常用分子实验步骤及原理

1、个人基因组DNA的分离和保存实验步骤1、轻微漱口，洗去口中的食物残渣。喝3ml蒸馏水并含在口中，让水填充于两颊之间，同时用牙齿轻刮脸颊内壁，30秒后将水收集到15ml的离心管中。2、往收集液中添加2ml的 lysis buffer，旋紧盖子，并轻轻地反转离心管5次，混匀反应试剂。3、往离心管中溶液加入500ul的蛋白酶和盐溶液，旋紧盖子，上下反转5次混匀反应物。将离心管放入50的水浴锅中恒温反应10分钟。4、将离心管倾斜45°，缓慢往管中加入10ml的冷的95%的乙醇（如果管内液体过多，可以在加入乙醇前分装或弃去部分液体），盖上盖子，将离心管正放静置于试管架中。5、轻轻地多次反转离心

2、管使乙醇与与水溶液混合。6、用移液管小心将白色絮状物转移到小瓶子内，并尽量将小瓶子内的溶液吸出，最后加入75%的乙醇，并盖上小瓶子的盖子，串上绳子，制成DNA项链。个人DNA的多态性分析：PV92实验步骤及现象：实验步骤实验现象及原理、DNA模板的制备1. 轻微漱口，洗去口中的食物残渣。喝约8ml的蒸馏水并含在口中，让水填充于两颊之间，同时用牙齿轻刮脸颊内壁，30秒后将水收集到15ml的离心管中。2. 取1ml细胞悬液于1.5ml的离心管中，在12000转的情况下离心2分钟，离心时离心管的连接处一致向着外侧。离心后观察离心管底部沉淀物的大小，若小于火柴头大小则弃去上清液，重新加入1ml细胞悬液

3、，再次离心。重复此步骤至沉淀物有火柴头大小。3. 离心后吸出并弃去上清液，最后留下约50ul的上清液于离心管内。利用涡旋机重悬细胞至无块状细胞沉积。 4. 准备一个带有旋盖的1.5ml的离心管，并在其中加入200ul InstaGene matrix，将步骤c中获得的细胞悬液转移到带旋盖的离心管中，拧紧盖子。5. 将带有细胞悬液的旋盖离心管放入56水浴锅中加热，5分钟后取出并再一次轻摇离心管，使沉淀重悬，再次放入水浴锅中加热5分钟。6. 把离心管取出，再次轻轻涡旋，然后将离心管放入95的水浴锅中加热5分钟，取出后再一次进行轻柔的涡旋。7. 将离心管放入离心机在在12000转的情况下离心5分钟。

4、DNA的模板溶解于上清液中。将离心管至于冰盒中保存。各步骤中的现象及原理为：2. 中保证离心后的细胞沉积有火柴头大小是为了保证后续试验中有足够的DNA量；离心管连接端向外，可以易于观察细胞沉积，细胞沉积位于连接端下方。3涡旋后形成细胞悬液，有利于InstaGene matrix与细胞混合反应。4. 使用旋盖离心管可以防止在水浴的过程中由于管内气压的增大而顶开盖子。5. 在水浴后可以观察到颗粒较为均匀的颗粒物，在加热过程中取出并重悬，这是为了使InstaGene matrix与细胞更好地混合反应。6. 水浴反应完毕后离心管底部仍可观察到白色沉淀物；轻轻涡旋后与95水浴5分钟是为了灭活蛋白酶使之变

5、性析出，同时温度升高可以提高DNA的溶解度。7. 离心后离心管底部有两层沉淀物，一层为白色，位于最底部，一层为半透膜，覆盖于白色沉淀上方，最上方的DNA溶液为无色透明液体、PCR1. 取出一个PCR管，吸取10ul的DNA的模板溶液到管中，再用移液管吸取10ul的master mix并转移到PCR管中，用移液管吹打混合23次，盖紧盖子。2. 将PCR管放入PCR仪中，调设好PCR的程序如下：初始变性： 94下运行2分钟；40个循环扩增：94下变性1分钟，60下退火1分钟，72下延伸2分钟；最后一次延长为：72下进行10分钟；最后降温至15摄氏度下保存。1. master mix为黄色透明液体。

6、用移液管吹打有利于DNA与master mix的混匀。2. PCR的原理见实验原理。在此步反应前应该要注意盖紧PCR反应管。以防止在PCR过程中内容物的蒸发。PCR完成后管内观察不到明显的现象变化。、琼脂糖凝胶电泳1. 称取0.5g琼脂糖加入锥形瓶中，往锥形瓶中加入50mlTAE，摇晃混匀，用保鲜膜封住锥形瓶口，并在封口处开几个小洞。2. 将锥形瓶放入微波炉中加热，加热每隔一段时间可以取出锥形瓶轻轻晃动，防止其在加热时爆沸，加热至溶液沸腾并完全澄清透明后即可停止加热。3. 将琼脂胶于室温中降温至60左右即可进行倒胶。在倒胶前要清洗并擦干、固定模具放置好样品槽梳齿。倒胶时要注意胶面要没过样品槽梳

7、齿最下端约2mm，并尽量使胶面水平。4. 将琼脂胶于室温下冷却凝固，凝固后可以轻轻取出样品槽梳齿。5. 将胶置于电泳槽中，加样的一端靠近负极，加入TAE缓冲液使之没过加样孔。6. 分别吸取9滴每滴5ul的加样缓冲液排列于塑料膜上，每一滴加样缓冲液分别与5ul的DNA marker、+/+、+/-、-/-、蒸馏水以及四名实验者的PCR产物DNA混合。7. 将每一滴混合液分别吸取10ul滴加到加样孔中。设置电压为250伏，电泳至示踪染料迁移至长度约为的2/3位置即停止电泳。8. 小心将胶取出至透射仪中进行观察，并记录实验结果。1. 琼脂糖为白色粉末状，加入TAE后在室温下不能完全融化，因此需要加热

8、，同时在加热前先摇晃混合，有利于琼脂糖的加热溶解。2. 琼脂糖完全溶解后为无色透明状液体。3. 胶面水平有利于整个电泳胶为均匀状态，在制胶的过程中如果有气泡产生要及时用小枪头移液枪吸去。在室温冷却的过程中不要破坏胶体。4. 凝固后胶片呈微微的白色。5. DNA在碱性环境下带负电荷，因此在外加电场的作用下向正级迁移，因此加样孔应位于靠近负极的一端。6. DNA marker和其余几组阳性对照组可以指示特定大小DNA片段的泳动距离。加样缓冲液中含有甘油，可以使样品沉于加样孔的底部，其中含有荧光染料，可以指示DNA迁移位置，同时还有可视的示踪染料，用以显示电泳的进行情况。斑马鱼和小鼠胚胎干细胞（mE

9、S）RNA的分离、检测和定量实验步骤及实验现象：实验步骤实验现象及原理RNA的提取1. 将细胞培养皿中的培养基轻轻倒掉。往培养皿中加入TRIZOL试剂，并用移液枪枪头吸取试剂轻轻吹洗培养皿，当吹打至培养皿底部无颗粒物时，吸取1ml吹洗液转移到1.5ml的离心管中。2. 在室温下孵育5分钟。3. 往离心管中加入0.2毫升的氯仿，然后剧烈震荡，并在室温下静置10分钟（或直至分层）。此时可以见到溶液分为三层，其中最上层为RNA溶液、第二层为DNA，第三层为碳水化合物、蛋白质等。4. 4离心机12000g下离心15分钟。5. 将离心管倾斜45°，吸取0.4ml上清液并转移到无RNA酶的干净离

10、心管中。6. 加入0.4ml的异丙酮，摇匀，并在室温中孵育10分钟。7. 4离心机12000g下离心15分钟。8. 倒掉上清液，沉淀为RNA。9. 加入1ml75%的乙醇，剧烈涡旋。10. 4离心机8000g下离心5分钟。11. 倒掉上清液，4离心机12000g下离心5分钟，用移液枪尽量把上清液吸干。12. 在空气中干燥沉淀物（不要在真空或离心下干燥，因为过分干燥会导致RNA难以溶解）。13. 加入15ul的DEPC水将沉淀重新溶解，用移液枪多次吹打来促进溶解，在60水中加热5分钟。14. 暂时存放于冰盒中。15. 使用酶标仪测量RNA提取液中RNA的含量和质量。 1. TRIZOL试剂含有苯

11、酚、异硫氰酸胍。苯酚能够裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放，可以有效变性蛋白质，但是不能完全抑制RNA酶活性。异硫氰酸胍能抑制内源和外源RNA酶，保持RNA的完整性。3. 氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂

12、溶性色素等），起到一定除杂作用。而DNA在水饱和酚的酸性条件下会被留在有机相。6. 异丙酮和乙醇一样可以沉淀核酸，但是需要量比乙醇少，在离心管比较小的情况下使用异丙酮。9. 一般使用75%的乙醇进行洗涤。13. DEPC水中含有焦炭酸二乙酯，它是一种高活性烷基化试剂，能够与RNA酶的活性基因组氨酸的咪唑环反应而抑制酶的活性，常常被用作核酸酶抑制剂。因此可以用以来溶解RNA并防止其被降解。水浴可以促进RNA的溶解。RNA琼脂凝胶电泳1. 将电泳槽和样品槽梳齿清洗干净，并用75%的乙醇擦拭晾干。2. 吸取根据提取液中RNA含量，吸取1ug的RNA用以电泳。3. 电泳步骤参照DNA琼脂凝胶电泳。1.

13、 乙醇可以灭菌并除去外界的RNA酶。2. 在实验中使用新鲜配制的电解液。尽量防止RNA酶的污染。RT-PCR1. 按照以下加样比例制作10ug的反应（表格1）试剂用量dNTP混合物，10mM1ulOligo（dT）15 primer（2.5uM）1ul总RNA1ug去离子水反应体系共10ul2. 在65水中加热5分钟，放入冰盒中。3. 轻摇反应体系，按照以下比例加入试剂（表格2）试剂用量反应混合物10ul5x反应模板缓冲液4ulRNA酶抑制剂（40u/ul）0.5ul逆转录酶0.5ul去离子水5ul总量20ul4. 将反应体系置于42水中反应30分钟，95水中反应5分钟，暂时存放于冰盒中。5.

14、 按比例准备PCR的反应体系（表格3）：试剂用量10xPCR缓冲液2uldNTP混合物，10mM0.8ulSOX2基因引物（10uM）0.5ul或内参基因引物0.5ulTakara Ex Tap HS（5u/ul）0.2ul逆转录反应体系1ul去离子水15ul6. PCR反应：1个循环：95反应5分钟，35个循环：94反应30秒，58反应30秒，72反应30秒，最后一个循环：72反应5分钟。7. 电泳检测PCR结果。1. 逆转录有三种引物，分别是随机引物、Oligo dT 和基因特异性引物。随机引物适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反

15、转录反应。特别是长链的靠近mRNA5端的逆转录，主要用于单一模板的RT-PCR反应。Oligo dT 适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。基因特异性引物是与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。5.在PCR反应对照组中加入内参基因引物，可以根据内参基因的PCR结果来判断RT-PCR的成功与否。TA克隆1. 切胶。在紫外光照下切割出含有目的DNA的胶用干净的刀分割

16、开来，把残留的缓冲剂擦干，将胶转移到塑料膜上，将胶切碎。称量好胶的重量。转移分装到1.5ml的离心管里。2. 根据胶的重量加入三倍胶的体积的DE-A缓冲液。3. 涡旋混匀反应液，将离心管放入75的水浴锅中水浴直至胶完全溶解。4. 加入0.5倍体积DE-A缓冲液的DE-B缓冲液，加入100ul的异丙酮。5. 将反应液转移到离心柱中，将离心柱放入2ml的离心管中，盖紧。在12000g下离心1分钟。6. 弃去滤液，往离心柱中加入W1缓冲液，12000g高速离心30秒。7. 弃去滤液，再次加入700ulW2缓冲液，12000g高速离心30秒。8. 弃去滤液，继续加入700ulW2缓冲液，12000g高

17、速离心1分钟。9. 弃去滤液，将离心柱重新放入离心管中，12000g高速离心1分钟。10. 将离心柱放入一支新的1.5ml的离心管，加入预热65的15ul的去离子水，在室温下静置1分钟，12000g高速离心1分钟。2. DE-A缓冲液中含有-巯基乙醇，它是一种还原剂，可以用于在DNA提取过程中防止细胞内物质发生褐变对实验结果产生影响。其主要作用是：凝胶熔化剂，含DNA保护剂，防止DNA在高温下降解。其红色的颜色可以便于观察胶是否完全溶解。4. DE-B缓冲液和异丙酮都可以促进DNA的析出。6. W1缓冲液是洗涤的作用，可以吸取洗去残留的异丙酮等等。7. W2缓冲液去盐液，同时灭活酶，防止其影响

18、后续试验。使用时要加入95%100%的乙醇，最终可以通过离心和乙醇挥发的作用除去。TA连接1. 使用酶标仪检测胶回收DNA产物的质量。2. 连接反应体系的反应物如下列表（表格4）：试剂用量2x快速连接缓冲液5ulpMED-T easy载体1ulT4DNA连接酶(3 Weiss unit/ul) 1ulPCR产物1ugElution water总反应体系为10ul转基因猪的GFP蛋白质的提取 & Western Blotting 蛋白质的提取1. 将20ulPMSF加入2ml的RIPA buffer，剧烈涡旋。2. 用液氮研磨肌肉组织。3. 将磨好的粉末转移到两个空的1.5ml的离心管中

19、，加入0.3ml的PIPA buffer。4. 剧烈涡旋约15sec，涡旋后在冰上放置1min，重复操作23次。5. 将离心管于冰上孵育10min。6. 于4下，12000g离心5min。7. 将离心管转移到冰上，此时可以观察到分层的出现，将上清液转移到新的离心管中，弃去沉淀。8. 使用酶标仪检测蛋白质提取液中蛋白质的含量和纯度。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 按要求洗干净，擦干，准备好垂直电泳槽。2. 按照以下比例（10ml体系）制备20ml12%的分离胶。每个电泳槽使用7ml，在室温下静置40min。试剂用量去离子水3.2mL1.5M Tris(pH8.8)2.6mL30% 凝胶液 4.

20、0ml10% SDS100uL10% AP100uLTEMED 4ul用手轻摇混匀(注意不要产生气泡），小心将混合液注入准备好的玻璃板间隙中(约2/3)，为浓缩胶留下足够的空间，轻轻在顶层加满去离子水覆盖，以阻止空气中氧对聚合的抑制作用。刚加入水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消失，不久又出现界面，这表明凝胶已聚合。再静置片刻使聚合完全。 3. 先倒去并已聚合好的分离胶上层的水，再用滤纸吸干残留的水液。按下列配方制备10毫升浓缩胶溶液： 试剂用量去离子水6.8mL30%凝胶液0.83mL0.5M Tris-HCl(pH6.8) 0.75ml10% SDS60uL10% AP50uLTEMED

21、 4ul混合后分别取3ml注入分离胶上端，插入梳子应小心避免气泡。4. 在浓缩胶聚合的同时，取150样品与50ul的4xloading buffer按比例混合，轻柔混匀，再使用RIPA和PMSF的mix按照相同比例配两个阴性对照。100加热10分钟以变性蛋白（电磁炉、锅），加热后存放于冰上。5. 浓缩胶聚合完全后，将凝胶模板放入电泳槽上固定好，槽中间和外侧均加入1X电泳缓冲液，检查有无漏液，除去两玻璃板间凝胶底部的气泡，小心拔去梳子。 6. 按次序上样：先在一个孔上加入蛋白marker，然后用微量进样器往后面的凝胶梳孔中加样品混合液，40ul/孔，每孔加一个样品，同时安排已知分子量的标准物作对照。7. 电泳：开始时浓缩胶电压为80V，染料进入分离胶后，将电压增到120V，继续电泳至染料到分离胶约2/3处，断开电源。 Western Blotting1. 戴手套切6张定性滤纸和一张PVDF膜，它们的大小应略大于剪切好的电泳琼脂胶片。在膜的边缘用铅笔作一记号（或剪角），与滤纸和海绵（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。2. 将SDS-PAGE结果的凝胶剖下，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号，使用转膜缓冲液在室温下冲洗15min。3. 使用甲醇浸泡PVDF膜1min，然后回收甲醇，将PVDF转移到转膜缓冲液中浸泡101