HiScan操作手册

1、Contents制备MSA12需要2准备2实验2片段化MSA13需要3准备3实验3沉淀MSA14需要4准备4实验4重悬MSA16需要6准备6实验6芯片杂交7需要7准备7实验7为下一步准备XC4溶液9清洗芯片10需要10准备10实验10荧光反应14需要14准备14实验14上机扫描荧光信号17需要17准备17实验17制备MSA1需要MA1（-20,illumina）MA2（-20,illumina）MSM（-20,illumina）0.1M NaOH（4）96孔深孔板DNA样品（50ng/ul）准备将置于扩增后区的Hybridization Oven温度调至37；给一个新的MIDI plate贴上

2、条形码标签；在室温下融化MA1，MA2，MSM，颠倒混匀后短暂离心；将DNA样品融化至室温；实验1 每个MSA1平板的样品孔中加入20l MA1溶液；2 每个样品孔加入4l DNA样品；3 每个样品孔加入4l 0.1N NaOH；4 用cap mat封闭MSA1平板；5 用vortexer 1600rpm振荡MSA1平板1min；6 280g离心1min；7 室温下静置10min；8 每个样品孔加入68l MA2；9 每个样品孔加入75l MSM；10. 用cap mat封闭MSA1平板；11. 用vortexer 1600rpm振荡MSA1平板1min；12. 280g离心1min；13.

3、转入扩增后区域操作，将MSA1平板放在37的Hybridization Oven里2024hr；片段化MSA1需要FMS（-20,illumina）Heat block准备将Heat block调至37预热；室温下融化FMS，轻微颠倒混匀，短暂离心；从Hybridization Oven里取出MSA1平板；实验1. 50g离心MSA1平板1min；2. 每个样品孔加入50l FMS溶液；3. 用cap mat封闭MSA1平板；4. 用vortexer 1600rpm振荡MSA1平板1min；5. 22下50g离心MSA1平板1min；6. 将MSA1平板置于37 Heat block 1hr；

4、沉淀MSA1需要PM1（4保存,illumina）100% 异丙醇（2-propanol）Heat block准备将Heat block调至37预热；室温下融化PM1去掉MSA1平板的cap mat实验1. 每个样品孔加入100l PM1；2. 用cap mat封闭MSA1平板；3. 用vortexer 1600rpm振荡MSA1平板1min；4. 将MSA1平板置于37 Heat block 5min；5. 22下50g离心MSA1平板1min；6. 将离心机温度设为4；7. 每个样品孔加入300l 异丙醇；8. 用cap mat封闭MSA1平板，上下轻微颠倒平板十次；9. 将MSA1平板放

5、置在4下30min；10. 如果即将进入重悬MSA1步骤，现在可以取出RA1放在室温下解冻（RA1不易解冻，解冻后含有少量沉淀，需要摇匀溶解）；11. 4下3000g离心MSA1平板20min（离心机只能达到2200g，将离心时间延长至30min），迅速取出MSA1平板，可见样品孔中有蓝色沉淀；迅速进入下一步骤，避免沉淀重悬；12. 弃掉cap mat13. 迅速弃掉样品孔中溶液，可以用手瞬间甩出样品孔里的溶液，再将MSA1平板连续多次倒扣于吸水纸上，直至样品孔中没有溶液流出为止；14. 将没有封口的MSA1平板保持倒置，放于试管架上，在室温下干燥1hr；可见样品孔底部蓝色沉淀；15. 进入下

6、一步实验，或者用cap mat封闭平板，保存在-20；重悬MSA1需要RA1（-20保存,illumina）Heat sealer准备将Hybridization Oven温度调至48预热；打开heat sealer预热，大约需要20min；室温下融解RA1，颠倒使沉淀溶解；实验1. 每个样品孔加入46l RA1；2. 用foil heat seal封闭MSA1平板，将foil heat seal压在MSA1平板上，置于heat sealer中，用sealing block紧紧压在foil heat seal上持续5sec，再将MSA1平板水平旋转180°，再次用sealing bl

7、ock紧紧压住持续5sec，迅速进入下一步骤；3. 取出MSA1平板，快速用工具压过整个MSA1平板表面，使每一个样品孔表面都有少许凹陷，确定样品孔完全密封；若平板表面温度在密封好之前已经下降，可以用sealing block再一次加热；4. 将密封好的MSA1平板放在Hybridization Oven里48反应1hr；5. 用vortexer 1800rpm振荡MSA1平板1min；6. 280g短暂离心；如果MSA1平板之前保存在-20，可以重复振荡和离心步骤直至沉淀完全悬浮；7. 进入下一步实验（可在室温下短暂保存）或者在-20保存（超过24hr保存需放置在-80）；芯片杂交需要PB2

8、（室温,illumina）BeadChipsHyb ChambersHyb Chamber lidHyb Chamber gasketsHyb Chamber inserts准备将Heat block调至95预热；将Hybridization Oven温度调至48预热速度调至5；实验1. 将Hyb Chamber gaskets放入Hyb Chamber;2. 在Hyb Chamber中，给每一个需要用的保湿槽加入400l PB2；3. 用Hyb Chamber lid盖住Hyb Chamber防止PB2蒸发；4. 将重悬后的MSA1平板放在95的heat block上20min变性；5. 从

9、4中取出BeadChips但暂时不用拆封；6. 从heat block取下MSA1平板，放置在室温下30min；7. 280g短暂离心MSA1平板；8. 小心去除BeadChips外包装；小心：避免触碰芯片中心条纹区域和边沿上样孔；9. 将BeadChips放入Hyb Chamber insert，使芯片的条形码与Hyb Chamber insert上的条形码区域方向一致；10. 从MSA1平板中取42l DNA样品，沿芯片上样孔缓慢加入芯片，此过程保持移液器垂直于芯片，并在上样孔保留一个小液滴；可以额外增加上样的样品以保证在上样孔形成液滴； 11. 按照图示顺序完成所有样品上样；上样完成后等

10、待样品溶液扩散并浸没所有芯片表面；12. 确定Hybridization Oven温度升至48；13. 将Hyb Chamber insert放入Hyb Chamber，使芯片条形码方向与Hyb Chamber中条形码区域方向一致；14. 盖上Hyb Chamber lid，用夹锁固定；15. 将Hyb Chamber平稳的移至48的Hybridization Oven中，全程避免振荡和摇晃，并且保证Hyb Chamber在Hybridization Oven中为横向放置； 16. 开启Hybridization Oven的晃动开关，在48中温育至少16hr，但不超过24hr；可以丢弃MSA1

11、平板；为下一步准备XC4溶液1. XC4试剂瓶中加入330ml 100%乙醇；2. 剧烈振荡15sec（可手动）；3. 室温下放置过夜；若没有放置过夜，加完乙醇后可放置在振荡器上剧烈振荡，等待使用；4. 使用前再次剧烈振荡，确保没有可见图层出现；清洗芯片需要PB1(illumina)Multi-sample BeadChip Alignment Fixture and Alignment barTe-Flow Flow-Through Chambers（black frames, spacers, glass back plates, clamps）Wash Dish（glass）Wash R

12、ack准备从Hybridization Oven中取出Hyb Chamber，室温下冷却25min；给两个Wash Dish中分别加入200ml PB1，并标记为PB1；给BeadChip Alignment Fixture中加入150ml PB1；去掉spacers的白色贴纸；清洗glass back plates；实验1. 安装好Wash rack的把手，并把Wash rack浸泡入第一个Wash dish中的PB1溶液里；2. 取出Hyb Chamber insert，并取出BeadChips；3. 揭开粘在BeadChips表面的IntelliHyb Seal；注意：IntelliHy

13、b Seal粘性较强，一手捏紧BeadChips，另一手从条形码一边揭起膜，一次性、缓慢、连续揭开IntelliHyb Seal，一定避免停顿和动作的反复，会给芯片表面留下印迹；seal的胶会在BeadChip边沿留下残余，可以用无粉纸巾吸少许乙醇小心擦拭，一定避免接触BeadChip中心区域； 4. 快速将BeadChips放入浸泡在PB1中的Wash rack里，确保整张BeadChips都浸没PB1；5. 上下缓慢提放Wash rack 1min，每次都使BeadChips完全离开PB1液面或者完全浸没液面；6. 将Wash rack移入另一个Wash dish中，确保BeadChips

14、完全浸没PB1；7. 重复步骤5；安装Flow-through Chamber1. 对于每一个BeadChip，都需要一个black frame放入事先乘好150ml PB1溶液的BeadChip Alignment Fixture；2. 将BeadChip从Wash rack中取出，放入black frame，条形码一头与BeadChip Alignment Fixture中有条纹一侧一致；每一个BeadChip都确保完全浸没PB1；3. 仔细检查确保BeadChip表面没有杂物污染；4. 取一个干净的spacer（透明）放置于BeadChip之上；5. 将Alignment bar装在Al

15、ignment Fixture远离BeadChip的条形码一侧；6. 取一个干净的glass back plate（避免与BeadChip接触面有任何尘埃污染），放置于BeadChip和spacer之上，使glass back plate的缺口在条形码一侧，面朝BeadChip形成一个漏斗型上样槽，并使glass back plate的另一端紧贴Alignment bar；7. 用两个clamps固定每一个Flow-Through Chamber；8. 取出Flow-Through Chamber，用剪刀剪去spacer的边沿，需要保留条形码区域；9. 在可以进入下一步实验之前用蒸馏水清洗Fl

16、ow-Through Chamber的点样槽以确保不再有PB2溶液残留；注意：需要去除PB2溶液对后续反应的影响；荧光反应需要RA1(-20,illumina) 18张BeadChips需10mlXC1(-20,illumina)XC2(-20,illumina)TEM(-20,illumina)XC3(Room temperature ,illumina) 18张BeadChips需50mlSTM(-20,illumina)PB1(Room temperature ,illumina) 18张BeadChips需300mlXC4(Room temperature ,illumina) 18张

17、BeadChips需300mlEtOH(Room temperature)95% formamide/1 mM EDTA(14.25ml formamide+0.75H2O+30l 0.5M EDTA)准备尽早取出RA1融解；室温下融解所有试剂；尽早设置water circulator温度为44；注意：水浴精确温度很难稳定，需尽早开启等待其平衡；使用前摇晃Chamber Rack使里面的气泡排出，能够帮助水浴温度准确稳定；使BeadChip的Flow-Through Chamber与检测温度的temperature probe相邻放置在Chamber Rack里并靠近Chamber Rack的

18、进水口，可以使测量的温度更准确稳定；实验注意：下面的步骤不允许中断单碱基延伸1. 当Chamber Rack温度达到44，将Flow-Through Chamber装入Chamber Rack，使上样槽向上；2. 剧烈摇晃XC4使溶液完全溶解；3. 在每一个Flow-Through Chamber中，沿上样槽加入：a) 150l RA1，静置30sec，再重复5次；b) 450l XC1，静置10min；c) 450l XC2，静置10min；d) 200l TEM，静置15min；e) 450l 95% formamide/1 mM EDTA，静置1min，再重复一次；f) 静置5min；g

19、) 将Chamber Rack的温度调节至STM管子所写温度，若没有写明则调节至37；h) 450l XC3，静置1min，再重复一次；4. 等待Chamber Rack的温度达到正确温度；荧光标记1. 如果计划实验后立即上机扫描BeadChips，现在需要打开HiScan；2. 在每一个Flow-Through Chamber中，加入：a) 250l STM，静置10min；b) 450l XC3，静置1min；再重复一次，静置5min；c) 250l ATM，静置10min；注意：ATM和STM都比较粘稠，如果溶液流过Flow-Through Chamber的速度比较慢可以多等待几分钟时间

20、；d) 450l XC3，静置1min；再重复一次，静置5min；e) 250l STM，静置10min；f) 450l XC3，静置1min；再重复一次，静置5min；g) 250l ATM，静置10min；h) 450l XC3，静置1min；再重复一次，静置5min；i) 250l STM，静置10min；j) 450l XC3，静置1min；再重复一次，静置5min；3. 取出Flow-Through Chamber，静置于试验台；清洗和包埋1. 给Wash dish加入310ml PB1（300ml即可）；2. 将staining rack放入PB1溶液中，使locking arm面对自己； 3. 用dismantling tool打开Flow-Through Chamber上的clamps，去掉glass back plate和spacer，取出BeadChip，并将BeadChip放入PB1里的staini