大鼠皮层星形胶质细胞原代培养、鉴定及氧糖剥夺模型的建立

1、大鼠皮层星形胶质细胞原代培养、鉴定及氧 糖剥夺模型的建立作者：魏爱宣李昕华闫世军何金婷莽靖邢影邵延坤徐忠 信【摘要】 目的原代培养和鉴定大鼠皮层星形胶质细胞, 并建立大鼠皮层星形胶质细胞氧糖剥夺(ogd)模型。方法大 鼠星形胶质细胞原代培养后，作胶质纤维酸性蛋白(gfap)免 疫细胞化学染色鉴定，应用缺氧d hank液及缺氧培养罐 行ogd后用台盼蓝染色及乳酸脱氢酶(ldh)漏出率检测细胞 损伤程度。结果星形胶质细胞培养至第9天，gfap染色阳性 细胞为±%;星形胶质细胞经不同时间ogd处理后，台盼蓝 染色呈现不同形态;0gd60min时，星形胶质细胞ldh漏出率 较对照组明显增加(

2、p【关键词】 星形胶质细胞;原代培养； 氧糖剥夺(ogd)abstra ct】objectivetocond uctprimarycultureandidentificationofratcerebralcorticalastrocytes,andtosetuptheoxygen/glueosedeprivation(ogd)mode1. methodscellspresentedintheculturewereshowntobeastrocytesaftercharacterizationbyimmunocytochemistry,usingspecificantigfapantibody.

3、 ogdmodelwasestablishedwit hhypoxicdhank ' san danaerobicchambera ndidentifiedbycelldeathandldhreleaserate. resuitsimmunohistochemistryofculturedcellshowedthatthepositiveratesofgfapwere% ± %atthe9thday；differentsh apeandmoti1ityiden tifiedbytrypan bluestainwasobservedwhenexposedtodifferento

4、gdtime；60min0gdcausedasignificantincreaseontheleve isofldhrelease(p 【k eywords 】 astrocytes ；primaryculture；ox ygenglucosedepriva tion (ogd)研究表明在缺血缺氧性脑损伤过程中，星形胶质细胞和 神经元有着动态、复杂的相互作用，从而维持脑组织的正常 功能和存活13)。本实验采用大鼠皮层星形胶质细胞原 代培养，应用体外氧糖剥夺(oxygen g lucosedeprivation, 0gd)建立大鼠脑皮层星形胶质细胞缺血缺氧损伤模型，模拟 体内脑缺血过程，为今后进

5、一步探讨缺血过程中星形胶质细 胞的脑保护作用机制奠定基础。1材料与方法实验动物出生12d内的wi star乳鼠，用于星形胶质 细胞原代培养。购自吉林大学动物实验中心。大鼠皮层星形胶质细胞原代培养采用酶消化法和机械 分离法相结合培养星形胶质细胞o wistar乳鼠分离出皮层组 织，清洗后剪碎成h1h13的小块，移入无菌锥底离心管内，加 入胰酶，形成细胞悬液；于3 7°c, 5%c02培养箱中孵育、培 养、传代备用。大鼠皮层星形胶质细胞鉴定细胞培养板每日置于倒 置显微镜下观察细胞胞体与突起形态、贴壁与生长情况。 星形胶质细胞在培养第9天用胶质纤维酸性蛋白 (glialfibrillary

6、acidicprotein, gf ap)免疫细胞化学染色 进行鉴定，显微镜下观察，以在细胞膜和胞浆内出现棕黄色 颗粒者判定为阳性，每张爬片随机选取3个200x视野，计 数，取均值，计算阳性细胞百分比。体外培养星形胶质细胞0gd模型的建立利用自行设计、 长春应用化学研究所生产的组装瓶和负压吸引装置将dhank液通入含95%n 2及5%c02的缺氧气体，制备缺氧dhank液，用血气分析仪测定缺氧d hank液的氧浓度。 将真空干燥器通入缺氧气体制成缺氧罐，用麻醉气体分析仪 测定缺氧罐内氧含量。将培养第9天的星形胶质细胞用缺hank液孵育，并放入缺氧罐中，将缺氧罐放入3 7°c孵箱内开始

7、计时；分别取缺氧时间为15、30、45、60、90、120 . 180min再复氧24h的星形胶质细胞进行评价。体外培养星形胶质细胞0gd模型的评价台盼蓝染色法 测定细胞死亡率。测定时取出培养板，每个时间点取3孔, 吸弃上清液，然后加一滴台盼蓝溶液，在3min内随机计数200个细胞中蓝染的死细胞及未蓝染活细胞的细胞数，计算 细胞死亡率。ldh漏出率的检测。将待测细胞培养板取出，每组每个时间点取3孔，吸取各孔内的培养液入 相应试管内，加入等量pbs液，制备成细胞匀浆液，收集入 相应的试管内。每孔液体设2个试管，分别测定细胞培养液 和细胞匀浆液的0d值。按公式计算ldh漏出率。统计学分析数据以x&

8、#177;s表示，应用软件进行方差分析。2结果大鼠皮层星形胶质细胞原代培养及细胞鉴定星形胶质 细胞在培养第9天分化成熟，形成密集的神经细胞网络，可 见胞体较大、扁平、形状多样、折光性低。gfa p免疫细胞 化学染色，可见大部分细胞染成棕黄色，形态多样，胞核圆 形或椭圆形，常偏于胞体一侧，胞突较多、较长，彼此交织 成网状，阳性细胞占全部细胞的±%,见图1。缺氧d hank液体氧浓度及缺氧罐氧含量缺氧d hank液体的氧浓度低于1%,缺氧罐内氧含量为1%±%,二氧 化碳浓度为5%±%。星形胶质细胞不同0gd时间细胞死亡率及ldh漏出率星 形胶质细胞0gd15180mi

9、n均未能对细胞形态和活性产生明 显影响，90min后可见少量蓝染细胞，180min时，蓝染星形 胶质细胞增多。随0gd时间增加，星形胶质细胞ldh漏出率 逐渐增加，其中60m in时开始明显增加。见表1。表1星形 胶质细胞不同ogd时间细胞死亡率及ldh漏出率3讨论体外细胞培养是神经科学研究中一种重要的方法，被广 泛应用于神经细胞分子生物学研究。本研究采用酶消化法和 机械分离法相结合成功进行体外星形胶质细胞原代培养。通 过gfa p免疫细胞化学染色方法对体外原代培养的星形胶质 细胞进行了鉴定。gfap是脑间质纤维的主要亚单位，是星形 胶质细胞的特异性标志蛋白，在星形细胞中有丰富而唯一的 表达。

10、本实验培养出高纯度及发育成熟的神经细胞为完成后 续实验奠定了良好的基础。缺血缺氧性脑损伤模型报道较多，方法及实际操作不尽 相同4 , 5，但体内实验模型难免受到体液、循环等复杂 因素的影响，很难解释某单一因素的影响作用及强度。本实 验处理的缺氧细胞培养液，液体氧浓度【参考文献】ilibertocm,albrec htpj,herxlm,etal. p ro regenerativepropertiesofcytokineactivatedastrocytes j) neurochemistr y, xx； 89 (6): 1092 10 0.2dienelga,hertzl. astrocyt

11、iccontribut ionstobioenergetiesofcerebralischemia(j)glia,xx；50 (13):36288.3caij,kangz,liuww,etal. hydrogentherapyreducesapoptosisinneo natalhypoxiaische miaratmodel(j. neu roscilett,xx； 441 (2 ): 16772.4romerac ,hurtadoo,botellas h,etai. invitroischemictoleranceinvolvesupregulationofglutamatetranspo

12、rtp artlymediatedbythe tace/adam17tumorn ecrosisfactoralph apathwayj)neuroscience,xx；24：13507.5jiangw,guw,hossmannka,eta1. establishingaphotothrombotic ' ring ，strokemodelinadultmicewithiatespontaneousreperfusion：quantitativemeasurementsofcerebralbloodflowandcerebralproteinsynthesisj) . cereb bloodflowmetab, xx； 26 (7): 92736.6kor zhe