实时定量PCR课件

1、1实时定量PCRReal-Time Quantitative PCR梁沛中国农业大学昆虫学系2主要内容n基本原理n几个概念n绝对定量n相对定量n常见问题3一、基本原理4发展简史1993年，日本Higuchi 等人首次采用动态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量PCR技术的概念。荧光染料：EB（溴乙锭）PCR仪：改良的热循环仪激发光：UV射线检测器：CCD相机缺点：仪器耗费巨大；非特异产物导致定量不准确5发展简史n1995年美国PE公司成功开发TaqMan技术n1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等6实时定

2、量PCR的概念n实时定量PCR技术（real-time quantitative PCR）是指在PCR反应体系中加入，通过监测荧光信号的累积实时监测整个PCR进程，并利用特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。789两种荧光标记法n染料染色-SYBR Green I-EBn探针标记-Tagman-Tagman MGB-分子信标10SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm11化学原理12染料法的优缺点：n实验设计简单，仅需要设计上下游一对引物，不需要设计探针，通用性好；n成本低；n可通过分析检验扩增产物的特异性。n在低通量实验和单重实验时一般优先考虑使

3、用SYBR Green I染料法。 13染料法的优缺点nSYBR Green I方法对PCR扩增特异性要求较高SYBR Green I 可与所有的双链 DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性nSYBR Green I 不能区分不同扩增子发出的荧光而导致它不能用于多重反应 1415Tagman ProbeQuencherReporter16Tagman probe 的工作原理17探针与PCR产物的数量关系n每产生一个新的DNA片段，就切断一条探针n每切断一条探针，就产生一个单位的荧光信号n信号强度与DNA的copy数成正比18探针法的优缺点

4、nTagman探针法中，除引物外，还使用了一条特异的探针，因此此方法可以特异的检测目标序列，防止非特异产物的干扰影响定量的准确性n可用于多重反应，即可同时检测多个目的基因。n但探针设计成本较高，有时探针设计困难。 19二、几个概念201.扩增曲线n描述PCR动态进程的曲线即扩增曲线。nPCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S型曲线（图3） CyclesFluoresces211.扩增曲线n扩增曲线分三个阶段：扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起

5、始DNA拷贝数。，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可选择该阶段进行定量分析。 222.荧光阈值n一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。n是人为设定的一个值，可设在指数扩增阶段任意位置上。n缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（自动）。232.荧光阈值n常采用手动设置，原则：大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是超过域值的荧光信号。243.Ct值nCycle threshold，所谓Ct值就是当扩

6、增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。线性图谱半对数图谱25Ct值的重现性263.Ct值nCt值与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，达到阈值所需的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。n正常的Ct值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。 2728Ct值定量的数学原理29Ct值定量的数学原理30Ct值定量的数学原理31Ct值定量的数学原理0.000.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840CycleRnThreshold10410310232靶标基因的定量33靶标基因的定量500010000

7、1234靶标基因的定量CYP6B6Actin35三、绝对定量36三、绝对定量37三、绝对定量38三、绝对定量1.化学合成目的基因，是纯度高、定量准确，是受化学合成工艺限制，只能合成120bp以下的长度；2.用回收纯化后的PCR产物3.将PCR产物克隆到载体上，然后抽提出质粒，经过测量浓度和拷贝数的换算，可准确定量，是稳定、准确。39三、绝对定量40三、绝对定量(ss DNA, 660 for ds DNA)41三、绝对定量n3000 碱基质粒，浓度100 ng/ul nMW= 3000 bp x 660 dalton/bp =1.98 x 106 daltons，即1 mol =1.98 x

8、106 g。ncopy数 - 3x 1010 copies/ul100ng1.98 x 10642绝对定量举例Copies/ul Ct 1Ct 2Meant CtSTD510328.1828.6428.410.16510425.2525.1425.190.04510522.1122.4622.280.12510618.6318.9218.770.10Blank43绝对定量举例扩增效率（扩增效率（E）计算）计算E=10-1/斜率斜率 =10-1/-3.18 =2.06E%=(2.06-1) 100%=106%44绝对定量举例n如未知样本Ct为20.5，将Ct值带入线性方程：n20.5= -3.1

9、83 X + 40.211nX=（20.5-40.211）/-3.183 =6.19n未知样本拷贝数=106.19=1548816 copies/ul45四、相对定量n无需知道目的基因的绝对拷贝数 1. 模板均一性问题模板均一性问题：起始的细胞数、细胞的状态、均一性等 2. RNA制备制备：RNA纯化得率、均一性等 3. 反转录反转录：反转录的效率等46内标/内参照n因因RNA纯化后得率不同、纯化后得率不同、RNA反转录为反转录为cDNA的效率的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同。不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同。因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因此

10、，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因（因（house-keeping gene）来标准化，以校正因样）来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。品初始浓度不同而造成的差异。n常用的看家基因有：常用的看家基因有：GAPDH、Beta-actin、18S rRNA等等47相对定量的方法n双标准曲线法双标准曲线法nCt法法48双标准曲线法n优点：优点：分析简单，实验优化简单。n缺点：缺点：对每一个基因每一个基因，每一轮实验每一轮实验都必需做标准曲线；必需有固定的标准品做标准曲线；这些标准品并不代表样品扩增的真实状态比如标准品为质粒或纯化的PCR产物，而待测样品为cDNA，那么标准曲线的

11、扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况。n应用应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一。处理组处理组目的目的基因浓度基因浓度处理组处理组参照参照基因浓度基因浓度对照组对照组目的目的基因浓度基因浓度对照组对照组参照参照基因浓度基因浓度相对表达量相对表达量49Ct法法nCt，即，即Ct的变化值的变化值n假定目的基因和参照基因的扩增效率相同，均为假定目的基因和参照基因的扩增效率相同，均为100%2- （Ct1- Ct2）50Ct法法举例举例Cyp6B6 ave Ct18S RNA ave Ct标准化的Cyp6B6 Ct校正Ct对照组对照组24.512.611.90处理组处理组22.

12、812.310.5-1.451Ct法法n优点：优点：优化的体系建立后，每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。n要求：要求：标准曲线斜率差值E=1，2.3 倍差别E=0.9，2.2倍差别E=0.5，1.6倍差别53Pfaffl法M.W. Pfaffl, Nucleic Acids Research 2001, 29(9):e45n目标基因和参照基因扩增效率不同，但目标基因间的扩增效率相同。需计算目标基因和参照基因扩增效率。 E=10-1/斜率斜率54SYBR法常见问题及注意事项n实验流程样品准备RT建立反应体系上机数据分析55样品准备RNAn提取

13、RNA所用不同处理组的虫量一致，且具有代表性n所有操作尽可能一致n保证无RNase的环境n利用分光光度法确定所提核酸的质量和浓度：纯度：OD260/OD280=1.8 2.020 uL的反应体系最多可以将0.4 ug 总RNA反转录成cDNA；1 100 ng RNA反转录所得cDNA加1uL/rxn56样品准备DNAnDNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之间nDNA用量：0.05 ng 100 ng样品准备的惟一目标：57Reverse Transcription1、根据下游反应数确定、根据下游反应数确定RT反应体积反应体积2、试剂应统一，尤其是反转录酶、试剂应统一，尤

14、其是反转录酶3、引物：、引物：Oligo dT、随机引物、随机引物4、RNA到到cDNA的转换效率一般的转换效率一般70%高效、全长的高效、全长的cDNA58建立反应体系n做普通PCR、跑核酸电泳的枪严禁用于定量PCR！n加buffer、引物和水在独立房间n加模板在另一房间n加模板和其它反应物的移液枪要严格区分，不能混用！n增大模板的加样量，以减少孔间误差。n使用mix以减少系统误差；每个样品至少3个重复59样品设置6061626364引物设计及评价引物设计的基本原则： 1) 避免重复碱基，尤其是G. 2) 引物的退火温度要高，一般要在60度以上3）GC=30-80%. 4) 3端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C. 5) 正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。 6) PCR扩增产物长度： 不要太大，一般在80-250bp之间都可；80150 bp最为合适（可以延长至300 bp）.65引物设计及评价n做溶解曲线Dissociation curve66引物设计及评价67SYBR法常见问题及注意事项特异性扩增产物特异性扩增产物非特异性扩增产物非特异性扩增产物引物二聚体引物二聚体68探针设计原则n探针位置尽可能地靠近上游引物，扩增片段长度在50150bp范围内； n探针长度通常在2030bp，Tm值在6570，通常比引物Tm高510