香菇原生质体外文翻译

1、 本科毕业论文外文翻译 题 目拥有再生能力和交配型稳定性的香菇原生质体的高收益制备姓 名学 号专 业植物保护指导教师职 称副教授中国·武汉二一四年四月 分类号 密级本科毕业论文外文翻译 拥有再生能力和交配型稳定性的香菇原生质体的高收益制备High Yield Preparation of Lentinus edodes ("Shiitake")Protoplasts with Regeneration Capacityand Mating Type Stability 学生姓名：学生学号：学生专业：植物保护指导教师： 植物科学技术学院 二一四年四月华中农业大学本科

2、毕业论文外文翻译拥有再生能力和交配型稳定性的香菇原生质体的高收益制备原文来源：Kawasumi T, Kiuchi N, Futatsugi Y, et al. High yield preparation of Lentinus edodes (" Shiitake") protoplasts with regeneration capacity and mating type stabilityJ. Agricultural and biological chemistry, 1987, 51(6): 1649-1656.摘要：香菇原生质体的释放和再生的一种有效的方法被

3、开发，利用纤维素酶和几丁质酶的酶混合物，pH值4.6。小的均匀菌丝体原生质体材料被迅速培养在用菌丝片段接种后的木质部的液体培养基中。他超过6×107 原生质体/ml/4hr的制备和超过15%的再生被实现。通过原生质体来源的单核菌株的交配形成了双核体可能发展成为完整的子实体在小规模木屑栽培（30克介质）中5060天。原生质体或聚乙二醇融合处理后，交配型得到了充分完好的保存。在包括原生厦体融台和核酸注入的诸多基础科学和应用科学研究中，原生质体应用龅潜力正在不断得到发掘，在包括多种食用菌的担子萤研究领域也有这样的势头。香菇是日本最重要的食用菌，占商品食用菌的60%以上，寻找一种制备供育种用

4、的香菇原生质体的好方法是人们强烈的愿望。然而目前只有很少几篇涉及香菇原生质体的文章发表，并且在这几篇文章中，香菇原生质体的产量和再生率与裂褶菌、鬼伞、平菇相比非常低。因此，与其它菌尧衽比，例如荻益鬼伞的不能自然结台的种内子实体形成和在遗传上不亲合的菌落的形成，平菇种内子实休和种间菌落的形成，以及在裂褶苗原生质体中整个注几脱氧核糖核酸(DNA)的成功等，原生质体融合技术在香菇这种重要食用菌育种上的应用就相对进展缓慢。本文叙述了一种有效的原生质体形成和再生方法，这种方法制备的原生质体足够用于原生质体融合实验，并对经过原生质体化或聚乙二醇(PEG)处理的原生质体再生菌落的交配型稳定性进行了精确捻查，

5、面且进行了短期内的快速出菇试验。材料和方法菌株：单核菌株是单孢分离的Mofi讼司的Co.440和252号菌株双核菌株由Meljlserka公司赠送，菌株在1.5%琼脂的斜面上保存，斜面培养基在每公斤中含麦芽汁10克，酵母汁4克，葡萄糖4克（MYG培养基）。试剂：Sanpearl CP，BSD、LS和本质素： 为Sara-okokusaku果酱公司和Tokyo kase公司生产，纤维索酶yc：东京Selhn制药公司生产jN一乙酰胞壁酶SG，东京Seikagaku kogyo公司生产，麦芽汁、酵母汁：美国Difco公司生产琼脂：日本东京kyokuto公司生产。原生质体的制备：收集液体培养的菌丝于培

6、养皿内，使用剃刀（ atherAnzenkamisorl公司生产）蒋其轻轻挤切成微小菌丝片段，然后用孔径为129微米的尼龙网过滤，将微小菌丝片段收集，接种到l0ml含有0.4%Sanpeatl Cp和0.005木质紊的MYG培养液中（100ml三角瓶容器内）。在25、相对湿度70%、l2小时昼夜变化节律条件下，静止培养4天，幼龄菌丝用含0.6M甘露醇的0.05M丁二酸缓冲液洗涤，轻轻挤出水分， 以每毫升混合酶液含1 00-120毫克菌丝的比倒与2一3%纤维素酶Onozaka RS和0.1%(4 0Um!、Sigma)几丁质酶组成的混合酶液混台，30下在20mI带塞小瓶中进行酶解反应。混合酶液在

7、含0.6M 甘露醇的0.05M丁二酸缓冲液中配制，PH4.6。原生质体的再生菌落的形成： 运用上述方法制各的原生质体用孔径为60微米的尼龙网过滤，血球计数板计数， 用再生培养液梯度稀释到l0 -4。再生培养液为MYG 中加入0.4%Sanpearl cP和0.6M蔗糖， 即MYGCPs培养基。取200微升梯度稀释的原生质体悬液涂到1.2%琼脂的MYGcPs再生培养皿上（直径6.0厘米）。在25、相对湿度70% 、12小时昼夜节律条件下培养。14天以后以培养皿中菌落的数量来计算再生率， 出现在不含渗透压稳定剂的培养皿上的，不是从原生质体再生出来的菌落数量作为对照从中扣除。交配型的检验：每一个单核

8、菌丝的交配型通过在琼脂培养基平板上双配对培养(Confronfing Culture)确定， 由A B亲合配对形成的双核菌丝的锁状联合和由AB=配对形成的假锁状联合通过显微镜检查确定，由AB=配对， 将两个单核菌丝的微量尖端菌丝混合接种到液体培养基内培养以进一步确证其假锁状联合是否存在。融合处理： 聚乙二醇(PEG)诱导原生质体融合的方法同前所述，30%PEG4000溶于0.01M氯亿钙的0.05M马来酸钠缓冲液中，PH5.5。子实体的形成：小规模术屑栽培方法基本上同前所述。Saapearl cp以0.4%的量添加到培养料内，经过30-40培养，用80毫升无菌水倾注到烧杯中，保持16.5过夜，

9、 然后将水倾析出来， 然后培养仍保持在16.5条件下。结果单核菌株的分离从香菇Mori 440和252分离列50多个单核菌株。根据双配对测验时其锁状联合的有无，这些分离的单核菌株的交配型可划分为四群。其中Mfri 440担孢予四种交配型的比率测定为18：9：l3：12，这与预计的理论值l： 1：1；1相比，其偏差并不特别显著。而有些品系如Meiiil303-waSe，其担孢子只可获得一个交配型的菌落。本研究选用Mofi 440担孢子的初步确定为A1B1(NO.3)，A1B2(NO.25)，A2B1(NO.17)和A2B2(NO .47)四种交配型的单核菌株做进一步的实验。因在AB=配对反应中只

10、有极少数锁状联合出现，故而A因子或B因子相同的交配反应有待将来使用适当的标准菌株进一步精确测定其交配型。原生质体的释放材料的培养：快速生长、均匀一致的幼龄茵丝看来是制备原生质体的最合适材料。因为香菇菌丝一般生长不快，固而我们在菌丝接种方法和培养基方面进行了卓有成效的改进，即液体培养菌丝、剃刀切碎进而经过尼龙网过滤菌丝的接种方法。在平菇中，亚硫酸盐娄纸浆废液组分证明能够刺激菌丝生长进而改善了原生质体的产量和再生率。为了促进生长，本实验对亚硫酸盐类纸浆废液组分作为香菇培养基的一类掭加剂进行了检验，期望获得与在平菇中相似的促进效果。结果表明：三种亚硫酸盐娄纸浆废液组分(LS、LSD、Sanpearl

11、 CP)和木质索， 以Sanpearl cP作为添加剂时改善香菇菌丝生长的效果最佳。然而如表1所示，对于原生质体释放。Sanpearl cP单独添加效果并不十分显著，而木质素的效果最好。实验还发现，菌丝由于一些不定物质在表面上的附着而变黑。因而必须洗涤除去这些物质， 在用其它亚硫酸盐纸浆废液组分作为添加剂时，也同样可见少量褐色物质在菌丝表面的附着，而Sanpea rlcP为最少。因此0.4% sanpearl cP和0.005% 木质素混合添加到MYG培养基中是比较理想的。在改进的菌丝切割接种方法和添加特殊物质封培养基中的条件下， 稳定而足够量的香菇菌丝在培养3-4天时就可以很容易地得到：50

12、-75毫克10毫升培养基100毫升三角瓶。对于原生质体产生最佳时期为34天菌龄（见表l， 实验2）.酶：对于多种酶的组台在不同浓度和pH值的情况下进行了检查。测试过的酶有：纤维素酶OnOzuka RS和R一10， 纤维素酶Yc，MelcelaSe P l，崩溃酶(DrlselaSe)，Novozyme 234、Zymolyase100，000，几丁质酶、 一葡萄糖昔醛酸酶、 一乙酰舱壁酶、半纤维素酶、蜗牛酶、果胶酶Y一20和崩解酶MaeerozymeR- 10。在用上述酶做的组合中，以0.1% 几丁质酶(Sigma，4Um1)和23 %纤维素酶Onozuka RS的组合效果最好。酶反应混合液中

13、的渗透压稳定剂：在几种测试的渗透压稳定剂中，对于香菇原生质体的释放，甘露醇和硫酸镁是优秀的，并且0.6M是理想的浓度。酶液pH值：在0.05M丁二酸缓冲液中， 纤维素酶Onoza RS和几丁质酶的最适酶解反应pH值在4.6左右。远低于其它担子菌原生质体制备时常常使用的pH值：5.55.8。酶解反应的其它条件与前文报导基本一致。原生质体的再生菌龄：有一个趋势：菌龄越短，再生率越高。在“材料和方法”中叙述的培养条件下，4日龄菌丝或以前，都有较高的再生率，5日龄菌丝以后，其原生质体再生率明显下降。酶解时间：再生频率随着酶解时间而变化。当酶解时间短时，原生质体产量低，由于随着酶解对间的延长，原生质体释

14、放率的增加大于再生率的降低，尽管长时间的酶解处理不利于融合实验，但在酶解六小时仍有足够量的活性原生质体，因而一般姆酶解时间控制在34小时。渗透压稳定 ： 蔗糖是香菇原生质体再生最好的渗透压稳定剂，这与灰盖鬼伞、糙皮侧耳中的结果一致；肌醇、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、硫酸镁和氯化钠效果渐差。PH值：pH4.5左右给出最高和最稳定的再生频率，与灰盖鬼伞和糙皮侧耳相比，香菇原生质体再生时对pH值更为敏感、要求更为严格。添加物： 在测试过的各种添加物中，亚硫酸盐类纸浆废液组分能显著提高香菇原生质体再生率。SanpearlCP对于香菇菌丝生长和原生质体的再生，效果都是最好的。而在糙皮侧耳中，LSD最有效，而

15、且两种添加剂的联合使用效果更好， 在香菇中没有发现这种“联合效应”。因此可见，亚硫酸盐类纸浆废液组分对香菇茵丝生长和原生质体再生的刺激效果没有对糙度侧耳显著。子实体的形成双核菌丝由再生的亲合单核菌丝两两配对培养获得，这种双核菌丝在小规模木屑栽培时能形成子实体：原基优先在烧杯边缘或底部形成，当栽培块转移到一个犬容器并给予适当的温、湿度时，这种原基能够发育成完整的子实体。用这种栽培方法实现各个双核菌株形戚子实体能力不一样。商品菌株Mciii1303-waSe在大约40天形成子实体，而Mori 440和252的再生单核菌丝经双配对培养形成的双核菌株需用50一60天才能形成子实体；同时有些双核菌株没有

16、看到出菇迹象 这种实验室培育的子实体能够 产生足够量有萌发和交配能力的担孢子（子实体照片略）。原生质体化以及融合处理后交配型的保存为了检查经过原生质体化过程以后交配型的稳定性，NO.25 C AIB2菌株的180个单核菌丝再生菌落被挑拣出来， 并与NO.17(A2B1)、NO.23(A1B1)或NO.47(A!B2)进行两两配对培养， 结果可见， 所有的180个单核菌落(NO.25)只能在与NO.17配对时才形成锁状联合，而从原生质体再生的四种单核菌株(各50个菌落)在与初定的亲合菌株配对培养时，100个配合全都产生双核菌丝。这些结果表明：用本实验方法制备的原生质休具有细胞壁再生能力，并保持了

17、其交配型的稳定性。经过PEG原生质体融合处理，交配型也令人满意地保持了其原来特性。结果可见： 亲合菌株间原生质体融合处理后， 其双核菌丝在再生菌落中的出现频率（实验1和7）远远大于单核菌丝本身（实验3，4、9和10）或亲合菌株混合培养的原生质体（实验2和8）再生菌落中的锁状联合出现频率。因此， 以再生菌落为指标的融合频率（即双核菌丝在原生质体融合处理后的再生子中的频率）可由下式推出：对于实验1-6: 100×（40170×6/41）/170=8.9%对于实验712：100×（20一156×4/68）156=6.9%这个融合频率高于用同样方法测定的灰盖鬼伞

18、营养缺陷型的融合子的形成频率（ 即融合频率）。在四种交配型的单核菌丝的各自180-200个经过原生质体融合处理的再生菌中，只有一个准状联合（kidaryon）被检测到，这个例外可能是由于融合处理引起交配型突变从而形成同宗双核菌丝的结果，这有待进一 步研究。本实验初步表明：经过融合处理，交配型的保存概率很高，对TNO.23菌株，保存率为99.5，对于NO.17、NO.25和NO.47菌株，保存概率高达100。讨 论目前在日本，传统的香菇育种手段例如筛选和杂交还必须得到广泛深入的应用，而原生质体的应用看来将成为另一种实用的香菇育种方法。这不仅是因为经过原生质体融合可以使种间杂交和使不产子实体的亲合配对变为产生子实体的配对，而且能够克服种内的不亲合性障碍（据报导已经通过原生质体融合使不亲合配对菌株形成菌落）； 而且还因为，一些据报道表明不经过融合、单单经过原生质体化过程就能产生不同类型的胞质变异菌株。影响原生质体产量的因子之一是在短期内获得足够量均匀一致的幼龄菌丝。在灰盖鬼伞和平菇中使用尼龙网收集粉孢子和菌丝小片断接种的方法非常实用和有效，而在香菇中单用尼龙网效果欠佳。本实验先用剃刀片将菌丝切碎，然后用尼龙网收集的方法不仅对香菇，而且对其他难以在液体培养基内稳定、快速生长而又不产孢子的担子菌类都很有效、有意义。其它各种测试如使用搅拌器、匀浆器或玻璃球都不够理想。培养