D二聚体及其测定方法探析

1、d二聚体及其测定方法探析【摘要】d二聚体(d dimer)是纤维蛋白特异性降解 产物，可有效地标志稳定的纤维蛋白的出现，其检测对血栓 性疾病的诊断及治疗观察具有重要应用价值1, 2。本文 综述了 d二聚体的形成及其主要的检测方法：凝集法、 elisa法、及酶联荧光分析法、免疫金标法。随着方法学的 发展及市场推广，早已由科研项目转变为常规项目。【关键词】d二聚体；检测方法；纤溶纤溶酶(pl)可降解纤维蛋白原、纤维蛋白单体、交联 性纤维蛋白。纤维蛋白原在凝血活酶作用下形成纤维蛋白单 体，纤维蛋白单体由xhia作用下通过r'r'键变成网状的多聚体，形成交联纤维蛋白。与此同时，在pl作

2、用下 产生各种大小不同片段的纤维蛋白降解产物。d二聚体则 是含r' h键的片段，是交联纤维蛋白的特异性降解产 物。所以血浆中检测d二聚体有助于血栓性疾病的早期诊 断及对溶栓药物治疗的疗程监测和疗效考核3。本文就d 二聚体的形成特性以及主要测定方法作一简单叙述。1 d二聚体的生成及特性1. 1 d二聚体的形成 纤维蛋白原在凝血酶作用下转 变为纤维蛋白，并最终形成稳定的纤维蛋白凝块。凝血酶生 成后即与纤维蛋白原的底物部位作用，首先裂解纤维蛋白原 分子中的2条aa链的氨基端精氨酸16甘氨酸17键，释 放出一对纤维蛋白肽a（fpa）,由此产生a链新的氨基末端 （甘氨酸一脯氨酸一精氨酸），生成纤

3、维蛋白单体i;然后凝 血酶再裂解纤维蛋白单体i分子中2条链的氨基端精氨 酸14甘氨酸15键，释放出一对纤维蛋白肽b（fpb）,由此 产生b链新的氨基末端（甘氨酸一组氨酸一精氨酸），生成 纤维蛋白单体ii;纤维蛋白单体i与ii生成后即开始自发性 聚合。fpa和fpb的释放分别出纤维蛋白单体中央e区的两 种“聚合部位” o 一个纤维蛋白单体中央e区的“聚合部位”可与另一个纤维蛋白单体外周d区的“互补部位”以非共价结合，这样两个纤维蛋白单体即会形成一部分重叠而又 不稳定的非共价复合物，第三个纤维蛋白单体加入后能以同 样方式与其中之一纤维蛋白单体相连，而由此形成的聚合体 中，两个相邻单体的d区将发生端

4、 端聚合作用。如此纤维 蛋白单体通过分子间e d区和d d区的相互作用形成可溶 性纤维蛋白单体复合物。在因子xhia作用下（需ca2+参与）， 相邻纤维蛋白单体的y链可通过一条y链的398或399位 上的谷胺酰胺与另一纤维蛋白单体上y链的406位赖氨酸之间形成£ （谷氨酰）赖氨酸键而快速共价交联，形成 e （ y glu） lys no纤维蛋白交联后将形成稳定的纤 维蛋白凝块。形成的r' r'连结键是原来纤维蛋白单体 所不具备的46。pl对纤维蛋白(原)形成过程中的各个 阶段均有降解作用，对纤维蛋白原，pl通过对精氨酸一赖氨 酸的降解作用，先从纤维蛋白原bb链上裂解下

5、来一个小肽 段bb1 42,在aa上裂解下来一种极附属物。极附属物由 碎片a、c和h组成，留下的片段称为x片段。后者在纤 溶酶作用下，裂解为d片段和y片段，y片段再进一步裂解 为终产物d片段和e片段。纤溶酶对可溶性纤维蛋白单体复 合物的降解作用，除形成x'、y'、d、e'、片段和aa极附 属物外，还从bb链上裂解下bb 15 42小肽，统称为纤维 蛋白降解产物(fgdps) o而交联纤维蛋白在纤溶酶作用下， 除形成x，、y d、e，片段外，还形成d d、y y二聚 体、aa极附属物及复合物1 (dd/e)、复合物2(dy/dy)、复 合物3 (yy/dxd)和yxd/d

6、xy等，统称为纤维蛋白降解产物 (fbdps) o d二聚体则是含r' r'键的片段，是交联纤 维蛋白的特异性降解产物46。1.2 d二聚体的特性d二聚体的分子量为190 000,等电点(pi)为4. 95. 3,经b 硫基乙醇还原后出现 相当于81 000个r' r'交联键。d 二聚体在280 nm 下克分子消光系数为17. 8o d二聚体在体内的半衰期&gt； 3 h,主要通过肾脏排泄。正常人血浆中的d二聚体&lt；400 ug/l,随检测方法不同略有差异。将一定浓度的d二聚体 与人幼稚单核细胞白血病细胞系(nomo 1),发现d三聚体 可刺

7、激nomo 1分泌尿激酶型纤溶酶原激活剂(u pa)和纤 溶酶原激活剂抑制物2(pai 2),引起nomo 1表面组织因 子(tf)表达活性增强。此外d二聚体还可促使nomo 1生 成超氧阴离子，促进白细胞介素la (il la )和白细胞介 素1b(il ib)的释放。d d的生成反映机体凝血和纤溶 系统的激活，在各种血栓形成性疾病以及生理性高凝状态时 均有升高。特别是对静脉血栓形成(venous thromboembolism, vte)髙度敏感，在vte的排除诊断中具有 重要价值。另外，d d在心血管疾病、dic、恶性肿瘤等疾 病时，也有明显变化，可反映疾病的严重程度、发展变化、 以及疗

8、效和顶后的有用指标4, 5。2 d二聚体检测方法d二聚体的检测方法很多，本文按照被检测物质的 性质不同h与抗原 抗体复合物相结合的物质性质不同i介 绍几种主要的测定方法，其中包括：与红细胞结合的方法、 与乳胶颗粒结合的方法、与酶结合的方法、在与荧光染料结 合的方法及与胶体金结合的方法4。2. 1自身红细胞凝集法 采用分别针对d d和红细胞 上表位的双抗体，当血中d d水平升高时，抗原 抗体结 合的增多而导致红细胞凝集，2 min内可以判断结果，为半 定量的自身红细胞凝集试验。其优点是可在全血中检测，省 去了离心制备血浆的麻烦。对vte的敏感性和npv分别为 100%和97%100%o如果仅对近

9、端dvt而言，simplired的 敏感性和npv也可达100%,特异性和ppv分别为58%和70%, 它是一种有价值的筛选高危性近端dvt的方法7。2.2乳胶凝集法1983年rylat t等将分离纯化的d 聚体作抗原，按常规方法筛选，最后获得一株dd 3b6/22 的抗d聚体的单克隆抗体。1986年elms将此单克隆抗体 共价吸附在乳胶颗粒上，用于定性或根据其稀释度半定量测 定标本中的d二聚体的含量。标本可采用肝素edta或构椽 酸钠抗凝血浆，室温下可稳定3d,4 £可保存2周ohillyard 用该法测定了 515例未经选择的健康志愿者枸椽酸钠抗凝血 浆。97. 7%均为阴性与e

10、lisa比较显著相关，认为该法快速、 特异、操作简单。不需特殊设备，特别适用于急诊测定4, 7o2.3酶联免疫吸附法(elisa) 1983年rylatt和 elms建立了双抗夹心的elisa法检测血浆中的d二聚体。 其包被抗体和酶标抗体均采用分离纯化后筛选出来的 mcab(dd3b6/22)该mcab能特异性地针对d 二聚体中的 r' r'连结键。该法灵敏度10 u g/l,正常范围&lt； 300 ug/l 4。2.4基于酶免疫法的荧光抗体检测法vidas dd在 vidas免疫分析仪上进行，它在酶免疫法基础上与荧光检测 相结合。利用现成的单剂量试剂和分析仪中储存的

11、校准系 统，对单份样本进行检测。现成试剂由包被了鼠抗d d单 抗的固相移液装置和一试剂条组成，后者包含了其他所需试 剂：结合剂(碱性磷酸酶标记的鼠抗d d单抗)、洗涤剂、 样品稀释剂和底物。将200卩1血浆吸入试剂条后，所有步 骤由分析仪完成。除需将血样常规离心15 min外，结果可 在35 min内得到。结果以纤维蛋白原等价单位表示，其检测上限为1 000 u g/l,下限为50 p g/l,低于正常参考值 下限(68 ug/l494 u g/l) o对dvt的敏感性和npv分别 为96%99%和95%99%。vidas dd是目前研究最多的一种 检测方法，敏感性很高，与经典elisa法有很

12、好的一致性， 最有希望取代经典elisa法而成为dvt诊断的首选筛选试验7 。2. 5免疫金标法gogstad用胶体金标记d二聚体的 单克隆抗体，建立了免疫过滤金标染色测定法。本法将单抗吸附在多孔薄膜并粘放在有多层吸收垫的塑料盘上，被检标 本加入后即与该抗体相结合，然后加入胶体金标记的抗体, 在薄膜上产生红色斑点。通过肉眼观察或用折射仪读数，与 提供的标准色价或者测定标准品的折射读数，可计算出标本 中d二聚体的含量。该法即具有胶乳凝集法的操作简单、 快速，适用于急诊测定的优点，又具有elisa能够准确定量 的特点，线性范围达到10 mg/l,与elisa比较具有显著的 相关性，不受胆红素,hb

13、、纤维蛋白原、可溶性的纤维蛋白 及fdp等干扰，但类风湿因子、肝素及脂血等有一定的干扰。 批内cv 8%12%,批间cv 13%20%,参考范围0. 2 mg/l 0. 47 mg/l 4, 7。3总结以上介绍了 d d的生成以及几种主要的d d检测方 法，除了经典的胶乳法和elisa法外，现已发展了 10多种 快速的d d的检测方法。这些新方法分别鉴于不同的原理, 但与经典方法相比，都具有快速、简单、灵敏等优点，更适 合于急诊患者的使用。有些新方法已经经过了大量的临床研 究评估，得到了公认，在临床已广泛使用。还有一些新方法 正在进行临床评估，方法的可靠性尚需进一步的研究证实。 迄今,d d的

14、最大临床意义是在排除诊断可疑vte中的作用。 d d对vte高度敏感，如果患者的d d低于临界值水平， 常可排除vte。d d对血栓形成性疾病如弥漫性血管内凝血 (dic)、肺栓塞(pe)、深部静脉栓塞(dvt)、急性心肌梗死 (ami)、先兆子病等有早期快速诊断价值。对严重肝病，恶 性肿瘤，镰刀红细胞疾病的观察也具重要价值。此外，d 二聚体的检测还可用于溶栓药物治疗的疗程监测和疗效考 核812。相信随着科学的不断进步，更多更好的检测d 二聚体的方法将会不断出现，从而为广大医务工作者提供更 多便利。【参考文献】1 王鸿利，王学锋.d二聚体检测的方法及其 临床应用j 中华医学杂志，2004,84

15、(2):171173.2 赵林渔，刘志伟.血浆d二聚体定量测定的临 床价值探讨j.江西医学检验,2005,23(1):88.3 侯振江.d二聚体测定的临床应用j.临床 检验杂志，1997,15(1):63 64.4 周永列.d二聚体的测定及其临床意义j 国外医学临床生物化学与检验学分册，1996,17(1):4 6.5 郭雪梅，王鸿利.快速d二聚体检测在诊断静脉血栓形成中的应用进展j.中国实验诊断学， 2000,4(1):4143.6 李家增，贺石林.血栓病学m 北京：科学出版社,1998:5152.7 董雷鸣，卫蓿文.d二聚体检测方法及其在诊断血栓栓塞疾病中的应用j.诊断学理论与实践， 2004,3(1):5254.8 庄昱洲，王学文血液恶性疾病患者d二聚体 测定及其临床意