含氮大环内酯类抗生素生物合成及其研究进展

1、含氮大环内酯类抗生素及其生物合成研究进展雷帕霉素、他克莫司等一类含氮大环内酯类微生物代谢产物是目前临床重要的药物， 它们具有特殊的结构基团， 即内酯环上含有1 分子非蛋白质组成氨基酸哌可酸，通过哌可酰基与细胞内一类具有脯氨酰顺反异构酶活性的免疫亲合蛋白 ( immunophilin )fkbps (fk506 bingding proteins)相互作用形成复合物，作用于细胞不同靶位，发挥多种不同的生物学功能1 。这类化合物具有广泛的生物学活性，除抗真菌活性外，临床已用作器官移植抗排斥药物、血管扩张支架涂层药物2 、靶向抗肿瘤药物3-4 、炎症治疗药物 5 ， 同时， 这类化合物还具有潜在的治

2、疗中风 6 、 神经退行性疾病7 、 帕金森综合症8 、老年痴呆9等作用，harrison等人2009年7月在nature杂志上报道雷帕霉素可以延长哺乳类动物老龄小鼠寿命的研究成果10 ， 立即引起各国科学家的广泛关注和高度兴趣11,美国science杂志把此项研究成果评选为当年十大科学进展之一，预计 10年左右可望应用于人体。含有哌可酰基的含氮大环内酯类微生物代谢产物具有相似的生物合成途径， 它们都属大环内酯类化合物， 由典型的具有模块结构的 i 型聚酮合酶( polyketide synthase, pks)催化合成内酯环碳链骨架，由单模块的非核糖体肽合成酶( non-ribosomal

3、peptidesynthetase, nrps) 催化把哌可酸整合到内酯环骨架， 并通过环化酶活性域使含哌可酰基的聚酮链内酯化从pks/nrps杂合酶上脱离，最后通过一些列氧化酶、甲基转移酶等进行侧链基团的修饰形成最后的活性产物，由于这类化合物具有相似的结构和合成机制，特别是它们的作用机制独特带来广泛的生物学活性和临床应用前景， 已经成为目前国内外关注和研究的热点。一、微生物产生的含氮大环内酯类化合物1、rapamycin (雷帕霉素,西罗莫司/sirolimus)1975,力口拿大ayerst试马室vezina在筛选抗真菌抗生素中，从太平洋复活岛土壤样品中分离到一株具有抗白色念珠菌 ( ca

4、ndida albicans) 等酵母样真菌和石膏样小孢子菌(microsporum gypseum)等丝状真菌活性的吸水链霉菌 ( streptomyces hygroscopicusnrrl5491） 12,并从其发酵液中分离得到一个新的含氮三烯 36元环大环内酯类抗真菌 化合物（图1）,即雷帕霉素。1988年delin和hargrav我fk506独特大环内酯结构的启发, 根据fk506和雷帕霉素化学结构的相似性和均具有免疫抑制作用的特点，提出详细比较 两种化合物的生物学功能，重新对雷帕霉素的免疫抑制活性进行研究。历经25年，1999年9月fda批准美国家用产品公司（ahp）的雷帕霉素及其

5、口服液作为器官移植抗排斥 药物投放市场13o200孙goodfellow等人采用形态学结合遗传学分析方法对雷帕霉素产生菌重新进行 分类学研究，正式把产生菌 streptomyces hygroscopicunrrl5491 定名为 streptomyces rapamycinicus 新种 14。2、tacrolimus （他克莫司，fk506）1983年美国fda批准真菌产生的h一环肽抗生素环抱素（cyclosporin a）作为免 疫抑制剂用于器官移植抗排斥反应，成功应用于抑制骨髓移植受体的抗排斥和自身免疫 性疾病的治疗，为器官移植治疗带来革命性的突破，免疫抑制剂的研究进入一个新的发 展时

6、代。日本藤泽公司（fujisawa）建立混合淋巴细胞、t淋巴细胞生长、白细胞介素 ii合成等模型，开展从微生物代谢产物中筛选具有免疫抑制活性的新型化合物，1987年从大阪筑波土壤中分离得到一株筑波链霉菌（streptomyces tsukubaensino. 9993） 15, 其代谢产物能够抑制il-2的合成16,经过发酵、分离、纯化获得另一个含哌可酰基23元环大环内酯类化合物 tacrolimus （他克莫司，fk506）（图2）。图1 雷帕霉素结构式图2fk506结构式生物学活性研究发现fk506具有很强的免疫抑制特性，其活性是环抱素的10-100倍，预防各种器官移植所出现的排斥反应的效

7、果优于环抱素。1989年，美国匹兹堡大学starzl器官移植中心将fk506首次在临床试用，1993年在日本上市，商品名普乐可复 （prograf）。1995年经fda获准后在多个国家正式使用，1999年获准在中国上市。目 前，普乐可复已广泛应用于肝脏、胰腺、肾脏、心脏、肺等实体器官移植的抗排斥作用。3、ascomycin （子囊霉素，fk520,免疫霉素/immunomycin）继fk506之后，1988年藤泽公司又报道从另一株链霉菌 streptomyces hygroscopicus subsp yakushimaensisno 72381代谢产物中获得两个新的与 fk506结构类似的2

8、3元环 含哌可酰基大环内酯类化合物 fr900520和fr900523 （图3、4） 17。它们与fk506结 构仅在内酯环c-21位上侧链不同，分别是乙基、甲基，而fk506该位置是烯丙基。体外混合淋巴细胞反应实验显示两个化合物均有免疫抑制作用，ic50分别为0.55 nm和1.6nm,略高于fk506的0.23 nm。低于3200nm对淋巴瘤el-4体外没有细胞毒作用。图3fr900520结构式图4fr900523结构式两个化合物对细菌和酵母样真菌均没有抗菌活性，对丝状真菌烟曲霉（aspergillusfumigatus ifo 5840）显示较强抗菌活性，mic 分别为 0.03 仙 g

9、/ml and 0.3pg/ml。fr900520能够明显延长皮肤移植物存活时间，并显现量效关系。1992年morisaki等人证实fr900520与arai等人1962年报道的从吸水链霉菌子囊 霉素变种（streptomyces hygroscopicuvar. ascomyceticusatcc14891）中发现的抗真菌抗 生素子囊霉素（ascomycin）同质18。4、meridamycin （美立霉素）由于环抱素、fk506和雷帕霉素等微生物来源的免疫抑制剂的临床成功应用，引起各国科学家广泛关注，试图从微生物代谢产物中发现选择性更强、毒性更低的新型免疫调节剂。特别是把fk506和雷帕霉

10、素共同的结合靶标 fkbp12作为研究基础开展广泛的 化合物筛选，1994年和1995年，瑞士山道士公司fehj19和美国默克公司salituro20等 人先后报道从两株链霉菌（streptomycessp. a 91-261 402 和 streptomyceshygroscopicusf-004081）代谢产物中发现一个新的29元环含哌可酰基大环内酯类化合物，命名为meridamycin （美立霉素）（图5）,内酯环含有1分子哌可酰基和相连的环半酮缩醇结构 （图5蓝色部分），这部分结构可能是fkbp12结合的关键基团，与雷帕霉素完全相同， 而与fk506仅相差一个氧甲基。meridamyc

11、in能够竞争性抑制fk506与fkbp12结合， ic50为1.0 ng/ml,但其本身没有免疫抑制活性，能够拮抗fk506和雷帕霉素的免疫抑制活性，因此可能作为k506和雷帕霉素过量服用的解毒剂，另外还发现其可作为皮质 激素的增效剂用于治疗皮肤炎症和增生。作为非糖皮质激素vb疗特应性皮炎，fk506和fk520的半合成衍生物叱美莫司（pimecrolimus）（图6）已获准上市，被誉为外用糖皮质激素后皮肤科治疗最重要的突破之一。图5 meridamycin结构式图 6 pimecrolimus 结构式研究发现meridamycin及其衍生物在治疗神经退行性疾病，如老年性痴呆（alzheime

12、r's）、帕金森综合症（parkinsons disease、创伤性和缺血性神经损伤，促进神经再生和神经保护等方面具有潜在的应用前景，引起了广泛的关注。美国惠氏公司已 就此申请了专利保护21o5、antascomicins瑞士山道士公司上世纪八十年代研发成功十一环肽抗生素环抱素用于器官移植抗排斥治疗之后，他们又利用子囊霉素、fk506和雷帕霉素这类化合物通过与免疫亲合蛋白(immunophilin)结合发挥免疫抑制活性的作用机制，广泛筛选能够与此类蛋白结合的微生物代谢产物，继1994年报道发现meridamycin后，1996年又报道从12000株放线菌中发现一株从采自中国的土壤样品中

13、分离得到的小单抱菌(micromonospora sp.a92-306401) 22,其发酵液中分离得到5个与fk506结构类似新的23元环含哌可酰基大环内酯类化合物 antascomicins (图7)。rir2r3nantascomicin a二h=h=h2antascomicin b=oh=h=h2antascomicin c=oh=ch3=h2antascomicin d=h=h=h1antascomicin e=h=h=oh2图 7 antascomicins 结构式antascomicins具有很强的fkbp12结合能力，除了内酯环上哌可酰基被脯酰基取代 的antascomicin

14、 d外，其余4个化合物与fkbp12结合能力与fk506和雷帕霉素相当， antascomicin d结合力低5-10倍，混合淋巴细胞反应实验显示 antascomicins没有抑制 t淋巴细胞增殖活性，在 fk506相同剂量条件下无抑制白细胞介素ii合成的活性，也 没有类似雷帕霉素抑制 细胞生长因子诱导的 增殖活性。同meridamycin 一样, antascomicins能够拮抗fk506和雷帕霉素的活性，特别是对雷帕霉素，等摩尔浓度的 antascomicin b或者c即可抵消雷帕霉素体外活性。6、nocardiopsins2010年澳大利亚昆士兰大学capon等人23从55米深处海洋

15、沉积物中分离得到一株 拟诺卡氏菌(nocardiopsis sp. cmb-m0232),该菌种在不含海水的培养基中产生两个 22 元环含哌可酰基大环内酯类化合物 nocardiopsin a和b (图8)。一般认为，含氮大环内 酯类化合物通过哌可酰基和相连的环半酮缩醇结构与靶位蛋白fkbp相互结合形成复合物，再以复合物形式与不同细胞信号传导途径位点作用，发挥各种生物学活性。与上述 各化合物不同，nocardiopsins分子结构中没有环半酮缩醇结构，即没有完整的fkbp结 合基团，但它们能保留中等强度的 fkbp12结合能力，体外无抗细菌、抗真菌和细胞毒 活性。能够与fkbps结合，但没有免

16、疫抑制活性的化合物很可能在神经退行性疾病治 疗、神经再生和神经营养方面具有潜在应用价值，这方面的研究工作还在进行当中。图 8 nocardiopsins 结构式二、含氮大环内酯类化合物生物学活性及其作用机制随着fk506、雷帕霉素等一些列含氮大环内酯类化合物作为器官移植抗排斥药物成 功开发，对它们的独特作用机制和生物合成机制的研究也不断取得重大突破。特别是这 类化合物共同的结合靶标fkbps和哺乳动物细胞信号传导途径关键调控靶标mtor的发现24及其调控机制不断被揭示，也带来这类化合物在临床上新的应用领域。1991年hall等人分别在science和pnas杂志上发表报道，发现雷帕霉素在酵母细

17、 胞信号传导途径中的作用靶点 tor (target of rapamycin) 25和啤酒酵母中fk506的结 合靶标fkbp (fk506 binding protein) 26,开始了此类化合物细胞内分子作用机制的深 入研究。fkbp是一类免疫亲合蛋白(immunophilins),具有肽酰基脯氨酰顺反异构酶活性(peptidylprolyl cis/trans isomerases, ppiases, fkbp 广泛存在于从古菌到哺乳动物的细 胞中，体外蛋白复性实验中，xaa-pro键的顺反异构化是限速步骤，而ppiase可极大提高xaa-pro键顺反构型的转化率，在新生肽链的折叠与生

18、物大分子自我组装过程中发挥 重要作用，决定了此类蛋白质的多功能性27-28o雷帕霉素、fk506等此类化合物含有与 ppiase底物脯氨酰基结构相似的哌可酰基，推测可能与底物竞争性结合fkpb的ppiase 催化位点，抑制ppiase活性。人体基因组中含有20多个免疫亲合蛋白基因，研究表明 28 它们与体内一系列功能蛋白相关， 如钙调磷酸酶29-30 、 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mtor)31 、钙离子通道(ion channels) 32-33、类固醇受体复合物(steroid receptor complexes)34 、转录因子( transcription factors) 35 、

19、 bcl-2 条件激活上调( bcl-2 upon conditionalactivation) 36等，因此 fk506 、雷帕霉素等免疫亲合蛋白配基化合物能够干扰体内正常存在的 fkbp复合物，或者通过形成三重复合物(如fkbp12fk506palcineurin、fkbp12tapamycinmtor),引起免疫细胞生长、内皮细胞生长、月中瘤发生、神经营养和再生甚至动物寿命等相关的一系列的生物学活性37 。 ppiase 作用机制正在逐步被认识，可能是与磷酸化信号传导途径类似的一种还尚未被深入了解的细胞调控机制 28 。由于雷帕霉素的研究，从啤酒酵母中发现了真核细胞信号传导途径中关键靶位

20、tor ， tor 在调控细胞的生长、营养中发挥重要作用。随后又从其它真菌、哺乳动物、苍蝇、蠕虫和植物中发现tor 靶位，证明 tor 在各种真核生物细胞中高度保守。低等真核细胞一般都含有两个tor基因，而高等真核生物细胞一般都只含有一个 tor基因， 1994年sabatini24brown38几乎同时报道从哺乳动物细胞中发现高等真核细胞 tor, 并分别在 cell 和 nature 杂志上报道。mtor (哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)是丝/苏氨酸蛋白激酶家族中的一员，这类蛋白激酶又属于磷酯酰肌醇激酶相关激酶( pikk ) 。k506 和雷帕霉素能够与相同的靶蛋白 fkbp12 结合发挥其免

21、疫抑制作用，但它们的免疫抑制机制不同， fk506 与 fkbp12 结合形成的复合物作用于钙调磷酸酶(calcineurin) 39，而雷帕霉素与fkbp12 结合形成的复合物作用于哺乳动物细胞信号传导途径的关键靶酶 mtor (mammalian target of rapamycin)靶位。mtor靶位调控 不同细胞因子受体的信号传导，阻断 t淋巴细胞及其它细胞由g1期至s期的进程，在 细胞增殖、分化、转移和存活中扮演重要角色，与肿瘤发生、发展、转移密切相关，对白血病、卵巢癌、乳腺癌、中枢神经和小细胞肺癌等有效，成为癌症治疗中的一个新靶点40。美国fda 分别于2007年、 2009年批

22、准雷帕霉素半合成衍生物cci-779、everolimus用于晚期肾癌治疗，另一个雷帕霉素衍生物 ap23573也于2010年fda批准进行软组织和骨骼恶性肿瘤的临床研究 41 ， 此类化合物对非小细胞肺癌42 、 肉瘤等的应用已处在临床试验阶段43 。随着含氮大环内酯类化合物的深入研究， 发现它们在神经保护和神经营养方面具有潜在的作用，特别是 meridamycin、antascomicins等本身没有免疫抑制活性的此类化合物，具有更大的优势，它们可能不是与fkbp12结合，而是与另一个具有ppiase活性的靶蛋白 fkbp52 结合后发挥生物学活性44，没有 fkbp12 结合能力的 fk

23、506 衍生物能够刺激 sh-sy5y 细胞神经突触延长和加快神经再生45 。这类化合物的结合靶点及其复杂的作用机制目前仍然还有待更多的研究和探索。此外，fk506以及子囊霉素的半合成衍生物口比美莫司(pimecrolimus)对特应性皮炎、银屑病和秃斑等自身免疫性疾病有很好的疗效，国外已开发成替代糖皮质激素的新型治疗皮炎药物，被誉为皮肤科治疗的重大突破5 。雷帕霉素及其衍生物还有抑制血管内皮细胞生长的作用，已经有多个化合物获准用作血管扩张支架的涂层药物，抑制支架植入后的血管再狭窄。值得关注的是2009年7月nature杂志发表14位美国科学家共同署名的论文10 ， 报道雷帕霉素可延长老龄小鼠

24、寿命的研究结果， 他们分别在3个不同实验室对 2000 只 20 个月龄的白鼠进行试验， 结果摄入雷帕霉素的雌雄白鼠的寿命分别平均增加了 14%和9%,最高达35%,这项成果被science杂志评选为2009年世界十大科学进展之一。三、含氮大环内酯类化合物的生物合成含氮大环内酯类化合物重要的生物学功能和临床应用价值， 引起分子生物学家的极大兴趣，深入开展对此类化合物的生物合成机制的研究，为通过遗传改造、组合生物合成、酶工程等技术获得高效、低毒、具有新生物学活性的衍生物奠定坚实的基础。1、内酯环生物合成剑桥大学leadlay等人46成功克隆了红霉素合成基因簇并推导出红霉素内酯环(6- 脱氧红霉酯

25、b )合成途径，开辟了聚酮类化合物特殊的合成机制研究。典型的i型聚酮合酶(polyketide synthases，pks)是一类具有模块(module)结构的巨型复合酶体，一般由多亚基蛋白组成，每个亚基含有不同数目的模块，模块之间呈线性排列 ， 每个模 块含 有相似的催化活性域 (domain) ， 至少包括酮基合成酶 (ketosynthase ks)、酰基转移酶(acyltransferasq at)和酰基载体蛋白(acyl carrier protein， acp) (图 9) 3个活性域，共同负责聚酮链一个延伸循环，使聚酮链延长 2个 碳长度，同时在b位形成酮基，a位根据at识别的底

26、物不同，可能产生甲基、乙基、 氧甲基、 烯丙基等侧链基团。 在每个模块内部 at 与 acp 之间， 还可能存在酮基还原酶( keto reductase， kr ) 、脱水酶(dehydratase， dh )和烯酰基还原酶( enoyl reductase， 31er）等b位酮基修饰活性域，负责把本模块延伸形成的b位酮基还原为羟基、烯键或饱和碳链。pks最后一个模块一般含有1个硫酯酶（thioesterase te）活性域，负责把 合成完成的聚酮链内酯化，进而从最后一个模块的acp上脱离下来，形成内酯环化的代谢产物前体。最后通过其它相关氧化酶、甲基转移酶等修饰酶对前体物进行结构修饰 形成终

27、产物。dhat acp ks at acpks at acp tein利用防momo®leelong翩ommiqduiettermi丽mmoeuieks domain,ketosynthaseat domain,acyltransferaseacp domain, acyl carrier protein te domain, thioesterase kr domain, keto reductase dh domain, dehydratase er domain, enoyl reductase典型晔-闻9示i端ks结构示意图ks domain, ketosynthasekr

28、domain, keto reductaseat1<9ma 砺 aearaayerase 47 成功克 dhdoma献dehydratases 簇,其聚酮链同样也是由典型acp domain, acyl carrier protein er domain, enoyl reductase的teeaornsn/io幽eras成。雷帕霉素合成基因簇全长超过1。7世，含有26个编码基因,其中3个超大型开放阅读框（orfs）,分别命名为rapa、rapb和rapc基因，相应的编 码蛋白rapa、rapb和rapc分另1j达至i 900kda、1.07mda和660 kda,占整个合成基因簇的3/

29、4以上，是典型的i型pks编码基因，分别含4个、6个和4个延伸模块，第1 个亚基还同时含有1个起始模块，三个pks亚基总共含有70个催化活性域，负责催化雷帕霉素内酯环的脂肪链部分。每个模块负责识别不同小分子酰基-coa底物，通过缩合反应使聚酮链延伸两个碳原子。同位素标记的前体物添加实验证明雷帕霉素pks起始模块识别的是莽草酸 衍生物（4r,5r）-4,5-dihydroxy-cyclohex-1-enecarboxylic acid （dhchc）48, 14个延伸模块中有7个识别丙二酰-辅酶a底物（分别是第2、5、8、9、 11、12和14模块）、7个识别的是甲基丙二酰-辅酶a （分别是第1

30、、3、4、6、7、10 和13模块），后者使内酯环相应位置形成甲基侧链。第8、9和10模块均同时含有kr和dh两个活性域，因此连续3个模块延伸形成的b位酮基均被还原为不饱和烯键，形 成共腕三烯结构49 o除 pks 编码基因外，在 rapa 和 rapc 之间有一个典型的非核糖体肽合成酶( nonribosomal peptide synthetase nrps)基因rapp,序列分析是单模块 nrps基因。雷帕 霉素 pks 最后一个模块没有te 活性域，因此推测聚酮链合成后并没有马上环化脱离pks,而是pks与nrps杂合50, nrps模块的腺甘活化酶活性域(adenylation, a

31、) 特异性识别并活化哌可酸，以硫酯键形式与肽酰基载体蛋白( peptidyl carrier protein， pcp)活性域结合，并通过 pks/nrps杂合酶，哌可酰基上 n原子攻击pks上合成的 聚酮链硫酯键，把哌可酰基整合到聚酮链中。rapp模块含有两个c (condensation)活性域， 第 2 个 c 活性域被认为起替代pks 的 te 硫酯酶活性域作用， 催化含哌可酰基的聚酮链内酯化从pks/nrps酶中水解脱离，形成前雷帕霉素(pre-rapamycin) 51,最后 经过基因簇中编码的氧化酶、甲基转移酶等修饰改造，形成雷帕霉素(图10) 。2000 年 wu 等人 52从

32、产生菌吸水链霉菌(streptomyces hygroscopicusatcc 14891)克隆了大约77kb 的 fk520 合成基因簇，基因簇结构与雷帕霉素的非常相似，同样含有3个pks编码基因，但是分别只含有4、2、4个延伸模块，第1个pks含有1个起始 模块，第 2 个 pks 相对雷帕霉素少4 个模块，这与fk520 内酯环比雷帕霉素少8 个碳相吻合。除了 fkbd 基因编码蛋白催化 c-9 位的双加氧形成酮基，在整个基因簇(包括上下游附近区域)没有发现其它 p450氧化酶基因，证明fk520的c-13和c-15位甲氧 基不是pks后修饰形成的，而是相应的pks第7、8模块at活性域

33、识别a位含氧的底 物。根据基因簇中基因编码序列同源性分析，相连的 5 个基因 fkbghijk 可能是编码合成特殊聚酮链延伸底物氧甲基丙二酰-acp 的基因。 其中 fkbj 编码 acp 载体蛋白， fkbh编码蛋白催化糖酵解途径中的 3 碳中间产物形成丙三基-acpj ，然后依次由 fkbjk、 i 和g 基因编码蛋白催化氧化和甲基化， 形成特殊的 pks 合成底物氧甲基丙二酰基 (图 11) 。 基因簇中除催化 c-31 位羟基甲基化的甲基转移酶基因 fkbm 外， 只发现一个甲基转移酶基因fkbg,因为甲基化酶是一类底物特异性很强的蛋白质，因此fkbg更有可能催化羟基丙二酰基甲基化形成

34、模块7 和模块 8 共同的底物氧甲基-丙二酰 -acp ，而不是聚酮链合成后甲基化 c-13 和 c-15 两个不同位点。 fkbghijk 基因远离 pks 一侧还有多个与第 4 模块识别底物乙基-丙二酰-coa 合成相关的基因。 33 raparapbrapcmodule 1 module 2 module 3 module 4module 5 module 6 module 7 module 8 module 9 module 10module 11 module 12 module 13 module 14dhkrdhkrcpacpatatacpatatacpktat aciacpho

35、dh krs atks aacp ksks at acp图10雷帕霉素合成途径34rapcrapprappmodule 11 module 12 module 13 module 14m odule nrps“er；_kr ：kr )dh> ：kr口烫p3 ：a节可切atjacp1 c|a fpcp/cc p支弋。'> oh s oh >osu ohi 1 finiho ory-<> ohmr q 3ll(i oft) (ito or图10.m odule nrps厂、。hcia pcpl c4人/。3人产-t()ao ° q'<h

36、jc r oh ohh 2儿.ihahac*hpre-rapamycinf1l公“ r 5° hcy°h/o电s'。砌ho'h3c 丁人0 och3hu ukchsh3crapamycin雷帕霉素合成途径(续)36糖酵解途径中间产物fkbhfkbk'fkbi'fkbgho_as.acpj hoaacp hoaacpjhjcoaacpjch2ohchocoohcooh图11氧甲基丙二酰基合成途径除fk520外目前为止，已发现多个聚酮类微生物代谢产物含有 a位是氧甲基的侧链 基团53,如 ansamitocin p-354、geldanamycm

37、55、soraphen a leucomycin、concanamycins bafilomycin、aflastatin、oxazolomycin和tautomycin。它们的聚酮链合成过程都用到乙醇 酸延伸单元（glycolate unit）,产生含甲基化的羟基侧链结构。与其它 at识别底物均为 酰基-coa不同，乙醇酸延伸单元是与 acp载体蛋白结合，被at位点识别56。实验表明标记的丁酰基能够整合到 fk520的c-21乙基侧链，说明模块4特异性底 物是乙基-丙二酰-coa。推测链霉菌菌丝生长期累积的聚羟基丁酸酯（ phb）和聚羟基 脂肪酸酯（pha）可能在fk520合成过程提供丁酰基

38、-coa,序列同源性分析发现分布 于合成基因簇两侧的fkbs、fkbu、fkbe和一个未被发现的酰基-coa竣化酶基因以及产 生菌胞内的辅酶a连接酶可能与催化phb合成乙基-丙二酰-coa相关（图12）。3-羟基 -丁酰-coa也可以由初级代谢产物乙酰乙酰-coa还原而来，但在fk520产生菌中phb解聚途径可能是主要来源。乙基丙二酰-coa酰基-coa竣化酶scoa 42图12 fk520模块4延伸单元乙基丙二酰-coa合成途径对fk506合成机制的了解更多的是基于 fk520的研究结果。1998年，motamedi 等人57报道从fk506产生菌streptomycessp. ma6548

39、中克隆部分合成基因簇，与fk520 相似，含有3个pks编码基因fkba、fkbb和fkbc,三个基因编码蛋白按照 bca顺序 组成完整的fk506聚酮链合成酶，从n端到c端3个亚基分别包含4、2、4个pks模 块，总共51个功能活性域，比雷帕霉素pks少4个模块，因此其内酯环相应少8个碳 单位。其中第3、10模块识别底物是丙二酰辅酶 a,第1、2、5、6和9模块识别的是 甲基丙二酰辅酶a,相应位点形成甲基侧链，但第7、8模块利用的是氧甲基丙二酰-acp 还是丙二酰-coa,并没有合成基因的支持，内酯环上 c-21位烯丙基是如何合成的也没 有深入的研究，直到 2010年goranovic等人5

40、8报道克隆了 streptomyces tsukubaensis nrrl 18488菌株完整的fk506合成基因簇，发现在fk520乙基丙二酰-coa合成相关 基因的相应位置，存在一个由9个编码基因构成的称为“ all”的亚基因簇，基因敲除和 添加前体物实验证明该亚基因簇负责合成fk506第4模块特殊的5碳延伸单元烯丙基-丙二酰-coa,序列分析发现它形成一个新的二酮合酶复合体，从合成基因水平解析了 fk506的c-21位侧链的生物合成途径，纠正了原来一直认为第4模块利用的是内基-丙二酰coa延伸单元，聚酮链合成后再对侧链内基进行氧化修饰为烯丙基的假设。2011年 noon 等人 59系统研

41、究了 3 株 fk506 产生菌 streptomycessp. atcc 55098 （ma6858）, streptomyceskanamyceticuskctc 9225和 streptomycessp. kctc 11604bp 的合成基因 簇，发现与 fk520 产生菌 s. hygroscopicusvar. ascomyceticusatcc14891 合成基因簇有 15个连续排列的基因完全相同，它们是 pks/nrps基因（fkbc、b、p和 a）、 methoxymalonyl-acp合成基因（fkbg、h、i、j、k）、哌可酸合成基因fkbl、起始模块 底物 dhchc 合

42、成相关基因 fkbo、31-o-methyltransferase基因 fkbm、c-9 hydroxylase 基因fkbd、调控基因fkbn和1个ii型硫酯酶基因fkbq,它们在基因簇中是保守的。fk520 模块4延伸单元乙基丙二酰-coa合成相关基因有3个（fkbe、s、u）,分别散落位于 fk520合成基因簇的两侧，在所有fk506产生菌基因簇中均没有发现这些基因。上述3株fk506产生菌的合成基因簇中只有 4个连续排列的基因（tcsa、tcsb、tcsc和tcsd） 在所有基因簇中均存在，推测只有这 4个基因与模块4延伸单元合成有关。进一步研究 发现这4个基因编码蛋白是一种新的聚酮合

43、酶，其中 tcsa基因编码酰基转移酶（at） 和酰基载体蛋白（acp）活性域，tcsb编码2个不常见的代酮基合酶（ks）,这种结构形式与ii型pks相似。tcsc与巴豆酰-coa竣化酶/还原酶同源性达60%,可能催化烯 酰基-coa的竣化还原，tcsd与酰基-coa脱氢酶具有大约70%的序列相似性，但是在 基因簇附近没有发现催化伊酮基还原的酶编码基因（酮基还原酶和脱水酶），因此推测&烯键的形成可能与胞内脂肪酸合成酶（fas）系统共享合成途径（图13）。streptomycessp. kctc 11604bp合成基因簇中还含有 5个未知基因（tcs1、tcs2、tcs3、tcs4和tcs

44、5）（goranovic等人报道的 streptomyces tsukubaensinrrl 18488 基因簇中 allm、n、p、。和s）,基因敲除证明这些基因与 fk506合成无关。36,37-二氢-fk506tcsc /fk506图13 fk506模块4延伸单元烯丙基-coa合成途径综上，fk506聚酮链合成使用了莽草酸衍生物 dhchc （起始模块）、2个丙二酰-coa （模块3、10）、5个甲基-丙二酰-coa （模块1、2、5、6和9）、2个氧甲基-丙二酰-acp （模块7、8）以及1个丙烯基-丙二酰-coa （模块4）（图14）。由于模块4的酰基转移 酶活性域（at）底物特异性

45、较低，除烯丙基丙二酰-coa外，还可识别甲基丙二酰-coa、 乙基丙二酰-coa和丙基丙二酰-coa等pks延伸底物，因此fk506产生菌一般还会产 生c-21位为甲基、乙基或者是丙基的 fk523、fk520和36, 37-二氢fk506等同系物， 给发酵下游提取纯化带来很多困难。fk520产生菌由于没有合成5碳酰基延伸单元的合 成基因，细胞内只有甲基丙二酰-coa和乙基丙二酰-coa可被模块4的at位点识别， 因此往往产生fk523副产物，而不会产生fk506或36, 37-二氢fk506等同系物。al)h( h(l-pipeuolic acidcoohallylmalonyl-coaco

46、scoa1hnm/ pcocoaushmalonvht'oa vi 1johh"coficoa(2s hmeth ylinalo ii vl -col v(jveolvtic*rpalhu ;ivfkbg, il l j and k44intermediate图14 fk506合成途径(根据 yeo joon yoon, et al. j ind microbiol biotechnol, 2009, 36:1473 -1482 修正)2006年 he60和 sun 61等人先后从不同的 meridamycin 产生菌 streptomycessp. nrrl 30748 和

47、 streptomyces sp. dsm 4137 基因组中克隆了 meridamycin 合成基因簇。streptomycessp. nrrl 30748合成基因簇位于117kb dna序列中，其中75kb左右序列 编码pks和nrps基因，与雷帕霉素、fk506和fk520基因簇不同，负责哌可酰基整 合到聚酮链的 nrps 基因位于 pks 上游，而不是在pks 不同亚基编码基因中间，meridamycin的pks基因共有4个orf,第1个亚基含起始模块和其它3个模块，第2 亚基含完整的 4 个模块， 第 3 亚基含完整的 5 个模块和 13 模块的 ks 活性域， 第 4 个亚 基含1

48、3模块的at、dh、er、kr和acp5个活性域以及完整的14模块。这种同一模 块夸基因的编码形式在天然产物编码基因中尚不多见， 同时发现第 3 亚基 merc 的 c 端 和第 4 亚基 merd 的 n 端的多肽连接序列较长，可能是保证夸亚基组装完整的 13模块 所必须的。另外一个不同，在雷帕霉素、 fk506 和 fk520 基因簇的 pks 中均有发现沉 默活性域， 如雷帕霉素模块 3 含有 dh/er/kr 活性域， 但却没有活性， 在终产物相应位置酮基没有发生还原反应，而meridamycin 的 pks 则没有发现这种现象。 14 个模块的at 识别底物分别是丙二酰辅酶a （模块

49、3、 8、 9、 11 和 12） 、甲基丙二酰辅酶a （模块1、 2、 5、 6、 7、 10 和 13）和乙基丙二酰辅酶a （模块 4） 。 4 个 pks 编码基因转录方向相同，且排列顺序与聚酮链合成顺序一致，同上游nrps 基因及下游细胞色素 p450单氧化酶基因 mere 可能形成一个大约78kb 大小的大转录子。sun等人在研究1株能够同时产生elaiophylin （洋橄榄叶素）、nigericin （尼日利亚 菌素） 、 abierixin 、 meridamycin 等多种聚酮类和多肽类次级代谢产物的多能链霉菌streptomycessp. dsm 4137时，发现该菌株至少

50、含有 11个具有模块结构的 pks和多个芳香类聚酮合酶以及非核糖体肽合成酶， 其中一个约 95kb 的基因簇结构与meridamycin合成基因完全相似， dsm 4137合成基因簇仅含有5个与 meridamycin 合成相关基因，分别是哌可酰基整合酶基因 merp、3个连续的pks基因（mera、merb和merc）以及 1个细胞色素p450蛋白merd,其中merc编码的pks含6个模块，经深入分析，认为 上述 he 报道的 nrrl 30748 菌株 merc 和 merd 基因在测序和拼接时可能有误， 应该是连续编码基因。 dsm 4137菌株的 meridamycin 基因簇组成简

51、单，未发现如调控基因、哌可酸合成酶基因、乙基丙二酰基合成相关基因等，可能是因为该菌株的多功能性，在其它代谢产物合成基因簇存在的相关基因能够实现共享。此类化合物的内酯环聚酮链和哌可酰基骨架（图15）都是通过pks/nrps杂合的模块结构硫模版合成机制催化合成的， 最后由nrps的缩合活性域催化内酯化并从硫模 版上解离。目前已有至少8株不同链霉菌的此类化合物合成基因簇被克隆、 分析（图16） c（从上到下依次为：雷帕霉素、fk506、fk520、meridamycin、antascomicins 和nocardiopsins聚酮链骨架。粉色为起始单元，蓝色为延伸单元，红色是哌可酰基）图15微生物来

52、源的含氮大环内酯类化合物硫模版机制合成的内酯环骨架4740so607011o1o2030(peter f. leadlay 等,1995)krdmn posghijk lallylmalonyl-snac methoxymalonyl-acpextender unit related genes related genesfkbcfkbbfkbpfkbafkbo51(hrvoje petkovic 等，2010)a :雷帕霉素(s. hygroscopicus nrrl 5491 ); b: fk506 (s. tsukubaensisnrrl 18488 )图16不同含氮大环内酯类产生菌合成

53、基因簇结构tcsatkbg fkb/ fkbk fkbj fkblfkbd 段bm fkbn fkbqfkbr2 tkbe fkbg fkbi fkbkfkbw fkbu fkbr1 fkbf tm)h承j&j fkbl pks fkbd fkbm fkbn tkbq thbsgenes responsibile for ailylrnalonybcca (9)bkjsynthestsother genesertesponsibleformettioxymalonylacp biosyrtliesisgenes encoding polykelide synthase (pks)gen

54、es responsible forregulatiora gene ericdding type ii thioesterasageres responsible for ethyl ma lonyl- coa txcsyrrfhesis(yeo joon yoon 等,2011)c: fk506 (streptomyces sp. kctc 11604bp); d： fk506 (streptomyces sp.atcc 55098 (ma6858), streptomyces kanamyceticus kctc 9225 );e: fk520 ( s. hygroscopicus va

55、r. ascomyceticus atcc14891)图16不同含氮大环内酯类产生菌合成基因簇结构（续一）a gene respons ble for starter un tgenes responsible fcr post-pksbiosytthesistailorirrgklioi2d3d4050607080ii9010di11dmers中刖例鹏悴non ribosomal pfpfroe synthasepolyketide synthaseregulatory proi ehmembrane protein 'transporierffil methyl trwsferasjep45ui mohoomyg l h alsugar metabolisme?e proteins involved in pfumwry metabolism| utlkrioml function(min he 等，2006)个，叩甲，的，彳。809。 100kbpmerdat-richnon-codingregion(stephen f. haydock 等,2006)f: m