辛国华小论文(改)

1、异槲皮苷-葡萄糖苷酶分离提纯及酶性质的研究辛国华1,鱼红闪2,金凤燮3（1.生物工程学院，11108220302322）摘要: 本文主要对微生物Absidia sp.R9g所产的异槲皮苷-葡萄糖苷酶进行分离提纯及其酶性质研究。研究表明该酶能水解异槲皮苷的-葡萄糖基，得到槲皮素。该酶蛋白的分子量约为50kDa,酶反应的最适温度为50，最适pH为5.0，在温度60以下，pH3.0-7.0范围内酶活力较稳定，酶反应动力学研究，得到最大反应速度Vmax=3.2619mmol/L·h，米氏常数Km=57.6352mmol/L。关键词: 异皮槲苷-葡萄糖苷酶；槲皮素；酶反应特性中图分类号：Q55

2、6+.2Purification and Characterization of Isoquercitrin - glucosidase（XIN Guo-hua1，YU Hong-shan2，JIN Feng-xie3）(1.School of Biological Engineering, 11108220302322)Abstract : This paper presents the separation and the study of characterization of the isoquercitrin - glucosidase from microorganisms Abs

3、idia sp.R9g. This enzyme can hydrolyze the - glucosidase of isoquercitrin to produce the quercetinThe molecular weight of the enzyme is about 50 kDaIn the enzymatic reaction, the optimum temperature was 50 , the optimum pH was 5.0. This enzyme was stable at pH 3.07.0, below 60 . The Vmax and Km

4、 for isoquercitrin - - glucosidase was 3.2619mmol/L·h and 57.6352mmol/L, respectively.Key Words：Isoquercitrin - - glucosidase；Quercetin；Enzymatic propert0 引言黄酮类化合物是一类低分子天然植物成分，在自然界中分布广泛，在许多植物和大型真菌中都能找到。近年来，随着越来越多的黄酮类物质被发现，人们逐渐开始对该类物质的应用价值进行研究。起初，人们对该类物质的认识局限在用做染料方面，渐渐的人们认识到芦丁、槲皮素等黄酮类化合物的药理性质并将其

5、应用于临床后发现部分黄酮类化合物有显著地生理及药理活性1，2，3。这些生理和药理特性使其广泛应用于食品、医药等领域。槲皮素是一种典型的黄酮类化合物，在抗癌、抗氧化、抗炎症、抗菌等方面都有显著作用4-6。槲皮素也是许多其他类黄酮苷的苷元，其中一些化合物具有更高效的生理活性，从而为相关黄酮类化合物的生产提供了原料。槲皮素在自然界中的分布虽然广泛，但是单纯的从植物提取所获得的总量远不能够满足我们现在的需求，而且人工提取所需成本也非常大。因此，人们开始研究通过人工合成的方法来获得有价值的天然产物，其中主要包括化学合成法和生物合成法两大类，其中化学合成法有生产条件苛刻、副产物多、产率低等缺点7-9。所以

6、生物合成法就成为了我们研究的重点。本文采用微生物酶法进行槲皮素的生产，主要对异槲皮苷-葡萄糖苷酶进行分离提纯以及酶性质研究。1材料与方法1.1 材 料异槲皮苷、槲皮素样品来自于由美国sigma公司，菌种Absidia sp.R9g由大连工业大学生物工程学院菌种保藏所提供，薄层层析板(TLC)为德国Merck公司生产的硅胶板。1.2 实验方法1.2.1 粗酶液的制备本实验采用的液体培养基配方为：将3.0的槐花浸出液与97.0麦芽汁浓度为5度的麦芽汁混合均匀。121 下湿热灭菌。将Absidia sp.R9g接种于液体发酵培养基中，接种量为12环。然后将其置于恒温振荡器中，在30 ，160 r/m

7、in的条件下培养菌体45 d。将培养好的发酵液冷冻离心，去除菌体，所得的上清液即为发酵液。将发酵液在冰浴条件下盐析处理。再冷冻离心，弃去上清液，收集沉淀。沉淀用0.02M pH 5.0的HAC-NaAC缓冲液溶解，透析除盐，再次离心取上清液，即为粗酶液，粗酶液于4 条件下保存备用。1.2.2 酶的分离纯化及分子量的测定 将收集到的粗酶液通过凝胶 Sephadex G-100 分子筛分离，收集有酶活的分布收集管并将其合并；利用上述收集液进行第一次DEAE-Cellulose DE52柱，收集酶活相对集中峰值的分布收集管；再次进行二次DEAE-Cellulose DE52柱分离，得到纯度很高的目的

8、蛋白。将提纯出来的蛋白样品经处理后,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离10。用肌球蛋白（200kDa）、半乳水解酶（116kDa）、磷酸酶b（97.2kDa）、牛血清蛋白（66.4kDa）、卵清蛋白（44.3kDa）标准蛋白与样品作对照。根据电泳情况，利用蛋白质分子量对数值与相对迁徙率的关系，绘制蛋白质标准曲线，通过待测目的蛋白质的相对迁移率便确定其分子量范围。1.2.3 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝法，用牛血清白蛋白作为标准蛋白11。1.2.4 酶性质的研究异槲皮苷-葡萄糖苷酶活性的检测：用0.02M pH5.0醋酸缓冲液溶解异槲皮苷，制成2.0mg/ml标准品溶液作为提纯酶反应的底物。

9、取0.05ml异槲皮苷标准品溶液，加入等体积的酶液，于50下反应12小时,然后加入0.1ml水饱和正丁醇终止酶反应，待分层后，利用上层溶液进行TLC薄层层析检测12。展开剂组成为乙酸乙酯:丁酮：甲醇:水=10 :7 :1:1。TLC图谱扫描后用Bandscan工具软件进行分析。在上述反应条件下，每小时水解消耗1mol异槲皮苷所需的酶量为一个活力单位。2 结果与讨论2.1酶的分离提纯将收集得到的粗酶液经过凝胶 Sephadex G-100分子筛层析，通过酶反应TLC薄层层析检测酶活力，收集酶活力相对较高的分布收集管，进行合并。多次重复上述步骤，将多次层析合并的酶液进行DEAE-Cellulose

10、 DE-52 阴离子交换柱层析分离，通过蛋白紫外吸收值检测仪得到蛋白质吸收曲线，根据曲线检测吸收峰值管的酶活，将酶活较高的吸收峰附近的分布收集管收集并合并，多次进行。最后将第二次收集到的酶液再次进行DEAE-Cellulose DE-52 阴离子交换柱层析分离，利用紫外吸收值测定仪检测到蛋白的梯度洗脱曲线，见图1。图1 异槲皮苷-葡萄糖苷酶洗脱曲线图Fig.1 Puirfication of isoquercitrin - - glycosidase on DEAE-Cullulose DE52 column.由图1可以看出，经过多次的层析分离，最后得到的蛋白质紫外吸收图谱蛋白种类较单一，蛋白

11、质的含量相对集中，吸收峰对应的收集分别为5、49、53、76、99。对峰值管进行TLC法检测酶活力，结果如图2所示。图2 异槲皮苷-葡萄糖苷酶酶活力检测定Fig.2 Enzyme activity detection of peak tube from DEAE-cellulose column经比较发现，49、53管的酶活相对较高，所以目的蛋白主要集中在这2管所在的吸收峰中。2.2 酶的纯度检测采用三次柱层析的方法分离异槲皮苷-葡萄糖苷酶，得到较纯的酶液，考察各个步骤的纯化效果，结果如表1所示。表1 异槲皮苷-葡萄糖苷酶纯化结果Table 1 Results of isoquercitrin

12、 - - glycosidase purification酶液 结果总酶活(U)总蛋白(mg)比活(U/mg)提纯倍数粗酶液481533114.61.0Sephadex G-100103750.120.71.4DEAE-cellulose7097.5793.76.4DEAE-cellulose2862.74104.77.2如表1所示，异槲皮苷-葡萄糖苷酶在提纯过程中酶比活力比发酵粗酶液提高了4.7倍左右。为了进一步检测分离得到的纯蛋白纯度，对经过三次分离纯化得到的酶蛋白进行 HPLC 检测，检测结果如图 3 所示。图3 高效液相色谱法测定异槲皮苷-葡萄糖苷酶的纯度 Fig.3 HPLC ana

13、lysis on the purity of isoquercitrin - - glycosidase如图 3 所显示，分离得到的酶蛋白在出峰时间 5.603min 处呈现单一峰，这说明分离得到的异槲皮苷-葡萄糖苷酶纯度较高，可用于进行下一步的酶性质等的研究。2.3 酶的分子量测定利用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）对异槲皮苷-葡萄糖苷酶的分子量进行检测，检测结果如图 4 所示。图 4 SDS-PAGE检测异槲皮苷-葡萄糖苷酶Fig.4 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis of purified isoquerci

14、trin - - glycosidase由图4可知，酶液经多次层析柱分离，分离效果明显，经第二次DEAE-Cellulose DE-52 阴离子交换柱层析分离得到的酶液电泳条带为明显的单带，可认定该蛋白为纯酶。以SDS-PAGE图谱的标准蛋白质为依据,利用其相对迁移率和分子量的对数关系绘出蛋白质标准曲线,见图5。图5 SDS-凝胶电泳中异槲皮苷-葡萄糖苷酶的分子量Fig.5 Molecular mass of isoquercitrin - - glycosidase on polyacrylamide gel SDS electrophoresis如图5 所示，根据异槲皮苷-葡萄糖苷酶的相对

15、迁移率，计算得出该酶分子量约为 50 kDa。2.4 酶性质的研究2.4.1 酶反应的最适温度异槲皮苷-葡萄糖苷酶的酶反应最适温度见图6。图6 温度对异槲皮苷-葡萄糖苷酶反应的影响Fig.6 Temperature effect on isoquercitrin - - glycosidase reaction由图 6 可看出，随着酶反应体系的温度的逐渐的升高，其酶活力逐渐上升，50时，酶活力最高，当温度超过了50时，酶活力明显下降。因此，确定异槲皮苷-葡萄糖苷酶酶反应的最适温度为50。异槲皮苷-葡萄糖苷酶的温度稳定性见图7。图7 异槲皮苷-葡萄糖苷酶的温度稳定性曲线Fig. 7 Temper

16、ature effect on isoquercitrin - - glycosidase stability由图 7 可看出，50以上，随着热处理温度的升高，酶活力逐渐降低，在温度为60以下时，酶活力较为稳定，剩余酶活力为 90%以上。而当热处理温度升至65以上时，酶活力几乎丧失，因此，异槲皮苷-葡萄糖苷酶在60以下时较为稳定。2.4.2 酶反应的最适pH异槲皮苷-葡萄糖苷酶的酶反应最适pH见图8。图8 pH对异槲皮苷-葡萄糖苷酶反应的影响Fig.8 pH effect on isoquercitrin - - glycosidase reaction由图 8 可看出，酶反应的最适pH 为5

17、.0。异槲皮苷-葡萄糖苷酶的pH稳定性见图9。图9 异槲皮苷-葡萄糖苷酶的pH稳定性曲线Fig.9 pH effect on isoquercitrin - - glycosidase stability如图 9 可以看出，异槲皮苷-葡萄糖苷酶在pH 2.0-7.0的范围内，有酶活力，在pH 2.2时酶活力剩余55%左右，在pH 3.0到pH7.0之间，酶活力损失较小，在pH 8.0-10.0的范围内，酶活力基本丧失。因此，异槲皮苷-葡萄糖苷酶的pH稳定范围是pH 3.0-7.0。2.4.3 异槲皮苷-葡萄糖苷酶催化反应动力学方程配制不同浓度的底物进行酶反应, 得到酶反应速度与底物浓度的关系。

18、根据酶反应动力学方程, 以1/V作纵坐标, 1/S作横坐标绘制Lineweaven. Burk曲线, 如图10。图10 异槲皮苷-葡萄糖苷酶的Lineweaven. Burk图Fig.10 Lineweaven. Burk of isoquercitrin - glycosidase由图10可知，根据测定结果得到米氏方程：1/V= 0.30657 + 17.66921 /S，最大反应速度Vmax=3.2619mmol/L·h，米氏常数Km=57.6352mmol/L。3 结 论本实验用分子筛及两次阴离子交换柱分离纯化得到异槲皮苷-葡萄糖苷酶, 经SDS-PAGE检测得到电泳单带,该酶

19、的分子量约为50kDa。对纯酶进行酶性质研究，结果表明酶反应的最适温度为50，最适 pH 为5.0，酶活力在60以下，pH为 3.0-7.0 范围内相对稳定。最大反应速度 Vmax = 3.2619 mmol/L·h，米氏常数Km=57.6352mmol/L。参考文献：1 Khaled M, Mohamed. Phenylpropanoid glucosides from Chrozophora oblique J . Phytochemistry, 2001, 58: 615-6182 Sergio Riva. Biocatalytic modification of natura

20、l products J . Current Opinion in Chemical Biology, 2001 (5): 106-1113 朱海扬,曾慧兰.黄酮类化合物药理作用的研究进展J山东医药2009.49(17):114-1154 孙涓槲皮素的研究进展.安徽中医学院出版社，2011（03）:85-87.5 王天仕，郑舍勋，魏高明，等. 槐花对家兔体外心房肌的作用. 山东中医药杂志，2002，21（5）：297-299.6 Li, YH, Di, ZC, Luan, ZK, et al. Comment on "Removal of heavy metals from aqueous solution by carbon nanotubes: adsorption equilibrium and kinetics" J. Journal of Environmental Sciences, 2005, 17(1):175-176.7 Pan Jing, Yuan Chengshan, Lin Chang