实验三血清清蛋白的分离及电泳鉴定

1、实验二 血清清蛋白的分离及电泳鉴定一、实验目的1. 掌握盐析法、凝胶层析、分离提纯蛋白质的原理和方法。2. 掌握醋酸纤维薄膜电泳分离蛋口质的原理和方法。二、实验原理血清蛋白主要由清蛋口和球蛋口组成，各行使其重要的功能。本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离，并用电泳技术观察蛋 白质分离教果。1. 蛋£1质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：水化膜和表 面电荷。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出， 蛋白质分了沉淀析出的方法很多，根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、冇机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。盐析法是以中性盐如硫 鞍(n

2、hj2so4)等对蛋白质作用破坏蛋白质表面水化膜而使蛋白质相互聚集而 析出。不同的蛋£1质沉淀需要的中性盐浓度不同，在不同盐浓度下，蛋口质溶解 度不同。球蛋白在半饱和状态下发生沉淀，而请蛋白在完全饱和状态下沉淀， 利用此特性可把蛋口质分段沉淀卜來，此种盐析法称分段盐析。盐析后蛋片质沉淀经水溶后，最人特点是保持蛋白质生物学活性，因此，盐 析法是研究蛋白质分子的结构和功能的最常用方法。除盐析法，有机溶剂沉淀法、 等电点沉淀法、柱层析法和超速离心法等也是蛋口质分离的常用方法。2. 水溶后的蛋白质含冇高浓度屮性盐，需耍冇脱盐过程去除蛋白质遗留的 中性盐，常用方法有：透析法脱盐和凝胶层析法脱盐

3、。本实验采用凝胶层析法脱 盐，在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子 量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流 动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱；反之，盐的分子量较 小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱 的时间较后。分段收集蛋口质洗脱液，即可得到脱盐的蛋口质。3. 蛋白质分离效果可用电泳方法检测，根据电泳图谱与未分离前蛋白质溶 液和标准蛋白质比较，判断蛋白质的分离纯化的效果。电泳法是指带电荷的供试品(蛋白质、核苜酸等)在惰性支持介质(如纸、 醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中，

4、于电场的作用下，向其对应 的屯极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方 法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。醋酸纤维素是指纤维素的轻基 乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄 膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳屮出现的“拖尾'现象，又因为 膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导， 所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少。血清蛋白各组分在ph8.6缓冲液的介质屮所带负电荷的数量不同各组分的 分子量大小不同，向正极泳动速度不同而分离开。三、实验器材和试剂1. 器材：10ml具塞刻度试管

5、、离心管、小试管、5ml吸管、滴管2支、培 养皿3套、醋酸纤维薄膜、点样器、电泳槽、电泳仪、1.0x20cm层析柱。2 试剂：(1) 葡聚糖凝胶 sephadex g-25：称 10g sephadexg-25,加 200ml 0.02mol/l ph6.5磷酸盐缓冲液溶胀24小时。(2) 生理盐水：称取分析纯nacl 0.89g,蒸徭水稀释至looml(3) 饱和硫酸钱溶液：25°c时称取(nh4)2so4约767g,溶解至1000ml蒸憎水 中，至不能完全溶解为止，即为饱和硫酸镀溶液。(4) 巴比妥缓冲液(ph 8.6)：称取巴比妥钠15.458g.巴比妥2.768g,蒸馅水 定

6、容至 l()()()ml。(5) 氨基黑10b染色液：称取氨基黑10b 0.5g,加入100ml漂洗液不断振摇, 直到完全溶解。(6) 漂洗液：取95%乙醇450ml,冰醋酸100ml,混匀后，用蒸徭水稀释到 1000ml o四、实验操作(%1) 盐析沉淀蛋h质:取10 ml具塞刻度试管1支,加入血清溶液2.5ml,缓慢加进等量饱和 (nh4)2so4溶液，充分摇匀，见有沉淀析出，静置lomin,用双层滤纸过滤，弃去沉淀，取滤液。(%1) 凝胶层析脱盐：取已溶胀的sophadex g-25装柱(柱体积约150ml,注意一气呵成，无分层),待柱屮液面降至凝胶面吋，取lml滤液加样，待柱屮液面再次

7、降至凝胶面，加蒸憾水，用蒸徭水洗脱，流速为20滴/min,分管收集，每管10滴，每管流出液取出二滴用10%三氯醋'检测，有沉淀出现者即为蛋白质洗出管，取对应沉淀最多的收集管用于电泳鉴定。继续用蒸镉水洗柱，流出液用l%bacb检测，直至无 白色沉淀出现后，洗柱完毕关闭出口。(%1) 醋酸纤维薄膜电泳鉴定蛋口质分离效果:(1) 取醋酸纤维薄膜一片(4x8cm),在薄膜无光泽而距一端1.5cm用铅笔划一 线作点样位置，将薄膜浸入ph8.6巴比妥缓冲液中，待完全渗透后取出用滤纸吸 干表面水分。(2) 点样：用点样器蘸蛋白质透析液印在点样线上一侧，另一侧蘸血请作对 照用。(3) 电泳：将点样后薄膜条置于电泳槽屮，点样端置于负极，在醋纤膜两端 搭桥，连接缓冲液，平5 min ju通电，以电压120 v,通电约45 min。(4) 染色：用银子将电泳后薄膜取出，直接浸入盛有氨基黑10b染色液培养 皿屮染色5 mine(5) 漂洗：将薄膜从培养皿中取出，用漂洗液漂洗，中