基因突变和基因组

1、 基因突变种类基因突变种类 癌的遗传学基础癌的遗传学基础 人类基因组计划人类基因组计划 DNADNA操作技术操作技术10 基因突变和基因组基因突变和基因组基因突变基因突变 指一个基因中的指一个基因中的DNADNA改变，最终造成遗传多样性改变，最终造成遗传多样性10.1 基因突变种类基因突变种类.碱基对改变碱基对改变( (点突变点突变).转座因子转座因子10.1.1 碱基对改变碱基对改变T 如果一个基因上原来的一个碱基对被另一个碱基对取代，如果一个基因上原来的一个碱基对被另一个碱基对取代，称为点突变称为点突变 置换（同义突变、错义突变、无义突变）置换（同义突变、错义突变、无义突变） 插入或缺失（

2、移码突变）插入或缺失（移码突变）1、置换、置换 同义突变同义突变 错义突变错义突变 无义突变无义突变 同义突变同义突变（same sense mutationsame sense mutation） 碱基被替换之后，产生了新的密码子，但新旧密码子同义，碱基被替换之后，产生了新的密码子，但新旧密码子同义，所编码的氨基酸种类保持不变，因此同义突变并不产生突所编码的氨基酸种类保持不变，因此同义突变并不产生突变效应变效应 。 错义突变（错义突变（missense mutationmissense mutation） 碱基替换使编码某种氨基酸的密码子变成编码另一种碱基替换使编码某种氨基酸的密码子变成编码

3、另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。发生改变。 无义突变无义突变（non-sense mutationnon-sense mutation） 碱基替换使编码氨基酸的密码变成终止密码碱基替换使编码氨基酸的密码变成终止密码UAAUAA、UAGUAG或或UGAUGA。T代替代替G2 2、插入或缺失、插入或缺失移码突变移码突变 根据基因突变发生的原因，可将突变分为：根据基因突变发生的原因，可将突变分为： 自发突变自发突变和和诱发突变诱发突变 在自然条件下，在自然条件下，未经人工处理未经人工处理而发生的突变为自发突变而发生的突变为自

4、发突变 经人工处理经人工处理而发生的突变是诱发突变而发生的突变是诱发突变3、突变的诱发突变的诱发诱变剂诱变剂4能诱发基因突变的各种内外环境因素统称为能诱发基因突变的各种内外环境因素统称为诱变剂（诱变剂（mutagenmutagen）q物理诱变剂：各种射线等物理诱变剂：各种射线等q化学诱变剂化学诱变剂紫外线诱发的胸腺嘧啶二聚体常见的化学诱变剂有：常见的化学诱变剂有：碱基类似物碱基类似物：以假乱真：以假乱真如：如：5-Bu(5-Bu(酮式与酮式与T T结构相似，烯醇式与结构相似，烯醇式与G G结构相似结构相似) )，可以，可以置换置换T T或或G G丫啶类染料、氮芥类衍生物丫啶类染料、氮芥类衍生物

5、：造成：造成DNADNA增加一、二个碱基，增加一、二个碱基， 引起移码突变引起移码突变亚硝酸或烷化剂亚硝酸或烷化剂: :可以改变核酸中核苷酸化学组成可以改变核酸中核苷酸化学组成 M Me eC CG G5 53 35 53 3G G5 53 35 53 35 53 35 53 3T TG G5 53 35 53 3C C脱脱氨氨作作用用野野生生D DN NA A复复制制突突变变D DN NA A野野生生D DN NA AT TA AHNO210.1.2 转座因子转座因子 麦克林托克在某些玉米籽粒中发现玉米籽粒颜色的遗传很麦克林托克在某些玉米籽粒中发现玉米籽粒颜色的遗传很不稳定，有时籽粒上还出现

6、一些斑斑点点。不稳定，有时籽粒上还出现一些斑斑点点。 她通过耐心的记录和仔细的分析，发现使籽粒着色的色素她通过耐心的记录和仔细的分析，发现使籽粒着色的色素基因是在某一特定带上基因是在某一特定带上“接上接上”或或“拉断拉断”的。的。 解离因子解离因子(Ds,Dissociation)(Ds,Dissociation)抑制红、紫颜色的产生抑制红、紫颜色的产生 激活因子激活因子(Ac,Activator)(Ac,Activator) 使颜色产生使颜色产生 麦克林托克花了麦克林托克花了6 6年时间年时间(1944(19441950)1950) 发现玉米的发现玉米的“Ds-Ds-AcAc调控系统调控系统

7、” 19511951年，在冷泉港生物学专题讨论会上，麦克林托克递交年，在冷泉港生物学专题讨论会上，麦克林托克递交了自己的学术论文，向科学界同行报告了她的新理论。了自己的学术论文，向科学界同行报告了她的新理论。 她提出遗传基因可以转移，能从染色体的一个位置跳到另她提出遗传基因可以转移，能从染色体的一个位置跳到另一个位置，甚至从一条染色体跳到另一条染色体上。一个位置，甚至从一条染色体跳到另一条染色体上。 她把这种能自发转移的遗传基因称为她把这种能自发转移的遗传基因称为“转座因子转座因子” 。 “转座因子转座因子”除了具有跳动的特性之外，还具有控制其他除了具有跳动的特性之外，还具有控制其他其因开闭的

8、作用，因此其因开闭的作用，因此“转座因子转座因子”又可叫做又可叫做“控制因控制因子子”。T 巴巴拉巴巴拉麦克林托克的发现，当时几乎不被科学界所接受麦克林托克的发现，当时几乎不被科学界所接受T 直到直到2020世纪世纪6060年代末，美国细菌学家年代末，美国细菌学家J.ShapiroJ.Shapiro夏皮罗夏皮罗在研在研究大肠杆菌乳糖操纵子时，发现有一类可以移动的因子，究大肠杆菌乳糖操纵子时，发现有一类可以移动的因子，会导致基因的插入失活和自主恢复活性，从而确认了转座会导致基因的插入失活和自主恢复活性，从而确认了转座因子的存在因子的存在T 19831983年，巴巴拉年，巴巴拉麦克林托克荣获诺贝尔

9、生理学和医学奖。麦克林托克荣获诺贝尔生理学和医学奖。 转座子可以分为两大类：以转座子可以分为两大类：以DNA-DNADNA-DNA方式转座的转座子和反转方式转座的转座子和反转录转座子录转座子第一类转座子可以第一类转座子可以通过通过DNADNA复制复制或或直接切除直接切除两种方式获得可移两种方式获得可移片段，重新插入基因组片段，重新插入基因组DNADNA中。中。转转录录反反转转录录酶酶D DN NA A新新链链合合成成拷拷贝贝插插入入复复制制插插入入转转座座子子逆逆转转座座子子基基因因组组D DN NA AR RN NA AD DN NA A真真核核细细胞胞转转座座子子的的运运动动 根据转座的自

10、主性，这类元件又可以分为自主转座元件和根据转座的自主性，这类元件又可以分为自主转座元件和非自主转座元件，非自主转座元件， 前者本身能够编码转座酶而进行转座，后者则需在自主元前者本身能够编码转座酶而进行转座，后者则需在自主元件存在时方可转座，件存在时方可转座， 以玉米的以玉米的Ac/DsAc/Ds体系为例：体系为例： Ac(Activator)Ac(Activator)属于自主元件，属于自主元件， Ds(Dissociation)Ds(Dissociation)则是非自主元件，必需在则是非自主元件，必需在AcAc元件存在下元件存在下才能转座才能转座4转座插入可引起转座插入可引起插入突变插入突变、

11、新基因产生新基因产生及及染色体染色体畸变畸变等遗传学效应等遗传学效应4基因组中基因组中DNA转座不仅可用于解释染色体缺失、转座不仅可用于解释染色体缺失、倒位等遗传现象，而且还可用于构建新的突变株倒位等遗传现象，而且还可用于构建新的突变株在几乎所有物种中都发现了与转座子相关的序列在几乎所有物种中都发现了与转座子相关的序列如人类中的如人类中的AluAlu（阿奴）因子（阿奴）因子 人的人的AluAlu因子约占人基因组因子约占人基因组10%10%，由，由300bp300bp构成基本单位，构成基本单位，在每个细胞中约有数十万拷贝在每个细胞中约有数十万拷贝 AluAlu因子比绝大多数功能性转座因子短得多，

12、不编码任因子比绝大多数功能性转座因子短得多，不编码任何蛋白质何蛋白质 人的人的DNADNA中，由于中，由于AluAlu因子转座插入，可导致血友病和因子转座插入，可导致血友病和家族性高胆固醇血症等发生家族性高胆固醇血症等发生 一种罕见的人类神经紊乱疾病一种罕见的人类神经紊乱疾病腿和脚的肌肉以及神腿和脚的肌肉以及神经逐渐退化疾病，是由类似果蝇的转座因子经逐渐退化疾病，是由类似果蝇的转座因子MarinerMariner插插入入1717号染色体所致号染色体所致10.2 脱离正常轨道的细胞脱离正常轨道的细胞癌细胞癌细胞 在动物和人体中，在动物和人体中，由于细胞分裂调节失控由于细胞分裂调节失控而无限增殖的

13、细而无限增殖的细胞称为肿瘤细胞胞称为肿瘤细胞 恶性肿瘤是指具有转移能力的肿瘤细胞离开原来的部位，恶性肿瘤是指具有转移能力的肿瘤细胞离开原来的部位，扩散到新的组织、器官形成的新的肿瘤扩散到新的组织、器官形成的新的肿瘤癌细胞的主要特征癌细胞的主要特征T 能自身提供充足的生长信号能自身提供充足的生长信号T 对抑制对抑制/抗生长信号不敏感抗生长信号不敏感T 能逃避细胞凋亡能逃避细胞凋亡T 有无限复制的潜能有无限复制的潜能T 能支持癌中新血管生长能支持癌中新血管生长T 发生组织侵染和转移发生组织侵染和转移致癌因子致癌因子T物理物理T化学化学T生物生物致癌基因致癌基因 在在19111911年年RousRo

14、us发现能使鸟类结缔组织长出肿瘤的病毒，发现能使鸟类结缔组织长出肿瘤的病毒，按发现者的名字命名，为按发现者的名字命名，为劳氏肉瘤病毒劳氏肉瘤病毒（RSVRSV，发现者，发现者，1879187919701970，19661966年获诺贝尔奖）年获诺贝尔奖） 在致癌病毒中找到与致癌直接相关的基因，称在致癌病毒中找到与致癌直接相关的基因，称癌基因癌基因，RSVRSV中的癌基因定名为中的癌基因定名为srcsrc基因。基因。 srcsrc表达产物是表达产物是酪氨酸激酶酪氨酸激酶，可使细胞中蛋白质的酪氨，可使细胞中蛋白质的酪氨酸磷酸化，使蛋白质构型和功能改变，从而造成正常酸磷酸化，使蛋白质构型和功能改变，

15、从而造成正常细胞癌变细胞癌变 进一步研究发现，未感染的寄主细胞中，用分子杂交进一步研究发现，未感染的寄主细胞中，用分子杂交技术也能找到与病毒癌基因相近的核苷酸序列，称为技术也能找到与病毒癌基因相近的核苷酸序列，称为细胞癌基因（细胞癌基因（c-srcc-src），或原癌基因，或原癌基因 来自病毒的称来自病毒的称病毒癌基因病毒癌基因(v-src)(v-src)原癌基因如何变成癌基因原癌基因如何变成癌基因 转座或易位转座或易位 基因扩增基因扩增 点突变点突变造成造成过度表达过度表达，或，或表达产物蛋白质表达产物蛋白质活性失控活性失控，导致细胞发生转化，向，导致细胞发生转化，向癌变方向发展癌变方向发展

16、肿瘤抑制基因肿瘤抑制基因Y P53P53抑癌基因抑癌基因Y P53P53表达产物是与专一性表达产物是与专一性DNADNA结合的结合的核蛋白核蛋白P53P53Y 可通过将细胞阻断于可通过将细胞阻断于G1G1期而抑制细胞生长期而抑制细胞生长Y 在某些细胞类型中诱发细胞凋亡在某些细胞类型中诱发细胞凋亡Y P53P53基因是人类肿瘤相关基因中突变频率最高的基因基因是人类肿瘤相关基因中突变频率最高的基因10.3 10.3 人类基因组计划（人类基因组计划（HGPHGP） 19861986年，美国年，美国DulbeccoDulbecco在在ScienceScience上发表的一篇题为上发表的一篇题为“癌症研

17、究的转折点：人类基因组测序癌症研究的转折点：人类基因组测序”的短文的短文 认为：要弄清癌症的发生、演进、侵袭和转移的机制，必认为：要弄清癌症的发生、演进、侵袭和转移的机制，必须对人的基因组进行全序列测定；并认为这样大的项目必须对人的基因组进行全序列测定；并认为这样大的项目必须通过国际协作共同完成须通过国际协作共同完成 他的建议很快得到科学界的赞同和美国有关部门支持他的建议很快得到科学界的赞同和美国有关部门支持 19901990年正式启动，预计年正式启动，预计1515年时间，投资年时间，投资3030亿美元。亿美元。 美、英、法、德、日、中六国，我国是唯一的发展中美、英、法、德、日、中六国，我国是

18、唯一的发展中国家，完成国家，完成1%1%的测序工作（的测序工作（3 3号染色体号染色体3 3千万个碱基对）千万个碱基对） 20002000年年6 6月公布草图，月公布草图，20032003年完成。年完成。 19981998年年5 5月月1111日，世界上最大的测序仪生产商美国日，世界上最大的测序仪生产商美国PE PE BiosystemsBiosystems公司，以其刚研制成功的公司，以其刚研制成功的300300台最新毛细管自台最新毛细管自动测序仪（动测序仪（ABI 3700ABI 3700）和）和3 3亿美元资金，成立了亿美元资金，成立了Celera Celera GenomicsGenom

19、ics公司，宣称要在公司，宣称要在3 3年内，以所谓的年内，以所谓的“人类全基因人类全基因组霰弹法测序策略组霰弹法测序策略”完成人类基因组测序，并声称要专完成人类基因组测序，并声称要专利利200200400400个重要基因，并将所有序列信息保密个重要基因，并将所有序列信息保密3 3个月。个月。 CeleraCelera公司已有雇员公司已有雇员300300多人，购买了号称多人，购买了号称“全球第三全球第三”的超大型计算机，号称拥有了超过全球所有序列组装解的超大型计算机，号称拥有了超过全球所有序列组装解读力量总和的实力。读力量总和的实力。 就在六国共同宣布工作框架图构建完成的同一天，就在六国共同宣

20、布工作框架图构建完成的同一天，CeleraCelera公司宣称已组装出了完整的人类遗传密码。公司宣称已组装出了完整的人类遗传密码。 CeleraCelera公司此举，是对公益性的公司此举，是对公益性的HGPHGP的竞争与挑战的竞争与挑战 &基因组（基因组（genomegenome）：）： 一个生物体的全部基因序列一个生物体的全部基因序列&最简单的生物如最简单的生物如SV40SV40病毒的基因组仅含有病毒的基因组仅含有51005100碱基对碱基对（base pairbase pair bp bp）&大肠杆菌基因组的大小为大肠杆菌基因组的大小为57005700千碱基对（千碱

21、基对（kbpkbp）&人的基因组则由大约人的基因组则由大约3.03.010109 9个个bpbp组成组成 人类共有人类共有2.52.5万个基因或更少（原先估计万个基因或更少（原先估计5 51010万）万） 是原核生物平均基因数的是原核生物平均基因数的5 51515倍倍 人平均基因长度人平均基因长度27000bp27000bp，而原核生物基因约，而原核生物基因约1000bp1000bp 经典分子生物学认为一个基因只能表达一种蛋白质，而人体经典分子生物学认为一个基因只能表达一种蛋白质，而人体中存在着非常复杂繁多的蛋白质，提示一个基因可以编码多中存在着非常复杂繁多的蛋白质，提示一个基因可以编

22、码多种蛋白质，蛋白质比基因具有更为重要的意义种蛋白质，蛋白质比基因具有更为重要的意义 人类基因组的构成人类基因组的构成 假基因假基因(pseudogene):(pseudogene):具有与功能基因相似的序列，但由具有与功能基因相似的序列，但由于有许多突变以致于有许多突变以致失去了原有的功能失去了原有的功能，所以，所以假基因是没有假基因是没有功能的基因功能的基因，常用，常用表示。表示。 间隔区是指间隔区是指基因间基因间不编码的部分，间隔区常常含有转录的不编码的部分，间隔区常常含有转录的启动子启动子和其它上游调节序列。和其它上游调节序列。 内含子是指内含子是指基因内部基因内部不编码的区域，也称间

23、插序列不编码的区域，也称间插序列. . 在初始转录中存在此序列，但在加工后将被切除掉，所以在初始转录中存在此序列，但在加工后将被切除掉，所以常不作为翻译的信息。常不作为翻译的信息。 有的内含子也可以编码，如成熟酶和内切酶等。有的内含子也可以编码，如成熟酶和内切酶等。 在人类基因组中：在人类基因组中：T外显子仅占外显子仅占1.5%1.5%，T内含子和调节序列占内含子和调节序列占25%25%；T基因外基因外DNADNA间隔占间隔占74.5%74.5%，其中，其中AluAlu序列就占序列就占10%(10%(中中度重复序列度重复序列) )10.4 DNA操作技术操作技术fDNADNA操作技术是当今分子

24、生物学研究的核心技术操作技术是当今分子生物学研究的核心技术f基因工程技术是基因工程技术是DNADNA操作技术的一部分操作技术的一部分基因工程基因工程 采用类似工程技术的方法，在离体条件下将特定的基采用类似工程技术的方法，在离体条件下将特定的基因或因或DNADNA序列插入载体中，构成重组序列插入载体中，构成重组DNADNA，再把它导入，再把它导入特定的生物细胞中，使外源基因在其中复制表达，制特定的生物细胞中，使外源基因在其中复制表达，制造出大量基因和基因产物，并改变受体生物的性状。造出大量基因和基因产物，并改变受体生物的性状。过程过程1 1、目的基因的获得及制取：限制性内切酶目的基因的获得及制取

25、：限制性内切酶2 2 、基因载体的选取：质粒、噬菌体、基因载体的选取：质粒、噬菌体3 3 、DNADNA体外重组：连接酶体外重组：连接酶4 4 、DNADNA重组体导入受体细胞：重组体导入受体细胞： 大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌5 5、重组体的筛选、重组体的筛选6 6、重组基因的表达、重组基因的表达基因工程的内容基因克隆示意图基因克隆示意图目的基因 载体DNA(限制性内切酶切开)重组体宿主细胞已转化的宿主细胞繁殖阳性克隆株表达10.4.1 目的基因的获得及制取目的基因的获得及制取1 目的基因获得目的基因获得化学合成法化学合成法基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcD

26、NA文库文库聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCRPCR基因组基因组DNADNA文库文库T 利用分子克隆的方法，可以把某物种的全部利用分子克隆的方法，可以把某物种的全部DNA切割切割成大小合适的片段，并重组到合适的载体中，在合适成大小合适的片段，并重组到合适的载体中，在合适的受体细胞中扩增，于是人们就可以方便的保存该物的受体细胞中扩增，于是人们就可以方便的保存该物种的全部种的全部DNAT 称为该物种的基因组文库称为该物种的基因组文库cDNAcDNA文库文库T 如果把某组织或细胞中全部的如果把某组织或细胞中全部的mRNA变成变成DNA，再克隆，再克隆到合适的载体上，就得到到合适的载体上，就得到cDN

27、AcDNA文库。文库。T 它涵盖了该组织或细胞中表达的全部基因的它涵盖了该组织或细胞中表达的全部基因的编码序列编码序列DNADNA多聚链式反应多聚链式反应19851985年由美国年由美国MillusMillus创立创立 PCR基因的 扩增技术链式扩增反应553333555 5 333 3 55+变性变性(94)复性复性(55)5 5 33P P1 13355+P2+P P1 1P2合成（合成（7272）PCR经经6060次循环，扩增次循环，扩增倍数为倍数为10109 910101010操作步骤：操作步骤：1 1、加热变性加热变性：将待扩增的：将待扩增的DNADNA置于置于94949595的高温

28、水浴中加的高温水浴中加热热5 5分钟，使双链分钟，使双链DNADNA解链为单链解链为单链DNADNA，分开的两条单链作，分开的两条单链作为扩增的模板。为扩增的模板。2 2、退火退火：将加热变性的单链：将加热变性的单链DNADNA溶液的温度缓慢下降至溶液的温度缓慢下降至5555，在这过程中将引物的碱基与单链模板在这过程中将引物的碱基与单链模板DNADNA一端碱基互补配一端碱基互补配对对。3 3、延伸延伸：在退火的过程中，当温度下降至：在退火的过程中，当温度下降至7272时，在时，在耐热耐热性性TaqDNATaqDNA多聚酶多聚酶、适当的、适当的pHpH和一定的离子强度下，引物碱和一定的离子强度下

29、，引物碱基和模板基和模板DNADNA结合延伸成双链结合延伸成双链DNADNA。2 制取制取将所需的基因从将所需的基因从DNADNA上切割下来，所用的上切割下来，所用的“手术刀手术刀” 限制性内切酶限制性内切酶内切酶是存在于微生物体内具有特异功能的酶类，是内切酶是存在于微生物体内具有特异功能的酶类，是微生物作为区别自己与非己的微生物作为区别自己与非己的DNADNA，近而降解非己的，近而降解非己的DNADNA分子的一种防卫工具分子的一种防卫工具将之提取出来作为基因操作工具。将之提取出来作为基因操作工具。限制性内切酶特点：限制性内切酶特点： 种类多种类多 极强的特异性，在特定的碱基顺序位点上切开，极

30、强的特异性，在特定的碱基顺序位点上切开，出现两种出现两种末端：末端：粘性末端粘性末端 粘端粘端 GAATTCCTTAAGEco R平头末端平头末端 平端平端CCCGGGGGGCCCSmal 10.4.2 基因载体的选取基因载体的选取 外源基因不易进入宿主细胞，即使进入也难以进行复外源基因不易进入宿主细胞，即使进入也难以进行复制和表达，往往会被宿主细胞的内切酶系统降解掉。制和表达，往往会被宿主细胞的内切酶系统降解掉。 必须寻找合适的载体，将外源目的基因重组到载体必须寻找合适的载体，将外源目的基因重组到载体DNADNA上，组成重组体，再利用载体的生物学特性导入上，组成重组体，再利用载体的生物学特性

31、导入宿主，完成复制和表达。宿主，完成复制和表达。主要载体为：主要载体为：T 质粒、噬菌体、病毒、细菌人工染色体（质粒、噬菌体、病毒、细菌人工染色体（BAC）、酵母）、酵母人工染色体（人工染色体（YAC）T 不同载体运载外源不同载体运载外源DNA的大小不同的大小不同T 质粒载体一般在质粒载体一般在15kb以下以下T 噬菌体可容纳噬菌体可容纳25kbT BAC可达可达100500kbT YAC可以插入可以插入2502000kb的的DNA片段片段细菌、酵母菌和放线菌等生物细胞中染色体以外的双链闭细菌、酵母菌和放线菌等生物细胞中染色体以外的双链闭合环状分子。合环状分子。大小为大小为1 1200kb20

32、0kb；能独立于染色体外进行自我复制，每个；能独立于染色体外进行自我复制，每个细胞中可含细胞中可含1010200200个拷贝。个拷贝。其表型效应主要有决定抗药性，合成抗菌素，编码限制或其表型效应主要有决定抗药性，合成抗菌素，编码限制或修饰酶等修饰酶等 染色体染色体质粒质粒质粒载体理想的质粒理想的质粒 q拷贝数多拷贝数多; ; q两三个抗药性基因：两三个抗药性基因：terterr r，ampampr r作为作为 筛选标志筛选标志 q合适的限制性内切酶酶切位点合适的限制性内切酶酶切位点pBR322Eco RHind Bam HAva Pvu Sal Pst O r i EcoR IEcoR I是从

33、大肠杆菌菌株是从大肠杆菌菌株Eco R RY13Eco R RY13中取得的第一种限制酶中取得的第一种限制酶Hind Hind 是从流感嗜血杆菌中取得的第三种限制酶是从流感嗜血杆菌中取得的第三种限制酶氨苄青霉素氨苄青霉素抗性基因抗性基因四环素四环素抗性基因抗性基因复制起点复制起点10.4.3 DNA10.4.3 DNA体外重组体外重组 外源基因与载体的连接（外源基因与载体的连接（DNADNA连接酶连接酶） 连接方式：连接方式：粘性末端连接粘性末端连接 连接效率高连接效率高平端连接平端连接 连接效率低连接效率低重组之后的外源重组之后的外源DNADNA还必须回到细胞内才能复制和表达，还必须回到细胞

34、内才能复制和表达，显示出生物学活性。显示出生物学活性。基因工程常用大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌为受体菌基因工程常用大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌为受体菌（宿主）（宿主）10.4.4 10.4.4 重组重组DNADNA导入受体菌导入受体菌T 细菌质粒常用的受体细胞是大肠杆菌细菌质粒常用的受体细胞是大肠杆菌T 将外源将外源DNA导入细菌的过程称为转化导入细菌的过程称为转化T 细菌只有在一定状态下，才可接受外源细菌只有在一定状态下，才可接受外源DNA进入细胞，进入细胞，这种状态称为感受态这种状态称为感受态T 受体细胞，如用氯化钙或用蒸馏水处理后，再加电击，受体细胞，如用氯化钙或用蒸馏水处理后，再加电击，细

35、菌细胞膜会出现暂时性孔洞，成为能允许带有外源细菌细胞膜会出现暂时性孔洞，成为能允许带有外源DNA的载体进入的感受态细胞的载体进入的感受态细胞T 重组质粒进入受体细胞的概率仅为重组质粒进入受体细胞的概率仅为1 重组质粒转化进入受体细胞后，还需要进行筛选重组质粒转化进入受体细胞后，还需要进行筛选鉴定，以挑出含有正确插入外源基因的重组体克鉴定，以挑出含有正确插入外源基因的重组体克隆，摒弃空的载体克隆隆，摒弃空的载体克隆10.4.5 重组体的筛选重组体的筛选培养基中加抗生素培养基中加抗生素培养培养抗药性标志选择抗药性标志选择蓝白斑筛选蓝白斑筛选T 由于许多载体的基因组中含有由于许多载体的基因组中含有-

36、半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ，这，这种载体感染大肠杆菌后，会在大肠杆菌内合成种载体感染大肠杆菌后，会在大肠杆菌内合成-半乳糖苷半乳糖苷酶酶IPTGIPTG（诱导物）（诱导物）（异丙基硫代（异丙基硫代- - -D-D-半乳糖苷）半乳糖苷）X-galX-gal（显色剂）（显色剂）（5-5-溴溴-4-4氯氯-3-3-吲哚吲哚- - -D -D -半乳半乳糖苷）糖苷） 深蓝色的物质深蓝色的物质5-5-溴溴-4-4-靛蓝。靛蓝。形成蓝色菌落形成蓝色菌落如果外源基因插入载体的位如果外源基因插入载体的位置阻断了置阻断了-半乳糖苷酶基半乳糖苷酶基因因lacZlacZ的编码序列，则见到的编码序列，则见到

37、无色菌落无色菌落10.4.6 10.4.6 克隆基因的表达克隆基因的表达T表达载体有转录、翻译的元件表达载体有转录、翻译的元件T密码子通用密码子通用表达载体必须具备的条件：表达载体必须具备的条件： 独立地进行复制独立地进行复制 具有灵活的克隆位点和具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记方便的筛选标记 具有很强的启动子具有很强的启动子 具有阻遏子具有阻遏子 具有很强的终止子具有很强的终止子 所产生的所产生的mRNAmRNA必须具有必须具有翻译的起始信号翻译的起始信号大肠杆菌表达体系的不足大肠杆菌表达体系的不足1.1. 缺乏转录后加工机制缺乏转录后加工机制2.2. 缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化

38、缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化3.3. 融合蛋白形成包涵体融合蛋白形成包涵体(不溶的、无活性的不溶的、无活性的)，复，复性后才有活性性后才有活性4.4. 很难表达大量的可溶性蛋白很难表达大量的可溶性蛋白包含体形成的原因包含体形成的原因高水平表达时，新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白正确折高水平表达时，新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白正确折叠的速率就会导致包含体的形成叠的速率就会导致包含体的形成大肠杆菌中缺乏蛋白折叠过程中的酶和辅助因子，如折叠大肠杆菌中缺乏蛋白折叠过程中的酶和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等酶和分子伴侣等包含体形成对于重组蛋白的优势：包含体形成对于重组蛋白的优势：包含体具有包含体

39、具有高密度高密度，易于分离纯化易于分离纯化抵御抵御大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解降解对于生产那些对于生产那些天然构像对宿主细胞有毒害作用天然构像对宿主细胞有毒害作用的蛋白时，的蛋白时，是最佳选择是最佳选择10.4.7 转基因动物转基因动物&将外源基因导入到动物体内将外源基因导入到动物体内&当这种外源基因与动物本身的基因整合后，外源基因当这种外源基因与动物本身的基因整合后，外源基因就能随细胞的分裂而增殖就能随细胞的分裂而增殖&在动物体内表达出动物原来没有的性状在动物体内表达出动物原来没有的性状&并能传给后代并能传给后代&这

40、种动物称为转基因动物这种动物称为转基因动物+19811981年，美国的年，美国的BrinsterBrinster和和PalmiterPalmiter用小鼠进行了转基因用小鼠进行了转基因实验实验+特大鼠生长激素基因特大鼠生长激素基因与与小鼠的金属硫蛋白的基因小鼠的金属硫蛋白的基因(MT)(MT)连在连在一起，构成一起，构成MTrGHMTrGH基因基因+然后用显微注射法注射到小鼠受精卵中然后用显微注射法注射到小鼠受精卵中+再移植入假孕鼠的子宫中，发育生长再移植入假孕鼠的子宫中，发育生长+共产出共产出2121只小鼠只小鼠+其中其中7 7只带外源基因，而只带外源基因，而6 6只体型较原小鼠大一倍左右只

41、体型较原小鼠大一倍左右+即著名的即著名的转基因超级小鼠转基因超级小鼠超级小鼠超级小鼠转基因动物实验研究方向转基因动物实验研究方向 1 1、培育抗逆、优质的动物新品种、培育抗逆、优质的动物新品种 如：抗冻鱼、高瘦肉率猪、高产奶牛等如：抗冻鱼、高瘦肉率猪、高产奶牛等 2 2、培育生产药用蛋白或医、培育生产药用蛋白或医学研究模型的转基因动物学研究模型的转基因动物 就基因药物而言，最理想就基因药物而言，最理想的的基因表达场所是乳腺，的的基因表达场所是乳腺，从乳汁中提取的目的基因从乳汁中提取的目的基因产物不但产量高且生物活产物不但产量高且生物活性稳定性稳定携带人血清白蛋白基因的转基因试管牛携带人血清白蛋白基因的转基因试管牛“滔滔滔滔”人人凝凝血血因因子子基基因因转转基基因因山山羊羊促促红红细细胞胞生生成成素素基基因因人人血血清清白白蛋蛋白白基基因因S SO OD D基基因因转转基基因因山山羊羊转转基基因因山山羊羊转转基基因因牛牛什么是什么是“三亲婴儿三亲婴儿”？ 人类的基因有人类的基因有99.8%99.8%由父母双方共同提供，但有一小部分由父母双方共同提供，但有一小部分线粒体基因完全来自母方。线粒体基因完全来自母方。 线粒体只经过母婴遗传，如果母方的这部分基因中若存在线粒体只经过母婴遗传，如果母方的这部分基