第1章核酸化学

1、第一章 核酸的结构与功能本章内容第一节 核酸概述第二节 核苷酸第三节 核酸的分子结构第四节 核酸的性质及分离提取第五节 核酸与蛋白质的复合体第一节第一节 核酸概述核酸概述一、核酸是大分子二、核酸的基本元素组成三、核酸的种类四、分布核核 酸酸(nucleic acid) 是以核苷酸为基本组成单位的生物大是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。分子，携带和传递遗传信息。一、核酸是大分子分子量： rna 几万几百万dna 1.61062.2109功能：核酸是活细胞中最关键组分；它携带着遗传信息，是遗传的物质基础；它决定蛋白质和酶的结构。因此，它决定每一种生物体的代谢类型及形态。dn

2、a双螺旋图dna俯视图二、核酸的基本元素组成二、核酸的基本元素组成 c、h、o、n、p（9%10%） 可以测定磷含量推算核酸含量三、核酸的种类三、核酸的种类核酸脱氧核糖核酸核糖核酸转运核糖核酸 trna信使核糖核酸 mrna核糖体核糖核酸 rrna遗传信息的载体遗传信息的载体(dna )(rna )遗传信息传递或遗传信息的载体遗传信息传递或遗传信息的载体 mrna 半寿期最短，占总rna5%-10% 功能：是蛋白质合成的模板。 trna 分子量最小，占总rna10%-15% 功能：翻译中携带活化的氨基酸。 rrna 含量最多，占总rna75%-80% 功能：是蛋白质合成的场所。特 点四、分布四

3、、分布 真核生物 原核生物细胞质（90%）核仁（少量）dna细胞核（98%）细胞质（少量）线粒体（少量）叶绿体（少量）等细胞质（类核部分）质粒dna病毒dnarna细胞质病毒rna第二节 核酸的化学组成一、核酸的化学组成二、核苷、核苷酸的形成三、核苷酸的种类 四、核苷酸的功能一、核酸的化学组成 核酸可在核酸酶（或酸、碱）作用下降解为核苷酸。核酸核苷酸核苷磷酸戊糖碱基戊糖-d-核糖 -d-脱氧核糖 -d-2-o-甲基核糖稀 有 碱 基碱基和核糖（或脱氧核糖）通过碱基和核糖（或脱氧核糖）通过糖苷糖苷键键连接形成连接形成核苷核苷(nucleoside) （或脱氧核（或脱氧核苷）。苷）。二、核苷、核苷

4、酸的形成（一）核苷的形成 二、核苷、核苷酸的形成（一）核苷的形成 +戊糖上半缩醛-oh嘌呤n9-h嘧啶n1-h核苷脱水（二）稀有核苷的形成（1）碱基稀有（2）核糖稀有（3）连接方式稀有（三）核苷酸的形成 核苷（脱氧核苷）和磷酸以酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。自然界中存在的5-核苷酸。三、核苷酸的种类 核苷一磷酸 核糖核苷一磷酸 amp、gmp、cmp、ump脱氧核苷一磷酸 damp、dgmp、dcmp、dtmp 核苷二磷酸 核糖核苷二磷酸 adp、gdp、cdp、udp脱氧核苷二磷酸 dadp、dgdp、dcdp、dtdp 核苷三磷酸 核糖核苷三磷酸 atp、gtp、ctp、utp脱氧核苷

5、三磷酸 datp、dgtp、dctp、dttpl核苷酸核苷酸 nmp，ndp，ntpnnnn9nh2oohohhhhch2h12opo- -oopoo- -opo- - -oo一磷酸腺苷（amp）二磷酸腺苷（adp）三磷酸腺苷（atp） 环式核苷酸 camp cgmp ap四、核苷酸的功能 作为核酸的单体 细胞中的携能物质（如atp、gtp） 酶的辅助因子的结构成分（如nad、fmn、fad） 细胞通讯的媒介（如camp、cgmp）第三节第三节 核酸的分子结构核酸的分子结构一、核酸的一级结构 二、dna 的空间结构和功能三、rna 的结构和功能一、核酸的一级结构一、核酸的一级结构定义定义核酸中

6、核苷酸的排列顺序。核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为以也称为碱基序列碱基序列。5 端端3 端端核苷酸之间以核苷酸之间以3 , 5 -磷酸二酯键磷酸二酯键连接形成多核连接形成多核苷酸链，即核酸。苷酸链，即核酸。cga 一个核苷酸3oh 与另一个核苷酸5h3po4 脱水形成3，5 磷酸二酯键。 核苷酸通过3，5 磷酸二酯键相连形成的大分子称为核苷酸链。书写方法书写方法ppapcpcptpgohcptpapa53papcptpgpcptpapapc-oh 35 actgctaac35 dna 与与rna的区别的区别核酸核酸碱基碱基

7、戊糖戊糖dnaa、g、c、t脱氧脱氧核糖核糖rnaa、g、c、u核糖核糖二、dna 的空间结构与功能（一）dna的二级结构（二）dna 的三级结构 一、一、 dna的二级结构的二级结构双螺旋结构双螺旋结构 它必须能够携带遗传信息 能够自我复制传递遗传信息 能够让遗传信息得到表达以控制细胞活动 并且能够突变并保留突变。 这4点，缺一不可，如何建构一个dna分子模型解释这一切？dna应该有什么样的结构，才能担当遗传的重任？ dna双螺旋结构模型的主要依据 chargaff 规则 at gc；a/tg/c=1 碱基的理化性质分析 at gc 配对较为合理 dna的x衍射分析 dna分子为线性双螺旋结

8、构 dna的碱基组成chargaff规则（1）同一生物体中，dna 分子中碱基组成at gc；a/tg/c=1，所以a+g=t+c（包括m5 c） ，即：嘌呤碱总和=嘧啶碱总和。（2）有种的特异性，同种生物（各组织、器官）dna 碱基组成相同，异种生物dna碱基组成差异很大，可用不对称比率a+t/g+c 的相近程度表示种间亲缘关系的远近。（3）dna 碱基组成不受年龄，营养状况及环境的影响。（对维持物种的稳定性起很重要的作用）。已知的核酸化学数据已知的核酸化学数据威尔金斯威尔金斯（maurice wilkinsmaurice wilkins）罗莎琳德罗莎琳德富兰克林富兰克林(rosalind(

9、rosalind franklin)franklin) 沃森（james dewey watson，1928-） 克里克（francis harry compton crick，19162004）n dna双螺旋结构的发现n1951年 watson 23岁n丹麦的哥本哈根 wilkins教授 n英国剑桥大学cavendish实验室 ncrick， 31岁 n女科学家franklinn伦敦大学kings实验室ndna应该是双螺旋 na与t、 c与g巧妙连接 n符合x衍射数据 dna的复制n1953年2月28日，waterson 和crick用金属线又制出了新的dna模型，他们为自然科学树立了一座

10、闪闪发光的里程碑。剑桥的卡文迪什（cavendish）实验室，在这里，沃森和克里克发现了dna结构。 dna的结构，发表于自然171卷(1953)737-738页)上的插图 the eagle pub（老鹰酒吧） 在这里第一次宣布了他们的发现 （二）（二） dna双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点 1. 两条链两条链反向平行反向平行，围绕同，围绕同一中心轴构成一中心轴构成右手双螺右手双螺旋旋 (double helix)。螺旋。螺旋直径直径2nm，表面有，表面有大沟大沟和小沟和小沟。2. 磷酸磷酸-脱氧核糖骨架位于脱氧核糖骨架位于螺旋螺旋外侧外侧，碱基垂直于，碱基垂直于螺旋轴而伸入螺旋轴而伸

11、入内侧内侧。每。每圈螺旋含圈螺旋含10个碱基对个碱基对 (bp)，螺距为螺距为3.4nm。3. 碱基平面与纵轴碱基平面与纵轴垂直垂直，糖环平面与纵轴，糖环平面与纵轴平行平行4. 两条链通过碱基间的氢两条链通过碱基间的氢键相连，键相连，a对对t有两个氢有两个氢键，键，c对对g有三个氢键，有三个氢键，这种这种a-t、c-g配对的规配对的规律，称为律，称为碱基互补规则碱基互补规则。a、t配对g、c配对 影响双螺旋结构稳定的因素 1）氢键 互补碱基对之间可形成氢键 2）碱基堆积力 电子云交错而形成的一种力，使双螺旋结构内部形成一个强大的疏水区，与介质中的水分子隔开，有利于互补碱基间形成氢键，稳定双螺旋

12、结构。 3）离子键 磷酸基团上的负电荷与介质中的阳离子之间形成离子键（盐键）。 4）碱基分子内能 分子内部无规则运动形成的能量，受温度等外部因素的影响。 dna 双螺旋结构的多态性 在多核苷酸链中，脱氧核糖的五元环能折叠成多种构象，此外，分子还可绕n-c糖苷键以及3,5-磷酸二酯键旋转一定的角度，这就使具有同样碱基配对的dna双螺旋可以采取另一些构象，dna构象上这种差异称为多态性。 watson和crick所描述的dna双螺旋构象现在称为b型dna，另外还有a型、c型和z型等构象类型的dna，在一定条件下b-dna可转变为a-dna或c -dna。a-dna： b型（湿度：92% dna钠盐

13、纤维的构象）dna脱水时，就转变为a型（湿度：75% dna钠盐纤维的构象）。a-dna也是由反向的两条多核苷酸链组成右手螺旋。每一螺圈含11个碱基对，碱基对与中轴的倾角为20，两个核苷酸之间的夹角为33。rna、dna杂交双链以及rna双螺旋区具有与a-dna相似的结构。z-dna： rich在研究cgcgcg寡聚体结构时，发现cgcgcg有左手螺旋的双螺旋结构，称之为左旋dna。因为磷酸基在多核苷酸骨架上的分布呈“z”字形，又称为z-dna。特点：直径1.8nm，螺距4.5nm，每一螺圈含12个碱基对，整个分子比较细长而伸展，大沟外凸而变得不明显，小沟则窄而深。a-dnab-dnac-dn

14、az-dna螺旋方向右手右手右手左手直径直径nm2.551.91.91.84bp/螺旋螺旋11109.3312螺距螺距2.533.43.14.56碱基升高碱基升高0.230.340.3320.371bp面间转角面间转角 32.73638.660四种双螺旋结构的比较四种双螺旋结构的比较 三链dna （tsdna) 三链dna 多聚（da）-多聚（dt）具有类似b-dna的结构，提高其环境中的盐浓度（或降低相对湿度），它的双螺旋结构就歧化成三链结构和一条多聚脱氧核苷酸链。 dna的三链结构可能与基因表达调控有关。第三股链的存在可能阻碍了一些调控蛋白或rna聚合酶与dna的结合。三、三、dna 的三

15、级结构的三级结构 在细胞中，由于dna 与其它分子（如蛋白质）的相互作用，使dna 双螺旋进一步扭曲成环状或麻花状的形态，称为dna 的三级结构。超螺旋是超螺旋是dna三级结构的一种类三级结构的一种类型。型。大肠杆菌质粒dna的三级结构（一）dna的超螺旋结构超螺旋结构超螺旋结构(superhelix 或或supercoil)dna双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。 意义意义dna超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于调控对于dna复制和复制和rna转录过程具有关键作用。转录过程具有关键作用。 正超螺旋正超螺旋(posit

16、ive supercoil)盘绕方向与盘绕方向与dna双螺旋方同相同双螺旋方同相同 负超螺旋负超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与盘绕方向与dna双螺旋方向相反双螺旋方向相反 （二）原核生物（二）原核生物dna的高级结构的高级结构（三）（三）dna在真核生物细胞核内的组装在真核生物细胞核内的组装真核生物染色体由真核生物染色体由dna和蛋白质构成，和蛋白质构成，其基本单位是其基本单位是 核小体核小体(nucleosome)。核小体的组成核小体的组成dna：约约200bp 组蛋白：组蛋白：h1h2a，h2bh3h4 真核生物的dna与蛋白质结构形成核小体（2分子h2a、h2b、

17、h3、h4和1分子h1 ）串珠状核小体结构串珠状核小体结构串珠状核小体串珠状核小体dna双螺旋片段双螺旋片段染色质纤染色质纤维维伸展形染色质片段伸展形染色质片段密集形染色质片段密集形染色质片段整个染色整个染色体体核小体核小体螺线管螺线管真核生物染色体真核生物染色体dna组装组装三、三、rna 的结构的结构（一）rna的基本结构（二）trna的二级结构和三级结构（三）rrna的结构（四）mrna的结构（一）rna的基本结构 rna为直线型多核苷酸链，链间也是以3,5-磷酸二酯键彼此连接起来。 不同之处是rna 的碱基组成没有dna 那样的规律，大多数天然rna 分子是一条单链，其可以发生分子自身

18、回折，而使互补碱基区形成局部双螺旋区，不能配对的碱基区域则形成突环，形成类似发夹式结构。（二）trna的二级结构和三级结构trna的二级结构辨认并结合氨基酰辨认并结合氨基酰trna合成酶合成酶携带氨基酸携带氨基酸识别识别mrna上的密码上的密码识别并结合识别并结合核蛋白体核蛋白体trna的三级结构倒l型trna三级结构计算机模拟图hnrna 内含子内含子(intron)mrna * 真核生物真核生物mrna成熟过程成熟过程 外显外显子子(exon)（三）mrna的结构 mrna分子也是呈单链状态，大部分有突环形二级结构。 真核生物mrna：5-末端有一个特殊的帽子结构 m7gpppnmpn 3

19、-末端有长约200核苷酸的polya 原核生物mrna：一般无3-polya和5-帽子结构mrna结构特点结构特点帽子结构作用：1、 保护作用，抗核酸外切酶水解2、 与蛋白质合成起始有关3、 维持结构，协助核糖体与mrna 结合3polya 作用：1、 保护作用，抗核酸外切酶水解2、 与mrna 半寿期有关3、与mrna 转移有关mrna 5-帽子结构m7gpppnmpn55m7gtpoch3 原核生物mrna 一般为多顺反子： 一条mrna 编码多条多肽链。 真核生物mrna 一般为单顺反子： 一条mrna 编码一条多肽链。（四）rrna的结构 rrna的分子结构基本上都是由部分双螺旋与部分

20、突环相间排列而成。16s rrna二级结构* rrna的功能的功能参与组成核蛋白参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物体，作为蛋白质生物合成的场所。合成的场所。核糖体的组成核糖体的组成原核生物原核生物真核生物真核生物小亚基小亚基30s40srrna16s18s蛋白质蛋白质21种种33种种大亚基大亚基50s60srrna23s5s28s5.8s5s蛋白质蛋白质33种种49种种核糖体核糖体70s80s(五五 )其他小分子其他小分子rna及及rna组学组学除了上述三种除了上述三种rna外，细胞的不同部位外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子存在的许多其他种类的小分子rna，统称为，统称为非非mrna

21、小小rna (small non-messenger rnas，snmrnas)。 snmrnassnmrnas的种类的种类核内小核内小rna (snrna)核仁小核仁小rna (snorna)胞质小胞质小rna (scrna)催化性小催化性小rna小片段干扰小片段干扰 rna (sirna) snmrnas的功能的功能参与参与hnrna和和rrna的转录后加工和转运的转录后加工和转运以及基因表达过程的调控等。以及基因表达过程的调控等。是研究细胞中是研究细胞中snmrnas的种类、结构的种类、结构和功能的科学。同一生物体内不同种类的细和功能的科学。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间

22、、不同状态下胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmrnas的表达具有时间和空间特异性。的表达具有时间和空间特异性。 rna组学组学 (rnomics)第四节第四节 核酸的理化性质及分离提纯核酸的理化性质及分离提纯一、一般性质二、紫外吸收性质三、变性、复性与分子杂交四、碱解与酸解五、提取与分离一、一般性质 提纯的dna 为白色纤维状固体，rna 为白色粉末，两者都微溶于水，不溶于一般有机溶剂。 dna 分子由于直径小而长度大，因此溶液粘度极高，rna 分子粘度则小得多。 溶液中的核酸在引力场中可以下沉，沉降速度与分子量和分子构象有关。可用超速离心技术测定核酸的沉降常数和分子量。 核酸是两性电解

23、质，（含碱性基团、 磷酸基团），因磷酸的酸性强，常表现酸性。由于核酸分子在一定酸度的缓冲液中带有电荷，因此可利用电泳进行分离和研究其特性。最常用的是凝胶电泳。（溴化乙锭、银染）二、紫外吸收性质 核酸在260nm 附近有最大吸收值，是由是由碱基的共碱基的共轭双键轭双键决定的。决定的。据此特性可定性和定量检测核酸和核苷酸。蛋白质在280nm 有一吸收峰，因此利用od 260/o d280 比值可判断核酸样品的纯度。 纯dna： od260/od280 值=1.8纯rna： od260/od280 值=2.0当 od260/od280值1.8，含rna； od260/od280 值1.8 时，含蛋白

24、质和苯酚。rna溶液的浓度（溶液的浓度（g/ ml）=od260 40dna溶液的浓度（溶液的浓度（g/ ml）=od260 50减色效应 核酸的光吸收值常比其各核苷酸成分的光吸收值之和少3040%，这是在有规律的双螺旋结构中碱基紧密地堆积在一起造成的，此现象称为dna 的减色效应。1天然dna2变性dna3核苷酸总吸收值三、变性、复性与分子杂交（一）变性 1、变性的概念：核酸的变性核酸的变性指核酸双螺旋的氢键断裂指核酸双螺旋的氢键断裂（不涉及共价键的断裂），变成单链，（不涉及共价键的断裂），变成单链，生物活性丧失的过程。生物活性丧失的过程。dna变性的本变性的本质是双链间氢质是双链间氢键的断

25、裂键的断裂2、变性因素热力热力、强酸、强碱、有机溶剂、变性剂、强酸、强碱、有机溶剂、变性剂（尿素、甲醛）（尿素、甲醛）、射线、机械力等。、射线、机械力等。解链曲线：解链曲线：在连续加热在连续加热dna的过程中以温度的过程中以温度对对a260值作图，所得的曲线称为解链曲线值作图，所得的曲线称为解链曲线。3、变性指标（1）变性温度（变性温度（tm） 变性温度（变性温度（tm） 是指引起是指引起dna 发生变性的温度变化范围的中发生变性的温度变化范围的中点，又称熔点。变性作用发生在一个很窄的点，又称熔点。变性作用发生在一个很窄的温度范围之内（爆发式的）。温度范围之内（爆发式的）。 tm 也可以用吸光

26、度值表示：热变性过程中也可以用吸光度值表示：热变性过程中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半）时的温度。螺旋结构失去一半）时的温度。tm与下列因素有关与下列因素有关 核酸的核酸的均一程度均一程度，均一性愈高的样品，变性过，均一性愈高的样品，变性过程的温度范围愈小。程的温度范围愈小。 tm 值与值与gc 含量含量成正比成正比：（g-c）%=(tm-69.3)*2.44 tm 值与介质离子强度成正比值与介质离子强度成正比。dna的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱增色效应：增色效应：dna变性时其溶液变性时其溶液od260增高的现象。增高的现象。（2

27、 2）增色效应（二）复性变性dna 在适当条件下，又可使彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构，全过程称为复性。dna 复性后，许多理化性质、部分生物活性可得到恢复。但将热变性dna 骤然降温时，dna 不能复性，只有在缓慢冷却时，才可复性。dna-dna杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的dna分子分子（三）分子杂交 不同来源的dna 分子放在一起热变性，然后慢慢冷却，让其复性。若这些异源dna 之间有互补或部分互补序列，则复性时会形成“杂交分子”。dna 与互补的rna 之间也可以发生杂交。 核酸的杂交在分子生物学和分子遗传学的研究中应用广泛，例：dna 探针。变性

28、变性复性复性复性复性核酸杂交的应用southern blot (dna印迹) 是英国的分子生物学家southern 1975年发明的一种利用分子杂交原理鉴定dna的方法. （a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组dnadna限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的同探针同源杂交的基因基因dna片段片段x光底片光底片基因组dna限制性酶切琼脂糖凝胶电泳分离原位变性后转移到滤膜上用带有标记的核酸探针(已知序列)进行杂交检测与探针互补的dna片段。核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用研究研究dna分子中某一种基因的位置分子中某一种基因的位置定两种核酸分子间的序列相似性定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础是基因芯片技术的基础 第五节 核酸与蛋白质的复合体 有机体内核酸常与蛋白质结合成复合体，称为核蛋白体。如 染色体 病毒 核糖体1、染色体核小体2、病毒、病毒3、核糖体30s亚基50s亚基第六节 核酸的分离和纯化一、分离的一般原则 要保持天然性，因此要求在提取过程中掌握下列原则：1、防止核酸酶的降解；2、防止化学因素的降解；3、防止物理因素的降解。细胞破碎细胞破碎 抽提去蛋白质抽提去蛋