DNA的生物合成复制DNABiosynthesieplication

1、目录dna的生物合成的生物合成( (复制复制) )dna biosynthesis，replication 第第 七七 章章目录论述题试述dna复制高保真性机制试述dna损伤与修复目录复制复制( (replication)是指遗传物质的传代，以母链是指遗传物质的传代，以母链dna为模板为模板合成子链合成子链dna的过程。的过程。复制复制亲代亲代dna子代子代dna目录复制的基本规律复制的基本规律basic rules of dna replication 第一节第一节目录l 复制的方式复制的方式半保留复制半保留复制(semi-conservative replication)l 复制的高保真性

2、复制的高保真性(high fidelity) l 双向复制双向复制(bidirectional replication)l 半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication) 目录一、半保留复制的实验依据和意义一、半保留复制的实验依据和意义 dna生物合成时，母链生物合成时，母链dna解开为两解开为两股单链，各自作为模板股单链，各自作为模板(template)按碱基配对按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的dna，一股单链从亲代完整地接受过来，另，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子

3、细胞的一股单链则完全从新合成。两个子细胞的dna都和亲代都和亲代dna碱基序列一致。这种复制碱基序列一致。这种复制方式称为方式称为半保留复制半保留复制。半保留复制的概念半保留复制的概念aggtactgccactggtccatgacggtgaccccactggggtgaccaggtactgtccatgactccatgacaggtactgaggtactgccactggtccatgacggtgaccaggtactgccactggtccatgacggtgacc+母链母链dna 复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代dna 目录目录子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几

4、种可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 目录密度梯度实验密度梯度实验 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想。的设想。含重氮含重氮-dna的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果目录按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代dna与亲代与亲代dna a的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的传信息，体现了遗传的保守性保守性。半保留复制的意义半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性

5、，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。目录原核生物复制时，原核生物复制时，dna从从起始点起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为复制叉，称为双向复制双向复制。 二、双向复制二、双向复制复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象目录a. 环状双链环状双链dna及复制起始点及复制起始点b. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉c. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)oritera b c目录真核生物每个染色体有多个起始点，是多真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。复制子

6、的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个一个复制子复制子(replicon) 。复制子是独立完成复。复制子是独立完成复制的功能单位。制的功能单位。 目录53oriorioriori535533553复制子复制子3目录三、复制的半不连续性三、复制的半不连续性3 5 3 5 解链方向解链方向3 5 3 3 5 领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)目录顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为这股链称为领头链领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，

7、不能另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为为随从链随从链。复制中的不连续片段称为。复制中的不连续片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的的半不连续性半不连续性。 目录 dna复制的酶学复制的酶学the enzymology of dna replication第二节第二节目录参与参与dna复制的物质复制的物质 底物底物(substrate): datp, dgtp, dctp, dttp聚合酶聚合

8、酶(polymerase): 依赖依赖dna的的dna聚合酶，简写聚合酶，简写 为为 dna-pol模板模板(template) : 解开成单链的解开成单链的dna母链母链引物引物(primer): 提供提供3 -oh末端使末端使dntp可以依次聚合可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子一、复制的化学反应一、复制的化学反应 (dnmp)n + dntp (dnmp)n+1 + ppi 目录目录聚合反应的特点聚合反应的特点dna 新链生成需新链生成需引物引物和和模板模板； 新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 3 方向进行方向进行 。目录二、二、dna聚合酶聚合酶全称：全称：依赖依

9、赖dna的的dna聚合酶聚合酶 (dna-dependent dna polymerase)简称：简称：dna-pol活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 a g c t t c a g g a t a 3 | | | | | | | | | | |3 t c g a a g t c c t a g c g a c 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的 dna片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 目目 录录目录（一）原核生物的（一

10、）原核生物的dna聚合酶聚合酶dna-pol dna-pol dna-pol 目录（一）原核生物的（一）原核生物的dna聚合酶聚合酶可能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子数分子数/细胞细胞多亚基不对称多亚基不对称二聚体二聚体？单肽链单肽链组成组成250120109分子量分子量(kd)dna-pol iiidna-pol iidna-pol i可能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子数分子数/细胞细胞多亚基不对称多亚基不

11、对称二聚体二聚体？单肽链单肽链组成组成250120109分子量分子量(kd)dna-pol iiidna-pol iidna-pol i目录功能功能：对复制中的错误进行校读，对复制和对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。修复中出现的空隙进行填补。dna-pol （109kd）目录323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸dna聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性n 端端c 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶dna-pol klenow片段是实验室合成片段是实验室合成dna，进行，进行

12、分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 目录dna-pol （120kd） dna-pol ii基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 它参与它参与dna损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。 目录功能功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。 dna-pol (250kd)目录（二）真核生物的（二）真核生物的dnadna聚合酶聚合酶dna-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复

13、制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。在在线粒体线粒体dna复制中起催化作用。复制中起催化作用。dna-pol dna-pol dna-pol dna-pol 目录（二）真核生物的（二）真核生物的dna聚合酶聚合酶填补引物填补引物空隙，切空隙，切除修复，除修复，重组重组延长子延长子链的主链的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性线粒体线粒体dna复复制制低保低保真度真度的复的复制制起始引起始引发，引发，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量

14、（分子量（kd）dna-pol填补引物填补引物空隙，切空隙，切除修复，除修复，重组重组延长子延长子链的主链的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性线粒体线粒体dna复复制制低保低保真度真度的复的复制制起始引起始引发，引发，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kd）dna-pol目录三、复制保真性的酶学依据三、复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：复制保

15、真性的酶学机制：（一）（一）dna-pol的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读 （二）复制的保真性和碱基选择（二）复制的保真性和碱基选择目录（一）（一）dna-pol的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读a：dna-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。其聚合活性掺入正确配对的底物。b：碱基配对正确，：碱基配对正确， dna-pol不表现活性。不表现活性。目录（二）复制的保真性和碱基选择（二）复制的保真性和碱基选择 dna聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷

16、酸二酯键）键的有序形成。与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型反式构型。 目录1. 遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3. 复制出错时复制出错时dna-pol的及时校读功能。的及时校读功能。dna复制的保真性至少要依赖三种机制复制的保真性至少要依赖三种机制 目录四、复制中的分子解链及四、复制中的分子解链及dna 分子分子拓扑学变化拓扑学变化 dna分子的碱

17、基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把dna解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。目录（一）解螺旋酶、引物酶和单链（一）解螺旋酶、引物酶和单链dna结合蛋白结合蛋白理顺理顺dna链链拓扑异构酶拓扑异构酶 (gyra, b)稳定已解开的单链稳定已解开的单链单链单链dna结合蛋白结合蛋白ssb催化催化rna引物生成引物生成引物酶引物酶dnag (dnag)运送和协同运送和协同dnabdnac (dnac)解开解开dna双链双链解螺旋酶解螺旋酶dnab (dnab)辨认起始点辨认起始点dnaa (dnaa)蛋白质（基因）蛋白质（基因）通用名通用名功能功能原核生物复

18、制起始的相关蛋白质原核生物复制起始的相关蛋白质e. coli 基因图基因图目录目录 解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用atp供能，作用于氢键，使供能，作用于氢键，使dna双链双链解开成为两条单链解开成为两条单链 引物酶引物酶(primase)复制起始时催化生成复制起始时催化生成rna引物的酶引物的酶 单链单链dna结合蛋白结合蛋白(single stranded dna binding protein, ssb)在复制中维持模板处于单链状态并保护单在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整链的完整 目录1010 8 8 局部解链后局部解链后（二）（二）dna拓扑异构酶拓扑异构酶(d

19、na topoisomerase) 解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成目录目录拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶分分 类类目录拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断dna双链中双链中一股一股链，使链，使dna解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，闭切口，dna变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需atp。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断dna分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用atp供能，连接断端，供能，连接

20、断端， dna分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。作用机制作用机制 目录目录五、五、dna连接酶连接酶连接连接dna链链3 -oh末端和相邻末端和相邻dna链链5 -p末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的邻的dna链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。 dna连接酶连接酶(dna ligase)作用方式作用方式poo-o-oho5poo-o-o335dna连接酶连接酶atpadp5353目录目录dna连接酶在复制中起最后接合缺口的连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。作用。在在dna修复、重组及剪接中也起缝合缺修复、重组及剪接中也起缝

21、合缺口作用。口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。功能功能目录dna生物合成过程生物合成过程the process of dna replication第三节第三节目录（一）复制的起始（一）复制的起始需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. dna解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2. 合成引物，提供合成引物，提供3 -oh末端。末端。一、原核生物的一、原核生物的dna生物合成生物合成 目录e.coli复制起始点复制起始点 oric gattntttattt gatctnttntatt gatctcttattag 1 13 17 29 32 44 1 1

22、3 17 29 32 44 tgtggatta-ttatacaca-tttggataa-ttatccaca58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 1. dna解链解链目录 dna a dna b、 dna cdna拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶ssb3 5 3 5 2. 引发体和引物引发体和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、dnac蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和dna复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。 目录3 5 3 5

23、 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链rna分子。分子。 引物引物3 ho5引物引物酶酶目录（二）复制的延长（二）复制的延长复制的延长指在复制的延长指在dna-pol催化下，催化下，dntp以以dnmp的方式逐个加入引物或延长中的子链上，的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 目录 5 5 3 35 5datpdgtpdttpdctpdttpdgtpdatpdctpoh 33 3dna-pol领头链的合成领头链的合成目录随从链的合成随从链的合成目录目录目录阶段一阶段一阶段二阶段二目录阶段三阶段三阶段四阶段四复

24、复制制过过程程简简图图目录目录 原核生物基因是环状原核生物基因是环状dna，双向复制的复制，双向复制的复制片段在复制的终止点片段在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。oriter e.coli8232 ori tersv40500（三）复制的终止（三）复制的终止目录5 5 5 rna酶酶ohp5 dna-pol dntp5 5 patp adp+pi5 5 dna连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接目录目录哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期dna合成期合成期g1g2sm二、真核生物的二、真核生物的dna生物合成生物合成 细胞能否分裂，决定于进入细胞能否分裂，决

25、定于进入s期及期及m期这两个关期这两个关键点。键点。g1s及及g2m的调节，与蛋白激酶活的调节，与蛋白激酶活性有关。性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。实施调控作用。 目录 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制。复制有时序性复制有时序性，即复制子以分组方式激活，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。而不是同步起动。 复制的起始需要复制的起始需要dna-pol（引物酶活性）和（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑

26、酶和复制因子(replication factor, rf)。 增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, pcna)在复制起始和延长中起关键作用。在复制起始和延长中起关键作用。 （一）复制的起始（一）复制的起始目录3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代dna随从链随从链引物引物核小体核小体（二）复制的延长（二）复制的延长目录 染色体染色体dna呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。 染色体两端染色体两端dna子链上最后复制的子链上

27、最后复制的rna引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。（三）复制的终止（三）复制的终止5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 目录目录切除引物的两种机制切除引物的两种机制目录目录 端粒端粒(telomere)指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性dna分子末端的结构。分子末端的结构。功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持dna复制的完整性复制的完整性结构特点结构特点 由末端单链由末端单链dna序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。 末端末端dna序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含g、c碱基碱基的短的短 序列。序列。ttttggggttttgg

28、gg目录端粒酶端粒酶(telomerase) 端粒酶端粒酶rna (human telomerase rna, htr) 端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, htp1) 端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, htrt) 组成组成端粒酶的催端粒酶的催化延长作用化延长作用爬爬行行模模型型目录dnadna聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步加工目录目录逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式reverse transcription and othe

29、r dna replication ways第四节第四节目录逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase) 逆转录逆转录(reverse transcription) 逆转录逆转录酶酶一、逆转录病毒和逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶 目录逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象rna 模板模板逆转录酶逆转录酶dna-rna 杂杂化双链化双链rna酶酶单链单链dna逆转录酶逆转录酶双链双链dna目录逆转录酶逆转录酶 a aa a t t t taaaasisi核酸酶核酸酶 dna聚合酶聚合酶碱水解碱水解 t t t t分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转

30、录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cdna法。法。 以以mrna为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mrna碱基序列互碱基序列互补的补的dna链。链。 试管内合成试管内合成cdnacdna complementary dna 目录二、逆转录研究的意义二、逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，rna同样同样兼有遗传信息传代与表达功能。兼有遗传信息传代与表达功能。

31、对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意世纪初已注意到的病毒致癌理论。到的病毒致癌理论。 目录 滚环复制滚环复制(rolling circle replication)三、滚环复制和三、滚环复制和d环复制环复制 是某些低等生物的复制形式，如是某些低等生物的复制形式，如 x174和和m13噬菌体等。噬菌体等。3 -oh5 -p5 5 5 3 3 3 3 5滚环复制滚环复制5 5 3 3 5 目录目录dntpdna-pol d环复制环复制(d-loop replication) 是线粒体是线粒体dna (mitochondrial dna，mtdna)的复制形式。的复制

32、形式。 目录dna损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复dna damage (mutation) and repair第五节第五节目录遗传物质的结构改变而引起的遗传信息遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为改变，均可称为突变。突变。在复制过程中发生的在复制过程中发生的dna突变称为突变称为dna损伤损伤(dna damage)。从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是dna分子上分子上碱基的改变。碱基的改变。 目录一、突变的意义一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（三）

33、突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础（四）突变是某些疾病的发病基础 目录二、引发突变的因素二、引发突变的因素物理因素物理因素 紫外线紫外线(ultra violet, uv)、各种辐射、各种辐射 uv化学因素化学因素常见的化学诱变剂常见的化学诱变剂化合物类别化合物类别作作 用用 点点分子改变分子改变碱基类似物碱基类似物如：如：5-bua 5-bu g- a - t - g - c -羟胺类（羟胺类（nh2oh）t c- t - a - c - g -亚硝酸盐（亚硝酸盐（no2）c u- g - c - a - t -烷化剂烷化剂如：氮芥类，如：氮芥类，nitrominsg mgg mgd

34、na缺失缺失g目录目录三、突变的分子改变类型三、突变的分子改变类型错配错配 (mismatch)缺失缺失 (deletion)插入插入 (insertion)重排重排 (rearrangement)框移框移(frame-shift) 目录dna分子上的碱基错配称分子上的碱基错配称点突变点突变(point mutation)。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1. 转换转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。或嘧啶变嘌呤。 2. 颠换颠换（一）错配（一）错配目录镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人hb (hbs) 亚基亚基n-val his leu thr pro val glu c 肽链肽链cac gtg基因基因正常成人正常成人hb (hba)亚基亚基n-val his leu thr pro glu glu c 肽链肽链ctc gag基因基因目录（二）缺失（二）缺失、插入插入和框移和框移缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从dna大分子上大分子上消失。消失。插入：插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到到dna大