不同年龄麦洼牦牛肠道菌群的分离鉴定及其群落结构的变化

1、不同年龄麦洼牦牛肠道菌群的分离鉴定及其群落结构的变化摘 要：为了解麦洼牦牛肠道细菌群落结构组成和功能及其动态变化过程，同时获得具有潜在益生菌活性和应用可能性的肠道菌株，采用不同的培养基在不同的培养条件下分离麦洼牦牛肠道细菌并进行16S rDNA分子鉴定，同时采用变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术分析p 不同年龄麦洼牦牛肠道细菌的群落结构和功能及其差异。结果表明，从不同年龄麦洼牦牛大肠内容物中共分离到90株细菌，其中3株归为放线菌门（Actinobacteria），64株为厚壁菌门（Firmicutes），23株为变形

2、菌门（Proteobacteria）；分离到的34株芽孢杆菌属（Bacillus）和14株乳酸杆菌属（Lactobacillus）细菌具有潜在益生菌活性，可作为微生物饲料添加剂补饲麦洼牦牛；对DGGE图谱的UPGMA聚类、PCA和多样性指数分析p 显示，不同年龄的麦洼牦牛肠道细菌的群落结构有差异，相同年龄的个体相似度较高，而不同年龄的个体相似度较小，较大年龄（2.5和3.5岁）的牦牛肠道菌群多样性大于较小年龄个体（0.5和1.5岁），且分布更均匀，肠道菌群随宿主年龄变化是一个动态变化并趋于稳定的过程；DGGE条带的物种鉴定结果表明，大部分条带为未（能）培养细菌，PCR-DGGE与分离培养法结合

3、可以很好地表征麦洼牦牛肠道菌群的结构和功能。【关键词】：p ：肠道菌群；牦牛；培养法；16S rDNA；PCR-DGGE文献标志码：A 文章编号：1674-5124（20_）12-0053-070 引 言牦牛（Yak，Bos grunniens）是高寒地区的特有牛种，草食性反刍家畜，也是我国的主要牛种之一，主要产于青藏高原海拔3 000 m以上地区。麦洼牦牛是在川西北高寒生态条件下经长期自然选择和人工选择形成的乳、肉性能良好的草地型牦牛品种，对高寒草地特别是沼泽草地有良好的适应性，是四川省群体数量最大的牦牛地方品种1。牦牛具有奶、肉、绒、皮等多种经济用途，且具有风味独特、品质优良的奶和肉，来自

4、高原地区的牦牛产品正以其无污染的特色野味逐渐受到人们的青睐2。牦牛的肠道是其消化和吸收营养物质的主要场所，直接关系到牦牛的营养与健康。其肠道内共生着大量细菌，能进一步分解食物残渣和植物纤维，促进牦牛对营养物质的吸收3。肠道正常菌群在一般情况下不会致病，一些肠道细菌还能利用肠道内简单的物质合成维生素B和维生素K等；但由于牦牛的主产区青藏高原海拔较高、气候严寒恶劣、冷季草料匮乏，易导致牦牛掉膘、生病和死亡等冷季损失问题，因此深入了解牦牛肠道微生物的群落结构对牦牛的营养具有十分重要的意义。目前关于系统深入地研究牦牛肠道微生物的群落结构和功能，以及它们的动态变化和与牦牛营养代谢的潜在关联还鲜见报道，少

5、量的研究大都集中于其肠道微生物的分离培养鉴定，且与疾病的防控相关4-5。传统培养法存在只能反映少数微生物的信息、检测结果误差较大、易漏掉具有应用价值的微生物资等问题6，但这种方法在分离具有一定特殊功能的目标微生物时非常有用，许多微生物资的开发与利用还是要依赖传统的微生物培养技术5，7。PCR-DGGE指纹图谱技术在研究复杂微生物区系的遗传多样性和种群差异等方面具有独特的优势，目前已成为分析p 微生物群落结构和动态变化广泛采用的技术8。而随着大规模测序技术的发展，宏基因组学（Metagenomics）以环境中未培养微生物为研究对象，近年来在微生物生态学和环境微生物学研究中得到了快速的发展9-10

6、，这一技术在揭示未发现的物种存在，以及鉴定微生物组的部分基因功能和不同微生物的基因功能差异等方面具有更加强大的功能，因此也成为目前肠道微生物研究重点采用的技术11。本研究采用不同的培养基在不同的培养条件下分离麦洼牦牛肠道细菌并进行16S rDNA分子鉴定，分析p 讨论获得的菌株的益生菌活性和应用可能性；同时采用PCR-DGGE技术分析p 不同年龄麦洼牦牛肠道细菌的群落结构和功能及其差异，分析p 并讨论肠道菌群随宿主年龄的动态变化过程。1 材料与方法1.1 材 料1.1.1 主要试剂细菌基因组DNA提取试剂盒，北京天根公司；Stool DNA Kit，Gel E_traction Kit，美国O

7、MEGA公司；Premi_ TaqRVersion2.0（Loading dye mi_），日本Takara公司；SYBR Green I核酸染料，美国Sigma公司；LB培养基（LB）、脑心浸液肉汤培养基（BHI）和厌氧琼脂培养基（SAA），青岛海博生物技术有限公司。1.1.2 主要仪器S1000TM PCR 仪，WIDE MINI-SUBR CELL GT型电泳槽，PowerPacTM Basic型电泳仪，Universal Hood II型凝胶成像系统，DCodeTM Universal Mutation Detection System，美国Bio-Rad公司；LEGEND MICRO 21R型高速冷冻离心机，1389型生物安全柜（A2），美