五分类血球仪的应用介绍与进展2

1、 1590 年荷兰人米德尔堡和詹森设计制造了最原始的显微镜（图1），1610 年伽利略使用望远镜观察小的物体并将其放大，后来被列文霍克改进成为原始的显微镜。1658 年意大利人马尔皮基应用最原始的显微镜首先观察到了红细胞，他是第一个见到红细胞的人，开始进行红细胞计数则是200 年后的事情了。而设计并生产出第一台血细胞计数仪则又过了近100 年。自从发明了显微镜以后，人们从微观世界中了解和观察到了血液的组成，并根据他们的特点分别将它们称为红细胞和白细胞和血小板。在以后的研究中，人们发现许多疾病的发生和发展与血液中的细胞数量之间存在一定的关系。依据对疾病诊断的需求，人们开始寻求对血液中细胞的数量进

2、行计数。1852 年就有人开始设计对红细胞的计数办法，1855 年发明了用于计数血细胞的计数板， 目前仍然使用的改良Neubauer 计数板就是应用最为广泛和持续时间最为长久的经典一种，虽然各种类型的血细胞计数仪已在广泛使用，但血细胞计数板法仍然是最为可靠和最为经典的计数技术，它不仅适用于血细胞计数， 还可用于其他细胞、动物血细胞、微小粒子及需要在显微镜下计数的各种样品，因此计数板仍然是检验工作者应该掌握的基本技能，是不应该忘记和放弃的手段。 计数原理是根据血细胞的不良导电性和产生电阻抗原理来计数血液中的细胞，也就是电阻式血细胞计数原理，这种原理现在已经成为血细胞计数和分析中最为经典的原理。现

3、在，95%的血细胞分析仪采用库尔特原理负压负压血细胞悬液外电极外电极内电极内电极小孔小孔小孔管小孔电流样品杯小孔近观在等渗电解质溶液（稀释液）中，有一个用于细胞计数的小孔管，其内侧充满了稀释液，并有一个内电极，其外侧细胞悬液中有个外电极，小孔两侧的电极之间有稳定的电流。细胞为相对不良导体，其导电性质比稀释液低，当有个细胞通过小孔，于瞬间引起了电压变化而出现脉冲信号，脉冲的数量与细胞的数量成正比，高度与细胞体积成正比。脉冲信号经放大，阈值调节，甄别，整形后，送入计数系统进行处理，得出被测细胞的数量和体积分布直方图。检测区域红细胞Oscilloscope示波镜示波镜检测区域白细胞示波镜示波镜此后，

4、欧洲、日本也开始了血液细胞计数仪的开发和研制,我国在60年代中期也开始了这种仪器的开发和生产。例如日本Sysmex 公司1962 年就生产了可进行红细胞和白细胞计数的CC-1001 型血球计数仪，我国1965年在上海也生产了简单的血细胞计数仪，1975 年北京医疗仪器厂也开始模仿设计自己的简单的红白细胞计数仪。到目前为止已经有许多国家开始生产各种类型的血细胞分析仪，经过半个多世纪的发展，这种仪器已经有了非常明显的进步。以前因为只能进行细胞计数，因此我们一般将这类仪器叫做血细胞计数仪（Blood Cell Counter）,由于技术的进步目前这类仪器可以提供除了血细胞计数以外的更多参数的联合测定

5、和分析，因此我们一般将这类仪器统称为血液细胞分析仪(Hematology Analyzer) 。 1、稀释技术的进步 2、分析参数的增加 3、血小板计数功能的增加 4、自动取样技术 5、仪器的清洗技术 6、小孔管技术的改进 1. 激光法：应用单束激光照射到经过鞘流技术处理的排列成一列的单个细胞上，根据细胞阻断激光束的频率以及PMT 收集到的激光折射信号，对细胞的数量、体积进行分析的仪器。 2. 离心式血液分析仪：将血液充入到含义特殊试剂的毛细管内，在专用离心机上离心，根据血细胞中各种成份的比重不同而分布在不同的细胞层内的原理，血细胞被吖啶橙染色，各细胞层会有明显的颜色差异，然后将毛细管放在特殊

6、的判读机上对不同的细胞层进行定量分析. 3. 移动光学法：早期的光学法血细胞计数仪器， 采用普通光源，血细胞在移动过程中被检测到，不能分析细胞的大小和内部结结构，因此仅可进行红细胞和白细胞的计数 直方图-X轴：体积（fL）-Y轴：相对数量通道划分RBC直方图：36-360fLPLT直方图：2-20fLWBC直方图：35-450fL作用：删除不规则脉冲对体积测量的影响。作用：删除不规则脉冲对体积测量的影响。 小 孔 近 观 作用：纠正因重叠而导致的对颗粒计数和体积测量的影响。作用：纠正因重叠而导致的对颗粒计数和体积测量的影响。血小板计数以三次拟合的均值为依据；对血小板浓度小于67X109/L的标

7、本，仪器自动延长1-2个三次计数。 三次计数：统计补偿；监控计数过程的稳定性。 延长计数：针对低浓度的标本。测试区域测试区域红细胞回流红细胞回流红细胞红细胞血小板血小板+-测试区域测试区域红细胞被扫红细胞被扫流液冲走流液冲走RBCPLT+-扫流液扫流液 作用：防止红细胞回流对血小板计数的干扰； 防止细胞再度进入感应区被两次计数。在血小板的直方图上可见两条曲线：一条是 2fl-20fl 的原始数据曲线;另一条是 0fl-70fl 的拟合曲线.由最小平方回归法定义出一条对数正态曲线，由最小平方回归法定义出一条对数正态曲线，即拟合曲线；即拟合曲线； 血小板计数的干扰主要来自:2 fl以下：噪音;细菌

8、的干扰20 fl以上：裂红细胞;小红细胞;白细胞的干扰 对曲线下的面积进行积分计算； 将该面积值校准到参考的PLT计数； 获得与参考方法最具相关性的血小板数值. 在0-70 fL范围的非血小板脉冲被拟合曲线排除于血小板计数之外； 大大增加了血小板的线性范围(0-1,500,000) 三分群： 小细胞 单个核细胞 粒细胞 五分类： 淋巴细胞 单核细胞 中性粒细胞 嗜酸细胞 嗜碱细胞LymphocyteMonocyteGranulocyte小细胞小细胞单个核细胞单个核细胞粒细胞粒细胞淋巴淋巴嗜碱嗜碱单核单核嗜酸嗜酸中性粒细胞中性粒细胞 各种单纯电阻法血细胞分析仪的白细胞三分群法原理是根据白细胞体积

9、分布直方图进行分析和计算得到的。经过特殊溶血剂处理的白细胞，可将特定的细胞群进行处理，使得绝大多数淋巴细胞体积缩小，使得中性粒细胞体积适当增大。因此在白细胞分布直方图上出现两个明显的细胞分布峰。左侧体积较小的一群细胞称为淋巴细胞群（LYM），右侧体积较大的称为粒细胞群（GRAN），位于两者之间的称为中间细胞群（MID）， 中间细胞群一般指含有嗜酸粒细胞，嗜碱粒细胞和单核细胞的细胞群。 进入90年代中期以来，国外许多厂家已经不满足于三分类型的血细胞分析仪，逐步开始研制和推出具有五分类或更多项白细胞分析技术的全自动型血液分析仪器，比较著名的厂家有：Coulter 、Sysmex 、ABBOTT 、

10、Bayer 、ABX等。各厂家使用的白细胞分类技术多样化， 复杂化，使得白细胞分类技术更加成熟和可靠。而技术的提高也带来了仪器和消耗品（试剂）价格的增加。 运用V、C、S三种探针,在流式通道的某一位点,对通过的单列白细胞，进行逐个的、同时的、三重的检测，以及三维分析,以确定其亚群性质。V-低频波，分析细胞体积；C-高频波，分析细胞核型；S-激光，分析细胞的颗粒特性。接近原态的白细胞八千多个白细胞逐个、直接八千多个白细胞逐个、直接、同时地在流式通道内接受、同时地在流式通道内接受VCS三重检测，得到各自的三重检测，得到各自的三维座标值三维座标值VCS 0-3 (相对大小)V是以参考的直流电阻方法检

11、测整个细胞的体积普通流式方法根据激光的前向散射估计细胞的相对大小激光VCS - DC 7-10(复杂性)RF运用类似于超声波的高频波测量细胞的内部结构普通流式方法根据激光的低角度散射估计细胞的复杂性激光VCS - RF 细胞越大，它发出射频信号所需要的时间就越长； 因此，细胞大小对射频信号具有影响； 这种影响可以减弱对LY、MO、和GR的分辨效果。VolumeRF 已知细胞体积，可对射频信号作体积补偿； 使信号的变化只受细胞内部结构的影响； 阻光性测量核的密度和分叶性，使更好地区分细胞。VolumeOpacity高频传导信号大的细胞高频传导信号大的细胞嗜中性、嗜酸性、嗜碱性粒细胞高频传导信号小

12、的细胞高频传导信号小的细胞淋巴、单核细胞9O deg.激光VCS - LaserS是运用一个宽角度的散射范围（10-70）来测量细胞的颗粒特性普通流式方法运用单角度/側向激光散射测量细胞的颗粒特性激光散射信号大的细胞激光散射信号大的细胞嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞激光散射信号小的细胞激光散射信号小的细胞淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞 将检测过的8,192个细胞分布到一个以V、C、S为三维坐标的空间内，显示出细胞群特征。 高智能的计算机软件分析分析细胞群的位置、相对密度、轮廓、和大小。 三维坐标的数据分析位点多过 16 106个。 接近原态的白细胞分析一个分类试剂包 Scatter Pak双试剂

13、系统的作用 去红细胞: 红细胞溶解剂通过渗透压差溶解红细胞； 保持白细胞原态: 溶解终止液令白细胞恢复到“接近原态”大小。12345678910 区别于酸碱染色、酶染色、糖原染色 核酸染色物质（荧光物质） Polymethine （聚次甲基） Oxazine (口恶嗪） 不同的细胞亚群、不同的成熟阶段，其核酸的含量，核酸的结构，DNA/RNA的比例不同，表现不同的着色性。 与半导体激光有很好的适配性，633nm激发荧光u半导体激光流式细胞术加核酸荧半导体激光流式细胞术加核酸荧光染色光染色u电阻抗加射频电阻抗加射频u双鞘流技术双鞘流技术半导体激光器 (=633nm)双色分光镜光电倍增管（荧光信号

14、）流动室光电倍增管（侧向散射光信号）光电二极管（前向散射光信号）激光束激光束 ( =633nm)侧向荧光：侧向荧光：DNA/RNA信息信息侧向散射光：侧向散射光：细胞内结构信息细胞内结构信息前向散射光：前向散射光：细胞体积信息细胞体积信息FluorescenceSide ScatterBlasts/ Atypical LymphImmature GranMonoLymphEOLeftShiftNeutNRBCBASO 试剂作用示意图试剂作用示意图BASOother WBCRBC溶溶血血(酸酸性性, 低低渗渗溶溶血血素素)前后细前后细胞形态的变化胞形态的变化WBC/BASO-散点图散点图Side

15、 Scatter (Internal structure)Forward Scatter(Volume)BASOWBCRET 试剂作用示意图试剂作用示意图染色染色: Ploymethine: RNAOxazine: DNARETWBCRBC高荧光信号高荧光信号很低荧光信号很低荧光信号非常强的荧光信号非常强的荧光信号Fluorescence(RNA)RET-散点图散点图Forward Scatter(Volume)MFRHFRLFRPLTRBC-ORETWBCIRF体积荧光 ABX Pentra 系列全自动五分类血细胞分析仪，采用了白细胞计数通道，双鞘流检测通道(LMNE 散点图)和白细胞/嗜碱

16、细胞（WBC/BAOS）通道同时进行检测来完成白细胞五分类的全面分析。LMNE 检测通道采用三种技术原理同时进行白细胞的分类：1、双鞘流原理（DHSS）2、细胞化学染色（Cytochemistry）结合吸光法原理3、鞘流阻抗技术（Focused Flow Impendance）。白细胞/嗜碱细胞检测通道：采用生物溶解技术，阻抗技术，域值界标技术进行白细胞计数及嗜碱细胞的检测。 ABX 采用了先进的DHSS 专利检测技术，在分析五分类的同时能够检测两群异常白细胞亚群：巨大未成熟细胞（LIC）百分比及绝对值 异型淋巴细胞（ALY）百分比及绝对值。 ABX 先进的白细胞分类原理能够满足临床对异常细胞

17、群的较高检测灵敏度，能够提供82 种不同的报警信息及提示信息，形成了一套非常完整的白细胞分类的报警系统。 1.激光散射和细胞化学染色技术 ：仪器在白细胞分类上采用了白细胞过氧化酶测定通道和嗜碱粒细胞测定通道。根据细胞化学染色的特性进行白细胞分类。早期的原始粒细胞为阴性，原始粒细胞以下各阶段都含有过氧化物酶，并随着细胞的成熟而增强。不同的粒细胞过氧化物酶含量不同，嗜酸性粒细胞具有最强的过氧化物酶，中性粒细胞含有较强的过氧化物酶，嗜碱粒细胞不含此酶。单核细胞除早期原始阶段外，均含有较弱的过氧化物酶。淋巴细胞不含过氧化物酶。根据激光法散射光强度进行的细胞体积的测量同时也获得了细胞大小的信息，在白细胞

18、过氧化物酶散点图上，X 轴表现过氧化物酶强度，过氧化物酶强阳性细胞位于右端；Y 轴表现散射光强度信号，位于上方的表示散射光信号强，细胞体积大。除了嗜碱细胞外每个类型的细胞根据它们的特点被记录于特定的位置，在设定的门的范围内形成分类 。 2.多角度偏振光散射法应用于白细胞五分类（MAPSS 技术）： 该技术的基本原理是标本在水动力聚焦系统的作用下进入检测部，在激光束的照射下，细胞在多个角度都产生散射光。仪器特别设置了四个角度来收集散射光的信号。0 度为前角光散射， 用于粗略判断细胞体积大小；10 度为狭角散射， 用于检测细胞结构及其内部复杂性的指标；90 度为垂直光散射，用于对细胞内部颗粒及细胞

19、核分叶情况的分析；90 度偏振光散射，基于颗粒可以将垂直角度的激光消偏振的特性，将嗜酸性细胞从中性粒细胞和其他细胞中分离出来。根据散射光的角度和位置，仪器内部的四个检测器可以接收到相应的信号，由仪器内部的微处理器进行分析处理，不同的细胞将被安置在散点图上的相应位置，根据计算将结果白细胞分类结果得到 1、血常规检验多参数化 2、多功能合成扩展 3、检测速度的提高 4、方法的改进和进展 5、应用的方便性 白细胞分类散点图上分类良好，各细胞亚群清晰 嗜酸细胞亚群细胞增多 白细胞分类散点图上淋巴细胞区域细胞较多，一部分位于异型淋巴细胞区域 涂片可见较多异型淋巴细胞 手工涂片结果为： 中性粒细胞 14%

20、 淋巴细胞 59% 单核细胞 3% 嗜酸细胞 4% 嗜碱细胞 2% 异型淋巴细胞 18% 病人接受过输血 红细胞直方图左移并出现双峰，右侧峰为输入的正常细胞峰；左侧为小红细胞峰，且左端上抬 血小板直方图受小红细胞影响在20fl处上扬 此病人由维生素B12缺乏引起 红细胞直方图右移，提示红细胞较大 RDW增高，提示红细胞大小不一 白细胞分类散点图下方出现较多红细胞碎片 涂片可见红细胞大小不一、大红细胞及畸形红细胞 白细胞分类散点图下方出现大量未溶解镰形红细胞 由于未溶解的镰形红细胞参与白细胞分类，导致PC2报警 镰形红细胞影响白细胞在35fl处的计数，触发*R报警 疟原虫细胞影响白细胞在35fl

21、处的计数，触发*R的报警 白细胞散点图下方出现疟原虫细胞群 未溶解的红细胞影响白细胞在35fl处的计数，触发*R报警 白细胞分类散点图下方出现大量未溶解红细胞 红细胞直方图左侧出现一个小峰，系由红细胞碎片引起 碎片参与白细胞分类，导致PC2报警，在分类散点图下方出现大量红细胞碎片 碎片影响血小板计数，血小板直方图在20fl处上扬 MCH结果为40.4，MCHC结果为396，提示怀疑冷凝集 由于红细胞发生凝集导致红细胞数量降低，MCV增高 温育后红细胞数量恢复正常 MCV、MCH、MCHC都恢复正常 白细胞计数和分类前后无影响 MPV增高提示血小板体积增大 在白细胞散点图下方出现大血小板 MPV降低提示血小板体积偏小 直方图上血小板呈现非正态分