重组质粒的构建

1、重组质粒的构建实验流程质粒构建基因提取1、2、3 PCR反应扩增目的基因4、3 DNA片段回收5、3 重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切8、5测序重组质粒提取2、 3菌种保藏7目的片段与载体连接及转化6 实验操作一、 LB培养基配置LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。【试剂】胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、琼脂（Agar） 【实验步骤】 1、 LB固体培养基配方（配置100ml培养基）胰蛋白

2、胨（Tryptone） 1g 酵母提取物（Yeast Extract） 0.5g NaCl 1g 琼脂（Agar） 1.5g 单蒸水 100ml蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药品，瓶盖也不要盖错。2、 液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。3、包扎用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。4、 灭菌将上述培养基以1.05kg/cm2、 121.3、20min高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4冰箱内暂存。灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4保存

3、。5、 LB固体培养基倒板 配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。 抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55的水浴中，待培养基温度降至55时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。 倒板：一般10ml倒1个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照1015min。 保存:将培养皿倒置放于4保存，一个月内使用。二、质粒的提取（protocol）1、大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至5ml的含有抗生素的LB液体培养基中，37过夜培养。【注：培养液不宜过量，过量时会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。】2、5m

4、l菌液倒入5ml离心管中，10,000xg，1min离心，弃上清。（实验室用的离心机转速达不到，故将其调到最大转速12,000rmp，离心2min）【注：rmp（转速）与rcf= ×g（相对离心力）,RPM只是一个习惯用法，g才是衡量转速的通用标准：不同的转子，RPM是不能通用的，g值则是通用的，也就是说，只要你在不同的离心机上用相同的g，他们的离心效果原则上是一样。】3、加入250ul Solution（使用前加入RNase A1，冰箱4冷藏），充分悬浮细菌沉淀。【注：注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器Vortex等剧烈震荡使菌体充分悬浮。】4、加入250ul Solution【

5、裂解细胞】（提前放入37孵育箱内预热）轻轻地上下翻转混合56次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。【注：此步骤不宜超过5min】5、加入350ul Solution【变性蛋白】，轻轻上下翻转混合56次，直至形成紧实凝集块。6、将上面液体倒入1.5ml的EP管中，13,000xg，10min离心。7、将上述离心得到的液体倒入柱内，10,000xg，1min离心，弃液体。8、加入500ul bufferHB，10,000xg，1min离心，弃液体。9、加入700ul DNA wash buffer（提前加入指定体积的100%乙醇），10,000xg，1min离心，弃液体。（重复一次）10、空离，13,

6、000xg，2min离心。11、将离心柱放入1.5mlEP管内，置于孵育箱内3min烘干。12、加入60ul ddH2O（提前在60水浴箱内预热），60摇2min。13、13,000xg，1min离心，得液体。14、测浓度。15、DNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。【注：提好的质粒需标明时间、名称等，-20保存。】三、琼脂糖凝胶电泳【试剂】琼脂糖（Agarose），1xTAE电泳缓冲液，染料（SyBR Safe DNA Gel Stain）,DL2000 DNA Marker, 10xLoading Buffer【实验步骤】1、配置50ml（大样）、25ml（小样），1.5%的琼脂糖凝胶。

7、 称取50x1.5%=0.75g琼脂糖粉末于锥形瓶中，加入50ml 1xTAE缓冲液，染料2ul（边加染料边倒TAE缓冲液于装有琼脂糖的锥形瓶中），封口。2、放在微波炉中加热，沸腾2次，直到看不到油滴，形成均一的溶液。（一般中低档，5min）3、插入梳子，倒入制胶槽中。4、放在抽屉里室温、避光静置20min。5、按下表加样。 适用于检测DNA（小孔）：Marker（DL2000） 样品3ul质粒（DNA） 10xLoadingBuffer 1xTAE3ul 1ul 6ul 适合回收DNA(大孔)Marker（DL2000） 样品6ul质粒（DNA） 10xLoadingBuffer 20ul

8、2.2ul 6、120V，电泳25min左右。7、检测：将凝胶板放入检测仪中检测。新建选染料（SyBR safe）选颜色（SyBR Green）勾除高亮选项检测文本注释(字体14，颜色白色)保存（酶切后的质粒会出现两条色带，上面的一条是载体较暗，下面的一条是目的质粒较亮，根据Marker显示，证明是否是所需质粒）【注】1、当加入浓度的样品量小于5ul时，10xLoadingBuffer均加1ul。2、电泳的加样空宽度小于6mm时，每次取5ul制品电泳便可得到清晰条带，如果加样空增宽，需适当增加Marker制品的加样量。3、对DNA电泳而言，琼脂糖的纯度对DNA条带的清晰度影响很大。4、进行琼脂

9、糖凝胶电泳时，琼脂糖的浓度与DNA片段的分离性能关系密切。琼脂糖的浓度越大，对短片段的分离性能越好，反之，琼脂糖浓度越小，越有利于长片段DNA的分离。5、当电泳后片段需回收时，选用大孔胶，当电泳只起检测作用时，选用小孔胶。6、若电泳产物需要回收，则需换新的缓冲液。7、 实验室有两种常用的Marker分别为DL2000 DNA Marker和-EcoT14 digest DNA Marker。琼脂糖电泳图像示意图如下：四、PCR【试剂】灭菌水、10xbuffer、混合的寡核苷酸（dNTPS）、引物（上、下）Taq DNA聚合酶、模板DNA（质粒）【操作步骤】加样前应先打开PCR仪预热。1、在0.

10、5mlPCR管中加入依次下列试剂： 25ul体系（EGFP扩增）：灭菌水： 9.5ul LA混合物： 12.5 上引物： 1ul下引物： 1ul模板DNA（PCDHA）： 1ul总体积： 25.0ul2、将上述PCR反应混合物放入PCR仪中。3、设定程序进行扩增：94变性5min后，开始以下循环94变性-30s55退火（退火温度不固定，根据引物进行调整）-1min72延伸-30s（延伸时间根据目的片段的长度进行调整）共30个循环最后循环结束后72反应7min，4冷却。4、PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。【注】1、当PCR反应后的产物目的片段还需要进行后续操作时，选用LA Taq酶；

11、当PCR反应用于检测时选用EX Taq酶。2、buffer的选择应与酶的选择相对应，例如：LA Taq酶对应的buffer为10xLA PCR Buffer。3、在PCR小管中加样时，应先将各试剂加到管壁上，最后混匀。这样既节省时间，又节省枪头。五、PCR产物的回收纯化1、将PCR产物稍微离心片刻。2、将PCR扩增产物转移至1.5ml EP管中，然后加入4-5倍体积的Buffer CP,若PCR产物<200bp则加入6倍体积的Buffer CP。3、充分振荡混合。4、然后转移至DNA离心柱中，10,000xg离心1min，倒回重复一次，弃液体。5、加入700ul的DNA Wash Buf

12、fer，10,000xg离心1min ，弃液体。6、空离，13,000xg，2min离心。7、将离心柱放入1.5mlEP管内，吹风吹干。8、加入15-30ul ddH2O（提前在60水浴箱内预热），60摇2min。9、13,000xg，1min离心，得液体。六、与T载体连接10ul体系2xRapid Ligation Buffer，T4 DNA Ligase 5ulPGEM-T Easy Vector（50ng） 1ulPCR product（150ng） 150/C ulT4 DNA Ligase 1ulWater 3-150/C ul总体系 10ul放入4冰箱内过夜。七、DNA片段的回收纯

13、化【实验步骤】1、实验前将水浴锅调到55-60，将灭菌水60水浴锅内预热。2、使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。3、在紫外灯下切出还有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA的回收率。（注：切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防DNA损伤，先切后验证。）4、切碎胶块。5、向胶块中加入胶块融化液Binding buffer 500ul。6、均匀混合后55-60加热融化胶块7min，此时应间断振荡混合。（注：胶块一定要充分融化，否则将会影响DNA的回收率。）7、将上述胶块

14、融化液倒入柱子内，10,000xg 1min离心，倒回，重复一次。8、加入300ul Binding buffer，10,000xg 1min离心，弃滤液。9、加入700ul DNA wash buffer，10,000xg 1min离心，弃滤液。10、空离，13,000xg，2min离心。11、将离心柱放入1.5mlEP管内，吹风吹干。12、加入30ul ddH2O（提前在60水浴箱内预热），60摇2min。13、13,000xg，1min离心，得液体。八、目的片段与载体的连接及转化【试剂】PMD-18载体、目的片段、Solution、感受态细胞、LB液体培养基（加氨苄青霉素抗体AMP）、含

15、AMP的LB固体培养基【实验步骤】1、连接、实验前水浴准备。、在PCR管中加入： PMD-18载体 1ul 目的片段 4ul 总体积 5ul、再加入5ul的Solution、16，连接90min2、转化、全量10ul加入至感受态细胞中，冰上放置40min。、42水浴锅内热激90s（让质粒进入感受态细胞）。、取出冰上放置5min（让感受态细胞关闭）。、加入200ulLB液体培养基（无抗体AMP），37摇床培养1h。3、涂板将上述培养液涂布在含AMP的LB固体培养基上，过夜培养。（3ml培养基中加入3ulAMP）4、挑菌第二天晚上五点左右挑菌，在5ml LB液体培养基（加5ul AMP）中摇床培养，37过夜。（5ml LB培养菌+5ulAMP+用枪头挑菌，枪头可打入培养瓶中）5、第二天提取质粒。或6、保藏、实验前超净台灭菌。、将500ul50%的甘油与500ul菌液混合，-80保存。九、双酶切反应【试剂】Buffer2.1、限制酶（EcoR）、限制酶（BstB）、重组质粒（plasmind）、灭菌水【实验步骤】1、实验前水浴准备。2、在0.5ml的PCR管中加入下列试剂：体系： 灭菌水： 20ul-V其他 Buffer2.1： 2ul BSA： 0.2ul 质粒： 1ug/C EcoR： 0.5ulBstB： 0.5