镇眩汤对梅尼埃病大鼠血管加压素的影响

1、机能学实验设计大纲实验名称：镇眩汤对梅尼埃病豚鼠血管加压素的影响课题来源：自选设计班级：设计人员： 设计日期：指导老师：一、实验设计的目的意义：实验设计的目的意义，国内外研究现状，存在的问题，解决问题的思路：目的与意义：复制豚鼠梅尼埃病模型，探讨中药复方镇眩汤治疗梅尼埃病的机制。由于MD的病因不明，其发病机制和临床诊治的研究一直是耳鼻咽喉科学研究的热点。本模型采用阻塞前庭导水管的传统方法复制模型 ，观察镇眩汤对梅尼埃病豚鼠血管加压素的影响，为临床提供药效学资料及治疗学基础。国内外的现状：梅尼埃病是临床上较为常见的一种内耳疾病，以膜迷路积水为基本病理改变。由于病因未明、且易复发，国内外中西医学者

2、对此病进行了大量研究。祖国医学认为梅尼埃病属中医学眩晕范畴，临床特点为反复发作性眩晕伴恶心、呕吐、耳鸣及听力进行性减退，急性发作期常有视物旋转，如坐舟车，动则尤甚，并伴有眼球震颤、平衡失调等。现代医学对本病的认识病因未明，但情绪紧张、忧虑和工作劳累可能是发作的诱因。组织病理学改变为内淋巴腔积水。临床表现为突然发作的眩晕，多为旋转或摇晃型。伴自发性眼震及植物神经症状，眩晕一般持续数秒至数分钟，很少超过12日。初期为波动性听力减退，继后有下降趋势。间歇期可完全或部分恢复。发怍次数越多，听力损失愈重。波动性耳鸣，多为低频率吹风样。亦有相当一部分病人的临床表现并不典型。西医治疗方法：由于对此病基本病理

3、和发病机制的认识还很不全面，因此很难设计出满意的药物和手术治疗，至今药物无多进展。（1） 一般治疗以调节植物神经功能，改善耳蜗微循环和解除膜迷路积水为主（2）手术治疗应用药物保守治疗6个月以上症状不能缓解单侧梅尼埃病可考虑手术，包括颈交感神经神经切断术；内淋巴囊手术；内淋巴 外琳巴分流；前庭神经切断术；选择性迷路破坏术等。存在的问题：根据“无痰不作眩”、“无瘀不作眩”、“无风不作眩”、“无虚不作眩”的理论总结出的镇眩汤，在临床上治疗梅尼埃病取得了良好的效果。但是镇眩汤的具体作用机制并不清楚。解决问题的思路：相关报道提示大鼠给予血管加压素1周后可诱导内耳淋巴积水。而且与正常人相比，梅尼埃病患者的

4、血管加压素水平在急性发作前后均升高。本实验通过阻塞前庭导水管的方法复制梅尼埃病模型，观察大鼠用药前后听觉诱发电位听阈的变化及大鼠血浆中血管加压素的含量，确定镇眩汤治疗梅尼埃病的机制与其调节血浆血管加压素是否有关。参考文献：1 牟忠林，韩德民，汪若峰实验性膜迷路积水的造模方法及其特点J国外医学：耳鼻咽喉科学分册，2004，28(4)：1941962 Paparella MMBenign paroxysmal positional vertigo and other vestibular symptoms in M6ni6re diseaseJEar Nose Throat J，2008，87(1

5、0)：5623 冯勃梅尼埃病病因及发病机制的研究进展实用医学杂志,2005,21(2)：118 4 陈学习，张英杰.梅尼埃病动物模型研究进展与思考，中国医药导刊，2009,11（11），1893-20025 Barrett LK ，Singer M ，Clapp LHVasopressin：meehanisms of action on the vasculature in health and in septic shockJCrit Care Med，2007，35(1)：33406 Treschan TA，Peters JThe vasopressin system：physiology

6、 and clinical strategiesJAnesthesio1ogy，2006，105(3)：599612，6396407 黄兆胜中药学M北京：人民卫生出版社，2002：8183二、实验设计方案（实验设计目标,拟解决的主要问题, 实验动物设计,实验专业设计，实验统计设计,实验方法设计，可行性分析,预期结果，实验设计工作时间安排）。（一）实验设计目标，拟解决的关键问题设计目标：探讨中药复方镇眩汤治疗梅尼埃病的机制，从而探讨镇眩汤治疗梅尼埃病的机制与其调节血浆血管加压素是否有关。拟解决的关键问题：梅尼埃病模型的建立；梅尼埃病模型进行分组与实验资料的统计分析。（二）实验设计1、实验动物设计

7、我们选用Glatthaar豚鼠作为实验动物，有以下几点理由：1）、豚鼠听觉灵敏且其颞骨与人类颞骨相似. 2）、豚鼠耳壳大，存在明显的听觉耳动反射。耳窝对声波极为敏感，特别是对 700 2000周/秒的纯音最敏感。所以豚鼠常用于听觉和内耳疾病的研究3）、Glatthaar豚鼠市场上最常见也很便宜。2、实验专业设计选用清洁级健康，鼠龄68周，体质量(2O0±20)g，且耳镜检查耳廓反射正常，双耳耳膜完整，耳廓反应灵敏，无眼震，排除中耳疾患的Glatthaar豚鼠48只作为实验对象。采用阻塞前庭导水管的方法复制梅尼埃病模型，给予真性手术与假性手术处理，探讨真性手术与假性手术后Glattha

8、ar豚鼠听觉诱发电位听阈的变化及大鼠血浆中血管加压素的含量 。观察：各组豚鼠脑干诱发电位测定听阈（dbl）; 各组豚鼠血浆中血管加压素含量（pg/ml）实验指标。3、实验统计设计在科研实验统计设计中我们应始终贯彻随机、对照、重复三大原则。（1）随机：选清洁级健康，鼠龄68周，体质量(2O0±20)g，耳镜检查耳廓反射正常，双耳耳膜完整，耳廓反应灵敏，无眼震，排除中耳疾患的Glatthaar豚鼠48只，将48只Glatthaar豚鼠按体重由小变大编号后，从随机数字表中查取随机数字，依次抄录于豚鼠编号下预先规定，随机数字从11行第一个数字开始接着抄写48个，按照能被6除的规律：不余到A组

9、，余1到B1组，余2到B2组，余3到B3组，余4到B4组，余5到B5组，,每组8只。动物编号：1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20.48随机数字：57 35 27 33 72 24 53 63 94 09 41 10 76 47 91 44 04 95 29所属组别：B3 B5 B3 B3 A A A B3 B4 B5 B4 B4.B5以上不难看出各实验组与对照组数量各8只与动物编号，更有利用我们实验的进行。以便我们2周后在实验组与对照组各取实验动物进行观察指标的测定。（2）对照：本课题的研究我们采取了真性手术与假性手术之间的对照

10、。（3）重复：本实验采用的是每实验小组有8只豚鼠，具有一定的重复性。（4）统计数据收集：本实验搜集计量资料，初步确定对各组实验数据的比较分为实验值和基础值比较。表1-1 用药前后各组豚鼠听觉诱发电位听阈比较(±s ) 组别 n 听阈/dBL 用药前 用药后A假手术 8B1模型 8B2倍他司丁 8B3镇眩汤低剂量 8B4镇眩汤中剂量 8B5镇眩汤高剂量 8表1-2各组豚鼠血浆中血管加压素含量比较(±s)组别 n 血管加压素含量/（pg/ml）A假手术 8B1模型 8B2倍他司丁 8B3镇眩汤低剂量 8B4镇眩汤中剂量 8B5镇眩汤高剂量 8（5）统计数据分析本实验所得到的资料

11、为计量资料，并且实验组与对照组为两个独立的样本，所以2个周实验组与对照我们采用t检验来表示。B1、B2、B3组模型行两样本比较t检验，均以0.05作为显著性检验水准，如B1与B2组之间模型形成时间的比较，其方法如下：（1）建立检验假设H0： = （实验组于对照组豚鼠听觉诱发电位听阈和血浆血管加压素相等）。H1： 、 不等或不全相等，0.05。（2）计算统计量 X=(X1+X2+X3+Xn)/nµ=(Xi-X)2/(n-1) t=（x-u）/Sx( 3 ) 查t值表，确定P值，得出结论。4、实验方法设计实验技术路线豚鼠（左耳阻塞前庭导水管，右耳正常） B2倍他司丁组（倍他司丁混悬液（0

12、9 mgml）予倍他司丁混悬液灌胃B4镇眩汤中予镇眩汤(30gm1)灌胃B3镇眩汤高组予镇眩汤 (60 gm1)灌胃 B1模型组生理盐水灌胃A组假手术组，生理盐水灌胃B5镇眩汤低组予镇眩汤 (15 gm1)灌胃A组听觉诱发电位听阈和鼠血浆中血管加压素含量听觉诱发电位听阈和鼠血浆中血管加压素含量听觉诱发电位听阈和鼠血浆中血管加压素含量听觉诱发电位听阈和鼠血浆中血管加压素含量听觉诱发电位听阈和鼠血浆中血管加压素含量听觉诱发电位听阈和鼠血浆中血管加压素含量实验技术方法（1）随机抽样：随机清洁级健康，鼠龄68周，体质量(2O0±20)g，耳镜检查耳廓反射正常，双耳耳膜完整，耳廓反应灵敏，无眼

13、震，排除中耳疾患的Glatthaar豚鼠48只。分别编号，再随机分成A组B1组B2组B3组B4组B5组六组。详细见上动物分组。（2）实验分组：B1组B2组B3组B4组B5组为实验组，给予手术处理；A组为对照组，给予假手术处理。（3）实验手术：称重，编号随机分为镇眩汤高(60 gm1)、中(30gm1)、低剂量(15 gm1)组，倍他司丁组(倍他司丁混悬液09 mgm)，模型组和假手术组，每组8只，自由饮食。手术4周后评价模型是否复制成功。假手术组手术时以见到乙状窦后为止。以上各组均选左耳为手术耳，右耳为对照耳。镇眩汤高、中、低剂量组分别以相应浓度的药物灌胃，倍他司丁组给予倍他司丁混悬液灌胃，模

14、型组和假手术组给予生理盐水灌胃。共2周。麻醉，用l0%水合氯醛溶液按40 mlkg腹腔注射麻醉，然后将豚鼠固定在动物手术台上；豚鼠处于深麻醉后，将动物专用电极用乙醇无菌操作后晾干，刺入相应位置。采用美国智听公司Smart EP诱发电位系统测试，测试软件版本号为383。测试参数：声刺激为“单击”短声，强度8O声压级(soundpressure level，SPL)，刺激频率10次s，带通滤波1003 000 Hz，观察时程20 ms，叠加次数1 000次，耳机固定于距外耳道口05 cm。采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒检

15、测豚鼠血管加压素，严格按照试剂盒说明书操作。（4）模型复制：六组豚鼠都要复制梅尼埃病模型。方法：豚鼠麻醉后行颅顶正中切口，磨去术侧枕骨暴露硬脑膜及乙状窦，剥离硬脑膜至乙状窦前缘，在前庭导水管颅内开口处切断内淋巴囊。再用微电钻沿前庭导水管方向钻人，破坏骨内部分淋巴囊和部分内淋巴导管，然后填以骨蜡、明胶海绵，缝合切口。模型复制成功的标准：出现眼震，行走不稳，不停摆头，脑干听力诱发电位示听阈下降。具备其中之一即可。（5）处理措施：1）实验动物的饲养：单笼饲养，每天给予含有青霉素注射液喂养，防止感染；由于豚鼠不能合成维生素C，因此，饲料中一定要注意维生素C 的补充；注意饲料及青草蔬菜的来源和卫生质量；

16、饲料中粗纤维的含量应不低于30；温度应控制在1829的范围内，湿度40702）观察指标测定前准备：检查各种所需要的仪器设备是否完好，用一只正常Glatthaar豚鼠做一次指标的测定，检查仪器设备性能状况。4）实验数据的收集整理：（三）可行性分析:1、Glatthaar豚鼠来源方便，容易侍养，在科研工作中被广泛利用。2、实验操作简单，可在实验室完成。3、复制模型时间短，药品镇眩汤容易得到。（四）预期效果:与假手术组比较，模型组大鼠听觉诱发电位听阈和血浆血管加压素水平显著升高；与模型组比较，镇眩汤高、中剂量组大鼠听阈和血管加压管水平显著降低(P<O05)。镇眩汤治疗梅尼埃病的机制与其调节血浆

17、血管加压素有关。（五）实验设计工作时间安排:1、第1天，准备实验器械，药品，动物，并将动物随机分成六组，编号。2、第2-16天完成实验动物模型制备。3、进行对照组和实验组的实验，记录数据并分析计算，得出结论。4、单笼饲养，每天给予含有青霉素注射液喂养，防止感染。补充维生素和粗纤维。三、完成实验条件： 1、仪器设备情况：鼠台，针头，注射器6只。，动物手术器械，婴儿磅秤，美国智听公司Smart EP诱发电位系统、微电钻2、实验动物情况：清洁级健康，鼠龄68周，体质量(2O0±20)g，且耳镜检查耳廓反射正常，双耳耳膜完整，耳廓反应灵敏，无眼震，排除中耳疾患的Glatthaar豚鼠，数量4

18、8只。3、药品试剂来源：茯苓、桂枝、白术、甘草、熟地黄、白芍、当归、川芎、泽泻各10g。倍他司丁(卫材药业有限公司)青霉素。双氧水。生理盐水。l0%水合氯醛溶液。乙醇。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂、骨蜡、明胶海绵。4、价格估计茯苓 20元/斤 桂枝：广西玉林药材市场 、2.80元/kg 白术：广西玉林药材市场、14.00元/kg甘草：四川荷花池药材市场、16.5元/kg 熟地黄：安徽亳州市中药市场、10.5元/kg白芍：四川荷花池药材市场、19.00元/kg当归：广西玉林药材市场 、26.00元/kg川芎：四川荷花池药材市场 、12.20元/kg泽泻 ：四川荷花池药材市场 、9.00元/公斤青霉素:2.5元/一盒双氧水：8元一瓶祥恩吸