条件下：细胞在体外条件下的生长。的生长。 4. Cell fusion(细胞融合细胞融合)：体外培养条件下，：体外培养条件下，经化学试剂、病毒或物理方法诱发，使同种或不同经化学试剂、病毒或物理方法诱发，使同种或不同种的种的2个或个或2个以上体细胞融合产生杂交细胞的过个以上体细胞融合产生杂交细胞的过程。程。 5. cell gener

25、ation time(细胞一代时间细胞一代时间)：是指：是指单个细胞两次连续分裂的时间间隔。可借助显微镜单个细胞两次连续分裂的时间间隔。可借助显微镜电影照相术来精确确定。电影照相术来精确确定。 6.Primary culture（原代培养）：是指直接取（原代培养）：是指直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。自生物体细胞、组织或器官开始的培养。第32页/共54页第33页/共54页第34页/共54页第35页/共54页第36页/共54页第37页/共54页第38页/共54页第39页/共54页第40页/共54页第41页/共54页第42页/共54页第43页/共54页第44页/共54页称为称为G0期。期

26、。第45页/共54页23.细胞株细胞株(cell strain)：是由具有某些特性与标：是由具有某些特性与标志的细胞选择或克隆化而派生的亚系，这些特性志的细胞选择或克隆化而派生的亚系，这些特性或标志在随后的培养中必须保持下去。或标志在随后的培养中必须保持下去。第46页/共54页第47页/共54页第48页/共54页 在培育多利的过程中，科学家采用体细胞克隆技术，主要分在培育多利的过程中，科学家采用体细胞克隆技术，主要分四个步骤进行：四个步骤进行： 从一只六岁雌性的芬兰多塞特从一只六岁雌性的芬兰多塞特(Finn Dorset)白面绵羊白面绵羊(称称之为之为A)的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的

27、培养液中，细的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为供体细胞。胞逐渐停止分裂，此细胞称之为供体细胞。 从一头苏格兰黑面母绵羊从一头苏格兰黑面母绵羊(称之为称之为B)的卵巢中取出未受精的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞。胞称之为受体细胞。 利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成融合细胞。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应融合细胞。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞。胚胎细胞。 将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊将胚胎细