金银花20121030

1、生物化学实验自主设计实验与实践课题申请书题 目 金银花中绿原酸的提取及其抑菌作用的研究 姓 名 汪丽、杨镇宇、潘蕾 专 业 动物科学 学 号 3130103178 实验班级 周一下午 指导教师 李霁 浙江大学生物实验教学中心2014年11月课题名称金银花中绿原酸的提取及其抑菌作用的研究课题组长杨镇宇学号专业动物科学Email电话手机小 组 成 员姓名潘蕾学号3130103178专业动物科学姓名汪丽学号专业姓名学号专业姓名学号专业摘 要 金银花为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物忍冬(Lonicerajaponicathunb)及同属多种植物的干燥花蕾,是临床常

2、用的中药之一。金银花是人医临床常用的有代表性的清热解毒药,也是防治乳腺炎的要药之一,具有抗菌、消炎、解热、保肝、抗生育、止血、免疫调节、降血脂、兴奋中枢等多方面的药理学作用。金银花抗菌的有效成分主要是绿原酸和异绿原酸。金银花在我国分布广,药用历史悠久,是常用的清热解毒药。近年来研究发现,金银花中富含多种对人体健康有益的物质,诸如挥发油黄酮及绿原酸类、三萜类和微量元素等,具有很高的利用价值。在众多的成分中绿原酸较为丰富且具有多种活性功能,因此常以绿原酸含量的高低评价金银花质量的优劣。   绿原酸是一种含有酚羟基的化合物,药理学证明,绿原酸具有保护心血管的活性。人体内的低密度脂

3、蛋白(LDL)被氧化是引起心血管病的一个重要原因。绿原酸能有效地保护人体LDL中2Tocopher2ol,使其LDL免受氧化。当人体摄入一定量含有酚羟基化合物的食物时,这些物质可降低或淬灭人体中自由基的产生。据统计在心脏病低发病率的人群中,发病率与绿原酸的摄入有一定联系,其部分抗病机制是绿原酸对人体LDL中2Tocopherol氧化的抑制作用。 实验对金银花中绿原酸的抗菌、抗氧化活性等方面做一些探讨,为工业化生产该类物质提供一定的技术依据，为筛选、研发防治杀菌抗氧化药物新制剂提供参考数据和理论依据。关键词（用分号分开，最多5个）金银花；绿原酸；抑菌作用；抗氧化性基本信息立题依据与研究内容： 1

4、.课题的立题依据。（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义及其应用前景。附主要参考文献目录）金银花为忍冬属忍冬植物的干燥花蕾 ，常用于中药及保健食品，具有清热解毒 ，凉风散热，抗病毒，保肝利胆的功能。金银花含有绿原酸、异绿原酸 、三萜皂苷、木犀草素及肌醇等，一般认为 ，金银花的抗菌有效成分为绿原酸，且常以绿原酸的含量高低来评价金银花质量的好坏。绿原酸具有显著的清热解毒、抗菌消炎作用，同时还具有增香和护色功能，可用于食品和果品的保鲜防腐。绿原酸是含有羧基和邻二酚羟基的有机酸，易溶于水、醇溶液和丙酮等溶剂。金银花即忍冬花在我国分布较广,而且药用历史悠久,为常用

5、的清热解毒药。它也是国家卫生部首批颁布的既是食品又是药品的60种中药之一。 金银花中的绿原酸由于其优越的抗菌、抗氧化活性愈来愈受到国内外的广泛关注。Peter 等人(1998)的研究结果认为，绿原酸是很有希望的抗艾滋病毒(HIV)的先导化合物， Kwon 等人（2000）的研究结果与之一致。鉴于绿原酸的巨大开发价值，国内外已纷纷开展绿原酸提取及其药理活性的相关研究，绿原酸的提取工艺也取得了一定的研究进展，但提取率低、能耗大、耗时长、工艺复杂等问题一直未能有效解决。金银花在我国作为药用已有数千年历史，栽培相当广泛，在上述国家政策背景以及社会市场需求下，采用现代新技术对金银花特征成分绿原酸的进行提

6、取及纯化研究工作十分有意义；鉴于绿原酸疗效确切和富含绿原酸的各种制剂在临床上的广泛使用，若从中提取医用绿原酸，原料有来源保障，将有广阔的开发前景。本实验将采用多种方法分别从金银花中提取绿原酸,用紫外光谱法进行定性定量分析，探究高效节约的有效提取方法。并测定绿原酸对几种的致病菌的抑菌能力,进一步明确绿原酸的抑菌活性,完善绿原酸的抗菌谱，同时探究其对自由基的抗氧化能力。为研发筛选消炎抗菌药物及其它抗氧化性产品的生产提供一定的理论依据，进一步完善对绿原酸的研究。参考文献1 乌兰.金银花中绿原酸的提取及抗氧化性的研究C. 天津科技大学 ，2005;2徐跃成.金银花中绿原酸的提取分离及其抑菌作用研究C.

7、重庆大学,2008;3赵钟兴;韦藤幼;郝瑞然从金银花中提取绿原酸生产工艺的改进期刊论文-时珍国医国药 2004(12);4 林缎嫦，宋劲诗，等&金银花中绿原酸提取工艺探究J.中成药，1994;5许东颖，盛家荣，贾永周.金银花中绿原酸提取方法的比较和优化研究N.广西师范学院学报.2003.6第二期；6 王宏军, 吴国娟, 李焕荣,于同泉, 蒋红, 路苹.金银花中绿原酸提取方法的筛选及其抑菌作用N.北京农学院;7吴正奇，洪秀菊，石勇.膜技术分离纯化绿原酸提取液的研究J.食品科学.2007.28（11）；8黄云;肖艳萍;李娟不同工艺的金银花提取物组分比较研究期刊论文-中医药导报 2005(0

8、6).本文采用多种方法分别从金银花中提取绿原酸,用紫外光谱法和高效液相色谱法对其进行定性定量分析。测定了绿原酸对食品中常见的致病菌的抑菌能力,清除DPPH自由基的能力和对Fe3+的还原能力。还对绿原酸的物理、化学性质即对光、热等的稳定性进行了研究。 绿原酸提取试验结果表明:绿原酸的最大吸收峰为324nm,用70%乙醇热回流提取,时间为90min,浸提溶剂比为101（v/w）,提取温度为80。精制工艺条件为:选择D-301吸附树脂,上柱液以30、2mL/min的流速下直接上柱吸附,15%乙醇洗脱,获得绿原酸的提取率高于其他方法,提取终产物与标准品的最高吸收峰均在324nm处,终产物中绿原酸的含量

9、为90.38%。抗菌试验结果表明:绿原酸具有较强的抑菌活性。抗氧化试验结果表明,金银花中绿原酸对自由基DPPH·有较强的清除能力;从还原力上比较,较低浓度的绿原酸也远高出抗坏血酸的还原力;对绿原酸的物理、化学性质的研究结果表明,它对光、热等稳定。2、课题的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。（此部分为重点阐述内容）（1） 研究内容：1.查询各类文献后得到常用的三种提取绿原酸的方法，通过水提法，醇提法，超声波提取法三种方法从金银花中提取绿原酸，得到产物后通过紫外分光光度计测量分析数据后可得三种方法所得绿原酸的含量。2.通过实验探究金银花中绿原酸对大肠埃希氏菌,枯草芽胞杆菌,金黄色

10、葡萄球菌,藤黄八叠球菌四种常见菌的抑菌效果。3.通过对金银花中绿原酸在体外清除2,22二苯基22苦基肼自由基(DPPH)的能力,及其对Fe3+的还原能力来测定金银花中绿原酸的抗氧化能力。（2） 研究目标：由于绿原酸对许多疾病都具有明显的疗效,日益受到医学及药学界的重视,社会需求巨大,但目前国内绿原酸的相关研究尚非常薄弱,尚无成熟的绿原酸纯品生产工艺。本研究的主要目的是为了建立稳定有效的金银花绿原酸提取纯化物的检测鉴定方法。1. 明确绿原酸的有效提取方法并为其生产和研究提供参考;通过工艺优化寻找更经济高效的绿原酸提取及分离纯化方法;2.3. 通过对几种食品中常见致病菌的绿原酸抑制活性研究,进一步

11、明确绿原酸的抑菌活性；4. 通过对其还原性的研究进一步了解其抗氧化性作用。5. 熟练掌握实验原理及方法，充分了解并记住各种实验仪器的使用。（3） 拟解决关键问题1. 根据实验结论分析常用的三种金银花中绿原酸的提取方法中最高效节约的方法。2. 通过对其抑菌活性的研究完善其抗菌谱。3. 通过分析总结出绿原酸在其他方面的性质及应用。3、拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）(一)实验原理1.金银花(Loncera japonica Thunb)为忍冬科植物的花蕾，它的药用历史悠久，是中医临床用药之一，具有抗菌、抗病毒、保肝利胆等功效。金银花中主要化学成分为

12、绿原酸、异绿原酸、黄酮化合物、芳樟醇、双花醇等，其中主要的抗菌成分为绿原酸和异绿原酸。绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸组成的缩酚酸，异名咖啡鞣酸，是植物在有氧呼吸过程中经莽草酸途径代谢产生的苯丙素类化合物。化学结构为：绿原酸由结构可以看出它是含有羧基和邻二酚羟基的极性有机酸化合物，为酸性。由于分子内含有邻二酚羟基，受热、见光易氧化，因此供试液要在阴凉、避光下保存备用，且高温和长时间加热不利于绿原酸的提取。在碱性条件下，绿原酸易发生水解，植物体内存在的绿原酸往往是混合物而非单一组分。绿原酸物理性质：名称分子式分子量性状熔点溶解度绿原酸C16H18O9345.30半水化合物为针状晶（110变为无水化合物）

13、208水中4%，在热水中溶解度更大，易溶于乙醇、丙酮和甲醇等极性溶剂，难溶于氯仿、苯、乙醚等亲脂性有机溶剂2.紫外分光光度法：准确称取绿原酸标准品5.0mg，用 30% 甲醇溶解 并定容于50ml容量瓶中。取0.05mol/L的 绿原酸标准溶液用紫外分光光度计于200500nm扫描（查询文献得到绿原酸的最大吸收峰为324nm左右）。 然后选取最大吸收波长分别测定不同浓度标准溶液的吸光度值(OD值)，以绿原酸标准品浓度(g/L)为横坐标，以其吸光度值(OD值)为纵坐标绘制标准曲线。将提取得到的绿原酸样品同样用分光光度计测量，根据标准曲线可知样品中绿原酸含量。绿原酸含量=根据标准曲线测得含量/原金

14、银花质量绿原酸提取率=根据标准曲线测得含量/原金银花中 绿原酸总含量3. 抑菌试验与抗氧化性研究国内外研究表明，绿原酸是一种有效新型天然酸性抗氧化剂，具有较强的抗氧化能力，其抗氧化能力远远强于对羟基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、丁香酸、生育酚等绿原酸之所以具有抗氧作用是因为绿原酸含有一定量的 R-OH 基，能形成具有抗氧化作用的氢自由基，可以消除羟基自由基和超氧阴离子等自由基的活性，保护组织免受氧化作用的损伤，还可以有效地抑制脂质过氧化，对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用。因此，可以通过检测绿原酸对自由基的清除情况，来评价绿原酸的抗氧化能力。1.将提取到的绿原酸加入四种菌的培养基，观察一段时间

15、后若出现某种菌大量死亡不再繁殖则可得到绿原酸对该菌有抑制作用。2.在自由基中加入绿原酸后每过一分钟测量其吸光度，直至吸光度稳定为止，吸光度值越大表示绿原酸还原能力越强。（二）实验步骤1.金银花中绿原酸的提取水提法实验：称取6O g干燥并粉碎的金银花粉末3份装在3个烧杯中，分别贴上标签，分别加入100ml蒸馏水，于60恒温水浴锅中加热，第1份30min，第2份50 min，第3份70 min，提取完后，分别过滤，再分别向滤渣加入100 mL蒸馏水在各自提取相同时间，加热完后再过滤将滤渣倒掉，滤液在旋转蒸发仪上浓缩，浓缩液定容至20 mL。再分别抽滤，最后到离心机上4 000转离心10 min，将

16、澄清的溶液放人冰箱待用乙醇提取：称6O g干燥并粉碎的金银花粉末5份装在5锥形瓶中，分别贴上标签，分别加入40，50，60，70，80的乙醇各l00 mL，并且都密封，于60恒温水浴锅中加热30 min，提取完后，分别过滤，再分别向滤渣加入各自浓度的乙醇100 mL，重复上述操作，之后也将滤液浓缩至20 mL，再分别抽滤，最后到离心机上4 000转离心10 min，将澄清的溶液放人冰箱待用超声波加水提取：称取6O g干燥并粉碎的金银花3份分装在3个锥形瓶中，分别贴上标签，加入looml蒸馏水，于超声波发生器中60加热，超声波效率为100，第1份30 min，第2份50 min，第3份70min

17、，提取完后，分别过滤，再向滤渣加入100 mL蒸馏水，重复上述操作，之后也将滤液浓缩至20 mL，再分别抽滤，最后到离心机上4 O00转离心10 min，将澄清的溶液放人冰箱待用 超声波加乙醇提取：称6O g干燥并粉碎的金银花粉末5份分装在5个锥形瓶中，分别贴上标签，分别加入40，50，60，70，80的乙醇各100 mL，并且都密封，于60超声波提取30 min，提取完后，分别过滤，再分别向滤渣加入各自浓度的乙醇100 mL，重复上述操作，之后也将滤液浓缩至20 mL，再分别抽滤，最后到离心机上4 000转离心10 min，将澄清的溶液放人冰箱待用2. 绿原酸含量测定紫外分光光度法 (1)

18、标准曲线的绘制：准确称取绿原酸标准品5.0mg，30%甲醇溶解 并定容于50ml容量瓶中。再准确量取标准溶液0.50、 0.75、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50、3.00ml分别10ml比色管中，用30%甲醇溶液定容。取0.05mol/L的 绿原酸标准溶液用紫外分光光度计于200500nm扫描。 然后选取最大吸收波长分别测定不同浓度标准溶液的吸 光度值(OD值)，以绿原酸标准品浓度(g/L)为横坐标，以 其吸光度值(OD值)为纵坐标绘制标准曲线。 (2) 绿原酸含量的测定 ：将不同提取工艺所得供试品各取1ml用30%的甲醇 溶液定容至1000ml；在324nm处测其吸光度值，

19、以计算其中绿原酸的含量及提取率。绿原酸含量=根据标准曲线测得含量/原金银花质量 绿原酸提取率=根据标准曲线测得含量/原金银花中 绿原酸总含量3.金银花中绿原酸的抑菌活性研究试验菌株：大肠埃希氏菌(EscherichiaColi,G-),枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis,G+),金黄色葡萄球菌(Staphylo2coccusaureus,G+)，藤黄八叠球菌(Microccusluteus(Schroeter)Cohn,G+)培养基：固体肉汤培养基(g/L):蛋白胨10.0,牛肉浸膏5.0,NaCl5.0,琼脂20.0,pH7.2,121灭菌20min;半固体肉汤培养基(g/L):

20、蛋白胨10.0,牛肉浸膏5.0,NaCl5.0,琼脂8.0,pH7.2,121灭菌20min。实验仪器：ORION818型pH计,RE23000旋转蒸发器,SHB2循环水式多用真空泵,AB2042N分析天平,Uvmi2ni21240紫外可见分光光度计。主要试剂：CH3CH2OH、NaCl、FeCl3、K3Fe(CN)6、Na2HPO4、NaH2PO4、绿原酸标准品、2,22二苯基22苦基肼(DPPH)、三乙胺、三氯乙酸(均为分析纯)。实验方法：绿原酸抑菌活性实验生物检测法  抑菌试验方法:无菌操作。取10mL琼脂培养基于直径为9cm的无菌培养皿中,铺匀,待凝固后,放入两个牛

21、津杯。取含有活菌的半固体培养基10mL,加到装有牛津杯的培养皿中,铺匀,待凝固后,拔出牛津杯,在其中一个杯孔中加入药液50L,并设阴性对照和阳性对照,37培养24h观察结果,并测量抑菌环直径。抑菌环直径20mm为极敏,1520mm为高敏,1015mm为中敏,10mm为低敏。4.绿原酸抗氧化性(1)绿原酸清除DPPH活性测定取0.1mL的精制绿原酸样品溶液,加入2.9mL0.05g/L的DPPH乙醇溶液。混匀后在517nm处测定吸光度值,每1min测量一次,直至读数稳定。(2) 绿原酸还原Fe3+能力的测定取2.5mL的不同样品溶液,加入2.5mL的磷酸盐缓冲液(0.2mol/L,pH=6.6)

22、及2.5mL的1%K3Fe(CN)6溶液,于50水浴反应20min后急速冷却,加入2.5mL的10%三氯乙酸溶液,取反应液5mL,加入5mL的H2O和0.1%FeCl3溶液1mL,混合均匀,10min后于700nm处测定其吸光度值,以水为空白,吸光度值越大表示还原能力越强。所得样品保存方法：绿原酸在 pH 3.0 时比 pH 5.6 时更稳定；而同样溶剂条件下，绿原酸于 4 恒温冰箱避光放置时比其 25恒温储藏室自然光放置更稳定，储存30天后，经单因素 Duncan 多重函数绿原酸提取液的 pH 值处于 3.0 时，绿原酸比较稳定，其原因可能是绿原酸为弱酸，在此环境不易分解保持在游离状态. 表明在这种情况下原酸的含量基本不随时间的变化而降低，因此在后续的处理工艺中应尽量将保持在 pH 值处