小鼠HMGN2干扰质粒psilencecmv41HMGN2构建及体内干扰效果鉴定

1、小鼠 hmgn2 干扰质粒 ps i i encecmv 4. 1hmgn2构建及体内干扰效果鉴定作者：韩琴邓璐霞赵静昊桂霞曹坍范波李夏陈善泽高祥黄宁【摘要】目的：构建小鼠hmgn2干扰质粒psilence cmv 4. 1hmgn2,以进一步明确hmgn2的生物学作用。方法:将hmgn2 shrna 片段退火后与小鼠ps订ence cmv 4. 1链接，饲养孕小鼠，尾静脉 注射法导入shrna表达质粒，提取85d胚胎rna,用rt pcr检测 胎hmgn2的表达量进行鉴定。结果：测序结果显示psilence cmv4. 1 hmgn2干扰质粒构建成功,rt pcr结果显示hmgn2在&

2、; 5d 胎儿表达较高广泛表达，且psilencer cmv 4. 1 hmgn2尾静脉 注射后有明显的抑制效果。结论：成功构建对8. 5d胎鼠hmgn2基因具 有显著干扰效率的psilencer 4. 1 hmgn2干扰质粒，为进一步研 究hmgn2基因的功能打下了基础。【关键词】hmgn2;psilencerc mv 4. 1 hmgn2hmgn2是染色体的构组成分，可能与维持dna分子的构型、基因 的活化有关。人类基因组中有多个与hmgn2的cdna具有相同序列的拷 贝，目前认为拷贝数达35-50个z多1,也就是说hmgn2的编码基因 属于一多基因家族，而这一多基因家族的人多数成员是不表

3、达蛋白质 的假基因，属于加丁过的假基因(processed pseudogene) o这种多基 因家族一般是细胞功能调节的关键性基因，常被称为看家基因 (housekeeping gene) 2, 3。冃前通过人鼠基因杂交的方法发现人类 hmgn2多基因家族屮的功能基因仅有一个，它定位于一号染色体 1p36. l4o全长3450bp,由六个外显子构成，其基因上游是富含 gc(75%)的区域，另外其上游启动了区域包含一个“htf”岛以及在其 他看家基因中常见的调控序列5, 6o此外，hmgn2基因的编码序列在 各物种中具有高度的保守性，例如：人与牛和鸡的同源性分别达96% 和92%,这一切说明h

4、mgn2基因具有看家基因的特点，可能在生物的 进化和细胞功能中起到重要作用。目前对hmgn2功能的认识尚不完善，众多学者比较一致的观 点是hmgn2可能与dna的复制与转录活性有关7。早在上世纪八十年 代swerdlow和stein等人8就提出hmgn2与核小体结合，能稳定核 小休核心小体(core particle)的空间构象使之更容易被dnase i消 化。些实验结果表明iimgn2具有消除染色体结构阻碍性的牛物活性。 尽管对于hmgn2的作用机制研究日益加深，但迄今为止对其的认识仍 很有限。本研究旨在通过小鼠hmgn2 t扰质粒ps订encecmv 4. 1hmgn2构建及干扰效果鉴定，

5、进一步明确hmgn2的生物学作用，深 入阐明其调节转录的分子机制以及对于其他基因表达的调控作用机 制。1材料和方法1.1材料及试剂表达质粒psilence cmv 4. 1, pegfpn1 质粒购自 clontech 公司（usa） ort pcr试剂盒,t4连接酶，胶回收试剂盒（takara公司）; 质粒提试剂盒（赛百盛公司）；dna重组所用的各种限制性内切酶（晶美 公司）；提取及纯化细胞总rna所用trizol.逆转录试剂盒 （invitrogen,美国）；连接试剂盒（上海生工）。氨节青霉素（amp） 卡 那霉素（kana）（华北制药厂）,宿主菌ecol i dh5 a由本室保存。bca

6、 蛋口提取试剂盒（南京凯基生物有限公司）,omega去毒素提取试剂盒, western blot所需缓冲液（成都宝信生物耗材有限公司），hmgn2以及 组蛋白抗体（santa cruze, usa） o1.2方法1.2. 1设计hmgn2的干扰序列设计2对长度为19 bp的小rna干扰片断，其屮序列1、2 为候选的有效干扰片断，阳性对照以及阴性对照，所有片断均通过 blast软件验证其正确性。合成的互补dna序列以备定向克隆入 psi.lence cmv 4. 1 hmgn2干扰序列1、2如下所示：正义链5'gatcctctgcgaggttgtctgctattcaagagatagcag

7、acaacctcgcagatca 3'反 义 链：5'agcttgatctgcgaggttgtctgctatctcttgaatagcagacaacctcgcagag 3'序列 2： 正义链 ：5'gatccaaatggagatgccaaaacattcaagagatgttttggcatctccattttca 3'反 义 链：5'agcttgaaaatggagatgccaaaacatctcttgaatgttttggcatctccatttg 3'1.2.2 构建小鼠 psilencecmv 4. 1 hmgn2 质粒室温下用0. 5ml无菌小离

8、心管中建立退火缓冲液反应体系，95°c水浴孵育。离心,温和翻转混匀，制备成50um双链dna。取载体 psilencecmv 4. 1 10u 1分别使用bamhi和hidlll双酶切,takara的胶冋收试剂盒冋收，取双链产物5u 1,加水至体积为10n 1,充分混匀，16°c过夜。采用cac12法常规制备dh5a感受态宿主菌，转 化dii5a感受态宿主菌，涂布于含有kana的lb培养基平板，37°c培养过夜。选数个菌落接种丁 3 ml含amp的lb液体培养基中，固定于37°c 摇床上，震荡培养。离心、收集菌体，提取并纯化质粒，pcr鉴定。1.2.3尾

9、静脉注射法导入sirna表达质粒健康5周龄昆明雌性小白鼠。每只腹腔注射pmsg 5u, 42-48h 后注射相同剂量的hcg,与雄鼠按1 : 1的比例合笼。次日早晨检查雌 鼠阴栓，见阴栓日中午记为0. 5dpc（days post coition,交配后天数）。 将妊娠雌鼠随机分组，每组10只，常规饲养待用；提取ps订encer cmv 4. 1 hmgn2和ps订encercmv 4. 1去内毒素质粒，检测浓度与纯度，保存待用。妊娠& 5d的母鼠随机分成3组，分别为psilencer cmv4. 1 hmgn2组、ps订encer cmv 4. 1组和空白对照组（给予同 剂量的生理盐

10、水）o sirna表达质粒或同等体积（100-200 u 1）的生理盐 水从尾静脉注入孕鼠体内。psilencer cmv 4. 1 hmgn2组或 psilencer cmv 4. 1组于妊娠5. 5d的时期分别给予尾静脉注射 ps订encer cmv 4. 1 iimgn2 或 ps订encer cmv 4. 1 iimgn2 40 ng,于8.5dpc将雌鼠以脱颈处死，迅速分离子宫，取出胚胎，提 取胚胎rnao1. 2. 4胎鼠hmgn2表达量的测定采用半定量rt pcr和western blot检测胎鼠egfp的表达里。2结果2. 1 干扰质粒 psil ence cmv 4. 1 h

11、mgn2 egfp 测序 鉴定经takara公司测序，序列同设计引物双链序列一直，可进行 后续试验（如图1）。图1干扰质粒ps订encecmv 4. 1 hmgn2 egfp测序图图28. 5d胚胎组织总rna电泳2. 2 rna质量鉴定&5d胚胎的提取总rna, 1%琼脂糖电泳鉴定显示条带清晰。 紫外分光光度计测定光密度值，0d260/0d280比值均高于1. 9。确定各 样本总rna未降解，可进行下一步实验（如图2）。2. 3 rt pcr 以及 western blot 检测 hmgn2 的表达rt pcr电泳结果显示hmgn2在8. 5d胎儿呈现较高广泛表 达，且ps订ence

12、r cmv 4. 1 hmgn2尾静脉注射后有明显的抑制 效果，抑制效果达到了原有表达量的70%（如图3） o图3 rt pcr对hmgn2表达情况的测定3讨论在较早以前的染色体异常的研究资料就表明：1p远端区域的 染色体异常与一些恶性疾病及细胞的异常生长有关，而hmgn2基因定 位于1p36. 1,1p36这一区域的染色体异常与多种肿瘤的发生有关9。 有一些实验数据显示hmgn2可能与一些恶性疾病（如一些肿瘤、口身免 疫性疾病如系统性红斑狼疮、混合性结缔组织病、青少年风湿性关节 炎等）的发生有关10： sle病人的自身抗体能与hmgn2反应，这一发 现提示iimgn2在这类自身免疫疾病的发生

13、发展中可能是一重要靶位。冃前已有一些研究资料表明：hmgn2在胚胎发育及器官发生 中起重要作用。mohamed和bustin等人11将hmgn2的反义寡核昔 酸注入人鼠单细胞受精卵中，可以检测到hmgn2蛋白在双细胞及四细 胞阶段的缺失，以及相应的单细胞分裂成双细胞、双细胞分裂成四细 胞胚胎的延迟。另外人工合成的hmgn2的dna结合区多肽注入双细胞 胚胎后，可以延迟其进入四细胞阶段。lehtonen等人12应用 northern blotting的分析方法发现：hmgn2的mrna在大鼠胚胎形成 中高表达，而在成熟大鼠的各种器官中表达水平较低;在组织学水平 上，hmgn2在各种分化组织屮表达

14、较高，而在成熟组织屮表达较低， 这意味着hmgn2的表达与细胞分化密切相关，hmgn2可以作为组织或 细胞在器官发生中正在分化的标志。近年来陆续有小型哺乳动物尾静脉高压注射于扰质粒达到理 想干扰效果的报道。已有一些研究表明，转染效率与注射体积和注射 速度无关，而与注射dna的剂量有关。并且有研究报道进一步指岀注 射5 u g质粒dna是比较合适的，超过25 » g质粒dna会造成小鼠中毒, 但在不引起中毒的剂量允许范围内加大质粒dna的注射剂量对提高转 染效率是有帮助的。本研究通过构建小鼠hmgn2 shrna表达质粒shrnal和 shrna2,在胚胎早期成功的干扰iimgn2表达

15、有助于我们进一步的研究 hmgn2在胚胎发育以及基因调节的重要作用。【参考文献】1 landsman i), soares n, gonzalez fj, et al. chromosomal protein iimg 17. complete human cdna sequence and evidenee for a multigene familyj. j biol chem, 1986, 261 (16): 7479-7484.2 srikantha t, landsman d, bustin m. retropseudogenes for human chromosomal prot

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19、271 (20) : 12009-12016.8 swerdlow ps, varshavsky a. affinity of hmg17 for a mononucleosome is not influenced by the presence of ubiquitinh2a semihistone but strongly depends on dna fragment size nucleic acids res. 1983 jan 25;11 (2):387-401.9 spieker n, beitsma m, van sluis p, et al. an integrated5 mb physical, genetic, and radiation hybrid map of a lp36 1 region implicated in neuroblastoma pathogenesis j genes chromoso