丙酮酸激酶在埃博霉素合成中的应用

1、第一章 绪论1.1埃博霉素介绍1.1.1简介随着人类受恶性肿瘤的威胁逐年增加，新颖抗肿瘤药物的研发迫在眉睫。埃博霉素类药物是一种微生物来源类药物，具有微管稳定作用，其选择性高、活性强、毒性较低，有望取代紫杉醇成为新一代抗肿瘤药物，具有巨大的市场前景。埃博霉素(epothilone)是一类由纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)产生的具有抗肿瘤活性的大环内酯类化合物。与传统的抗癌药物紫杉醇的抗肿瘤机制一样，但埃博霉素的分子结构简单、水溶性好、毒副作用较小、抗肿瘤谱较广，能够更好地抑制肿瘤细胞的增殖，并且埃博霉素可发酵生产，是一种具有广阔开发潜力的新型抗肿瘤化合物。因此，自从199

2、5年发现埃博霉素的抗癌活性后，其得到了包括生物学、化学、医药学等多方面的广泛而深入的研究。 由美国施贵宝公司开发的埃博霉素B内酰胺衍生物Ixabepilone（商品名伊沙匹隆），于2007年10月16日获得食品药品监督管理局（Food and Drug Administration）批准在美国上市，这是迄今第一个上市的埃博霉素衍生物。主要的天然埃博霉素化合物   一些天然的埃博霉素从图可见，埃博霉素是16元环的一类大环内酯化合物，在C15位置连接了一个含噻唑环的侧链。由发酵制备时，埃博霉素A和B是主要产物，埃博霉素CF是次要产物，但可以CF经从A或者B一步反应可以

3、得到可以。埃博霉素A、B和D对癌细胞的生物活性可以和紫杉醇媲美，甚至更强，尤其是埃博霉素B，其活性比紫杉醇强10100倍。在C12位上的有甲基取代，以及C12C13双键换成环氧基团后，埃博霉素的活性得到极大地提高。埃博霉素的化学结构是由Sorangium cellulosum（黏细菌纤维堆囊菌）产生的次级代谢产物，其结构为16元内酯大环为中心体，噻唑环配基为侧链的一类细胞毒性化合物（如图）   埃博霉素的活性示意图   1.1.2应用埃博霉素的抗肿瘤作用机理与紫杉醇相似，即抑制微管解聚。埃博霉素在p-糖蛋白表达型的多药耐药性

4、肿瘤细胞系中显示很强的抗肿瘤活性，这种肿瘤细胞系紫杉醇是杀不死的，加之埃博霉素比紫杉醇有更好的水溶性，且毒副作用很小，被公认为21世纪最有效的抗癌药物。 由美国施贵宝公司开发的埃博霉素B内酰胺衍生物Ixabepilone（通用名为伊沙匹隆），于2007年10月16日由食品药品监督管理局（Food and Drug Administration）批准在美国上市，伊沙匹隆单药用于治疗蒽环糖苷类抗生素、紫杉烷衍生物和卡培他滨治疗无效的转移性或局部进展的晚期乳腺癌；可与卡培他滨联用用于治疗蒽环糖苷类抗生素和紫杉烷衍生物以治疗无效的转移性或局部进展的晚期乳腺癌，这是迄今第一个上市的埃博霉素衍生

5、物类药物。 2007年9月24日，施贵宝公司向EMEA提出在欧盟集中上市的申请，2008年11月20日，欧洲人用药品委员会（CHMP）对该申请做出负面裁定并建议其不上市，随后公司提出复审，直到公司主动撤回该申请时，CHMP的审查仍一直在进行。在致EMEA官方信件中，百时美施贵宝公司称撤回上市申请是由于他们在复审程序中提供的信息尚不足以改变委员会对伊沙匹隆做出利益小与风险的评价。  埃博霉素可能是目前所有药物中最为昂贵的品种，以美国施贵宝公司的埃博霉素B衍生物（伊沙匹隆）注射剂为例，15mg/支平均批发价（AWP）921.96美元，45mg/支的平均批发价（AWP）

6、2765.89美元，直至2008年销售收入已突破1 亿美元。 1.2丙酮酸激酶介绍1.2.1简介 丙酮酸激酶缩写式为ATP：丙酮酸-2-O-磷酸转移酶。在糖酵解系统里，它是催化形成第二个ATP反应的酶。能以磷酸烯醇（phosphoenolpyruv- ate）丙酮酸和ADP生成丙酮酸和ATPGo1-75kcal。除需要二价金属离子外（Mg2和Mn2）外，还需要一价金属离子（KRb，Cs），在生理上起作用的大概是K。分子量约25万。是催化ADP为ATP的形成，结果是形成丙酮酸的终产物。丙酮酸激酶催化磷酸烯醇丙酮酸酯和ADP转变成丙酮酸和ATP的磷酸基转移酶，是糖酵解过程中的主

7、要限速酶之一,因此丙酮酸激酶(PK)是糖酵解中的三大关键酶之一。在哺乳细胞株中，丙酮酸激酶有4种同工酶并呈组织特异性，分别为L型、R型、M1型和M2型，通常均以酶的活性四聚体形式存在，根据组织不同的代谢功能，它们具有显著的不同调控机制与动力学特性，其中L型主要存在于肝脏和正常肾脏的近曲小管；R型存在于红细胞；M1型主要存在于骨骼肌、心脏和脑；M2型主要表达于肺正常肾脏的远曲小管、胚胎和未分化或增生的组织。其中PKL 和PKR 由基因L 编码，通过不同的组织特异性启动子而分别表达于肝细胞和红细胞中。PKM1、PKM2 由M 基因编码，在转录过程中由前体mRNA 经不同选择性剪切的产物 ，PKM1

8、 的外显子为9，主要存在成熟组织如脑组织与骨骼肌，与PEP 底物的亲和力最高，不能被磷酸化和被别构化调控；PKM2 的外显子为10，其负责二聚体转化成四聚体的C 端56 个氨基酸与PKM1存在差别，主要存在一些分化组织、具有核酸合成特性的细胞中如胚胎细胞。但随着胚胎形成，PKM2 被不同组织的同工酶替代，有趣是，肿瘤形成过程，其它同工酶消失，PKM2 酶则高度表达，这给癌症治疗奠定新的生物基础。 研究表明，当恶性肿瘤发生时，PK的组织特异性同工酶(L型、R型、M1型PK等)表达减少，在癌基因编码的激酶作用下，M2一PK可在肿瘤细胞中呈过度表达并且其丝氨酸（Serine，Ser）和酪氨酸（Tyr

9、osine，Tyr）位点均发生磷酸化，使得原先具有高度活性的四聚体解离为无活性的二聚体形式，并占据主导地位，即TU M2一PKt”。1.2.2作用丙酮酸激酶M2一PK以四聚体形式存在时活性高，与底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)亲和力强，而以二聚体形式存在时则与之相反。TU M2一PK与PEP的亲和力很低，导致磷酸烯醇类物质的堆积，这有利于肿瘤细胞不是糖酵解供能而转向核酸合成的方向进行，此相对于糖酵解的过程，可称之为谷氨酸酵解过程，以保证细胞中的能量供给。细胞增殖是一个耗能过程，若细胞无限增殖，细胞会因能量供应不上而死亡。PK在阻止细胞死亡的调节中发挥着重大作用。PK催化PEP是其磷酸转移到二磷酸

10、腺苷(Adenosine diphosphate，ADP)或二磷酸鸟苷(Guanosine diphosphate，GDP)上，同时产生丙酮酸、三磷酸腺苷(ArIP)或三磷酸鸟苷(Guanosine triphosphate，GTP)，糖酵解过程中在PK的作用下导致能量的净生成。因此丙酮酸激酶可调控ATP：ADP和GTP：GDP的比率以及一磷酸腺苷、腺苷酸激酶、磷酸果糖激酶的水平。一磷酸腺苷水平的提高可以减少辅酶A、三磷酸鸟苷以及三磷酸胞苷合成，从而抑制DNA的合成和细胞增生。M2一PK通过这种机制来调控细胞增生以及能量的转换及供给。在肿瘤细胞中，M2一PK二聚体和四聚体的比例受肿瘤蛋白和能量

11、代谢介质的调节而产生变化，以达到适应肿瘤代谢的需要。研究表明，四聚体型与二聚体型M2一PK的比率由ATP、1，6一二磷酸果糖、丝氨酸（Serine，Ser）以及不同的癌蛋白(pp60v一8rc、HPV一16 E7)之间的相互作用来调控。在有足够氧气供应的实体瘤中，谷氨酸酵解提供大量的丙酮酸。这些谷氨酸酵解和糖酵解中产生的丙酮酸用来合成乳酸、谷氨酸和脂肪酸，从而释放出在糖酵解过程中甘油醛3一磷酸脱氢酶作用下产生的氢，进而保证肿瘤细胞中能量的供给。可见，TU M2一PK在肿瘤新陈代谢中是发挥及其重要的作用。1.3代谢调控1.3.1简介 在工业发酵领域,发酵微生物学家研究探索发酵微生物的调控机制,通

12、过控制器代谢调控使其高产具有商业价值的产物(如:某种代谢物、酶)，即达到最佳的调控效果，从而产生最大的经济效益 。解除微生物的调控机制可以通过营养控制或经典的基因手段以绕过或去除负调控而增强正调控机制来实现,可用方法有:诱导,碳源、氮源及磷酸盐的营养调控和反馈调控。 微生物代谢一般首先将高分子的碳源分解为小分子,然后转变为氨基酸、核苷酸、维生素、碳水化合物、脂肪酸,最后转变为蛋白质、酶、核酸、多糖、脂用于生长。通过发酵可生产用一般化学方法合成难度大或成本高的物质。微生物要生产出这些物质,首先必须合成大量的酶,然后使其协调发挥作用。微生物的代谢必须保证这种协调性,在代谢过程中仅生产所需的合适浓度

13、的酶。当生产出了足够量的这种特殊物质后,微生物通过其调节机制就不再合成与其相关的酶,且原有酶的活性降低。因此细胞是根据环境情况适量地生产代谢产物,这使得一个物种能同自然界中其它生命形式相竞争而生存下来。具有调控功能的一些重要机制有:底物诱导、营养调控及反馈调节。发酵的本质即从自然界中分离出特定的野生型微生物并在实验室中进行调控修饰或定向修饰,由此可得到高产某种初、次级代谢产物的菌株。 代谢调控研究的主要对象是为人类生产大量的抗生素、酶、氨基酸、有机酸、溶剂、醇类、多糖、维生素、蛋白质、生理活性物质、色素等有用产物的工业微生物及培养技术，主要是细菌、放线菌、酵母、霉菌等，当然现在又扩大到藻类、病

14、毒、植物、动物等的培养技术。 代谢控制发酵的研究任务为掌握微生物的生长、繁殖、发育、分化、代谢等生命活动的规律，以及和周围环境之间关系，从而控制工业微生物的生命活动（代谢途径），为提高发酵过程的生产、效率和创立新的发酵过程奠定理论基础。 1.3.2基本思路1、应用营养缺陷型突变株切断代谢支路；2、渗漏突变株的应用；3、抗结构类似物突变株的应用；4、营养缺陷型回复突变株的应用；5、增加前体物质的合成；6、增加细胞渗透性，去除细胞内的终产物；7、一些特殊调节机制的利用；8、条件突变株的应用；选育不生成副产物的菌株。1.3.3常用方法1、诱导：在一定的变化范围内,微生物可以通过结构蛋白、转运蛋白、毒

15、素、酶等形式的变化来适应条件的变化,由此以适应特殊的生态环境。微生物中的一种特殊物质诱导物能诱导、启动酶及代谢物的产生。2、碳源代谢物抑制(CCR)：CCR 广泛分布于微生物中,其主要功能是:当环境中有多种碳源时,CCR 就选择性利用碳源。在这种机制的调控下细胞首先代谢培养基中的最优碳源,这时,利用其它底物来合成酶的反应就会受到抑制,直到这种占主导地位的底物耗尽为止。3、氮调控：氮源调控的酶有:用于监测和去除水中硝酸盐的硝基还原酶、用于尿酸测定及其去除的尿酸酶、用于日用品和洗涤剂的蛋白酶等。4、磷酸盐调控：磷调控包括特异调控和一般调控。无机磷酸盐的特异性负作用是由于它能抑制磷酸酶。避免磷酸盐抑

16、制效应且最大限度地扰乱微生物生长的其它方法还有通过经典遗传学方法分离抗磷酸盐负作用的突变株,有关这种方法的报道有:非多元大环内酯抗生素复合物。5、反馈调控：反馈调控就是生物合成和代谢可以自己调控自己的机制。这种机制可以调控已存在的酶的活性(反馈阻化),也能终止合成(反馈抑制)。1.4立题目的、意义 世界卫生组织公布，全世界每年患癌症人数大幅度增长，至今每年检验出的新增癌症患者数已经超过1400万名。这与2008年的统计结果1270万人相比，人数明显增加。同期，癌症患者的死亡人数也有所增加，从过去的760万人增加到820万人。据WHO估计，到2025年，全球癌症患者人数将达到1900万。WHO称

17、众多癌症中，肺癌是最常见的癌症，它主要是由吸烟引起的。肺癌患者人数在全球已经达到180万例，约占患癌总人数的13%。并且，乳腺癌也显示出一种“急剧上升”的趋势，从2008年之后，乳腺癌的发病率和死亡率就一直呈上升状态，目前已经成为140多个国家中女性的常见癌症之一。在发展中国家普及乳腺癌的诊断和治疗技术是一件迫在眉睫的事情。癌症的高发危险性是抗癌治疗药物的研发、生产和市场状况受到了愈来愈广泛的关注。微生物来源的抗癌药物近年来不断涌现，发展广谱、低毒、高效、新型的抗癌药物已经成为研究的方向。 埃博霉素被誉为最具有潜力的抗肿瘤新药之一，埃博霉素与紫杉醇一样具有稳定微管蛋白的活性。在 20 世纪 9

18、0 年代，紫杉醇广泛应用于临床，临床实验表明，紫杉醇对不同的实体瘤细胞有明显的抗肿瘤活性，但由于其副作用多而受限制。如引发嗜中性白细胞减少症，外周神经病和脱毛症等，并且紫杉醇的低水溶性使 得它必需由乳化方式给药，紫杉醇还可能影响心脏功能，导致过敏反应，此外，它还是 P-糖蛋白的底物。P-糖蛋白可以将许多细胞毒性物质从细胞中泵出，是肿瘤细胞产生多药物质抗性的最主要原因。然而，紫杉醇复杂的结构阻碍了通过化学修饰改善其可溶性和降低毒性副作用的发展，因此，激发了人们对研究与其作用模式相近但却具有更好特性的化合物兴趣。埃博霉素离体抑制的效果比药物紫杉醇强2000-5000 倍，并且甲基化的EPO B作用

19、效果更大，作用的有效浓度为 1020ng/mL。比起紫杉醇来，埃博霉素是一种更不易受 P-糖蛋白作用的物质。因而埃博霉素的抗肿瘤性能要比紫杉醇强的多，且其抗肿瘤谱要广的多。埃博霉素具有比紫杉醇水溶性更好，毒副作用更小，同时化学结构简单，易于进行修饰等优点，引起了生物、医学、制药及有机合成等学科领域的高度重视，是目前学术界密切关注的、医药界寄予厚望的、前景广阔的一类新型抗肿瘤药物。另外，紫杉醇从太平洋的紫杉树皮中提取，但这种树生长极慢，来源有限。通过纤维堆囊菌发酵获得的埃博霉素，极有可能解决抗癌药物不足的问题，然而纤维堆囊菌具有多变的形态，次级代谢产物种类繁多，并且埃博霉素产量低且不稳定，因此埃

20、博霉素高产量发酵具有很大的挑战性。本论文主要通过在发酵条件下，添加抑制剂、促进剂，进行摇床培养，（纤维堆囊菌发酵周期是7天）测定这发酵7天不同条件下每天的菌体干重、pH、还原糖含量及酶活力、埃博霉素产量；同时提取每天的RNA，对每天的样品RNA进行反转录，最后进行PCR。选择研究的主题主要是丙酮酸激酶，这是糖酵解途径的一个关键酶。通过增加丙酮酸激酶效应（活化剂，抑制剂），然后测量丙酮酸激酶的活性和埃博霉素的产量的改变，同时也检测添加酶制剂后，对基因组和合成的埃博霉素的基因表达过程中的变化的影响。第二章 丙酮酸激酶酶活的测定和埃博霉素的定量分析2.1实验方法2.1.1纤维堆囊菌的培养2.1.1.

21、1纤维堆囊菌的种子培养将在甘油管中保存的纤维堆囊菌2161菌株在CNST培养基条件下进行活化。将已灭菌的CNST培养基倒平板，等凝固后贴上小片滤纸片，然后用移液枪吸取甘油管中的菌液滴加到滤纸片上，在32的生化培养箱中培养约3-4天至滤纸片呈现透明状，并且长满黄色的菌体。将生长状态良好的菌体用接种环或接种铲接入盛有50mL液体M26培养基的300mL摇瓶中，进行摇床培养。培养条件为：32，130r/min，培养3-4天到达对数生长期。2.1.1.2纤维堆囊菌的发酵培养将在M26种子培养基中生长了3-4天处于对数期的菌体打散混匀后分别接种到已配好的发酵培养基中。在接种的同时将溶于介质中的抑制剂和促

22、进剂分别用已灭菌的0.22µm滤头过滤除菌后分别加入到摇瓶中进行摇床培养，每个条件做3个平行。培养条件为：32，130r/min，培养7天，发酵结束。2.1.2粗酶液的提取和酶活的测定2.1.2.1收集菌体收集每天生长的菌体，每天不同生长条件做三个平行，吸取菌体于10mL离心管中，每个摇瓶吸取约1mL。7500r/min条件下离心10分钟，去除上清，然后每个离心管中加入5mL三乙醇胺-盐酸缓冲液（pH 7.6）悬浮菌体，然后7500 r/min条件下离心10分钟，洗涤菌体，洗去发酵培养基，去上清，然后再加入5mL三乙醇胺-盐酸缓冲液（pH 7.6）悬浮菌体。2.1.2.2破碎菌体将上

23、步得到的菌悬液进行冰浴超声波细胞破碎，破碎条件为：工作3s，间歇6s，全程5min，破碎温度为0。2.1.2.3收集粗酶液将破碎后的细胞液进行低温离心，离心条件为：12000r/min，20min，4，收集上清液。上清液即粗酶液。2.1.2.4蛋白含量测定1、配置考马斯亮蓝染色液，将研磨好的考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤。2、标准蛋白溶液，配置牛血清白蛋白的浓度为100µg/mL。3、在粗酶液蛋白浓度测定中，以1mL三乙醇胺-盐酸缓冲液为空白对照，将粗酶液稀释一定倍数，取稀释后的粗酶液1mL

24、，然后分别加入考马斯亮蓝染色液4mL，摇匀，静止2-5分钟后，在595nm条件下测定其吸光值。根据标准曲线得出粗酶液的蛋白浓度。2.1.2.5酶活测定按照考马斯亮蓝法测定粗酶液蛋白浓度，然后用三乙醇胺-盐酸缓冲液将粗酶液稀释到蛋白浓度约为1mg/mL进行酶活测定。取0.98ml实验混合物（见表2.1）在25水浴10min，然后加到石英比色皿中，用微量进样器加入0.02ml酶液，立即启动时间扫描，波长为340nm，扫描时间为5min。由于反应后在340nm处吸收值发生变化，NADH的吸收系数为340=6.3×103l/(mol·cm)，根据单位时间内吸收值的变化计算酶含量。定

25、义每分钟内消耗1 mol NADH所需要的酶活力为一个酶活单位。根据酶活曲线计算酶活力及酶比活力：根据公式算出酶活力：= =比活力=酶活力/酶液蛋白浓度表2.1 PK酶活反应混合物反应混合物组分体积（mL）0.1 mol/L三乙醇胺-KOH缓冲液（pH7.6）8.200.5 mol/L KCl0.200.25 mol/L MgCl20.100.01mol/L PEP0.500.1mol/L ADP0.500.1mol/L NADH0.20LDH（150U）0.102.1.3埃博霉素标准曲线的测定1、分别称取埃博霉素A/B纯品为0.045mg/0.02mg，然后用1mL纯甲醇充分溶解作为母液，然

26、后分别用纯甲醇将母液稀释到不同浓度。埃博霉素A的稀释浓度（mg/L）分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50；埃博霉素B的稀释浓度（mg/L）分别为3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、35。2、将配置好的不同浓度的标准品在10000r/min条件下离心10min，将上清液转移到另一干净的离心管中，然后用HPLC进行测定。检测条件：检测波长249nm；色谱柱Elite C18m，4.6×250 mm；流动相为甲醇：水=7:3；流速为1.0mL/min；柱温40；进样量为10µL。2.2实验结果2.2.1埃博霉素标准曲线的测定分别以Epo

27、A，EpoB的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线如图2.2。EpoA标准曲线方程为：y=8×106x+24325（R2=0.9979），EpoB标准曲线方程为：y=7×106x+124336（R2=0.9986）。在样品浓度测定中，根据其峰面积换算出埃博霉素浓度（g/L）。图2.2 埃博霉素的标准曲线（A：EpoA B：EpoB）第三章 抑制剂和促进剂的添加对酶活和产量的影响3.1实验方法3.1.1效应剂浓度的可行性实验3.1.1.1抑制剂VK3浓度的可行性实验根据文献70中数据，对人类的PKM2型的半抑制率为13µM，因此设计浓度为1.3,13,130&

28、#181;M范围，测定其是否对纤维堆囊菌中的丙酮酸激酶有抑制作用。确定其对纤维堆囊菌中的丙酮酸激酶有抑制作用之后，然后设计浓度确定一个浓度，在此浓度条件下对菌体生长影响不大，但对酶活有显著抑制作用。设计的浓度为1.3，7，13，20，25，30µM进行实验，测定这些浓度条件下菌体干重及酶活力，与空白对照进行比较。3.1.1.2激活剂果糖-1,6-二磷酸浓度的确立 根据文献74中研究，当其浓度为0.5mM时对丙酮酸激酶的激活作用最明显，浓度过高或过低会对酶活力的促进作用不明显，可能还会产生抑制作用。在本实验中选择果糖-1,6-二磷酸的浓度梯度为0.05mM，0.5mM，5mM。3.1.

29、2丙酮酸激酶酶活的测定此处酶活测定方法与2.1.2测定方法一致。收集每天不同生长条件下的菌体，离心收集菌泥，然后进行破壁处理，之后测蛋白含量及丙酮酸激酶酶活力。3.1.3埃博霉素产量的测定3.1.3.1树脂的收集 将每天的发酵液与树脂的混合物进行抽滤，得到的树脂在40条件下烘干，收集于10mL离心管中，分别加入1mL甲醇进行摇床震荡萃取过夜，然后将液体转移到离心管中40烘干，取200µL甲醇重新溶解后10000r/min离心10min，转移上清液于新管中待用。3.1.3.2HPLC分析条件检测条件：检测波长249nm；色谱柱Elite C18m，4.6×250 mm；流动相

30、为甲醇：水=7:3；流速为1.0mL/min；柱温40；进样量为10µL。3.2实验结果3.2.1抑制剂和促进剂浓度的选择3.2.2丙酮酸激酶酶活的测定从图4.1中可以看出在添加VK3和FBP后，酶活力明显发生变化，空白组从第三天到第四天菌体生长迅速，酶活力达到最大，在VK3条件下其酶活力受到显著抑制，添加VK3后其酶活力是对照的0.40倍。而在果糖-1,6-二磷酸存在的条件下，其酶活力受到显著的促进作用，是对照组的1.43倍。从图4.1中可以看出，在发酵第3天到第4天，PK酶活力增长迅速，在第四天时酶活力达到最大，然后开始慢慢下降。而在第3章中已得出，菌体在第3天到第4天时生长迅速

31、，进入指数期。可以得出在菌体迅速增长时PK酶活力也迅速增大，酶活力与菌体生长成正相关。图4.1 不同条件下丙酮酸激酶酶活力变化3.2.3效应剂对埃博霉素产量的影响我们也分析了每天埃博霉素的积累量（图3.2 A,B）。在对照组中从第三天到第四天埃博霉素的积累量达到最大。在抑制剂VK3存在的条件下，埃博霉素的积累量明显低于对照组，在激活剂果糖-1,6-二磷酸存在的条件下，埃博霉素积累量明显高于对照组。然后又分析了不同条件下单位菌体埃博霉素的产量（图3.2C,D）。在第7天时，添加VK3的条件下埃博霉素A和B分别只是对照组的43.36%和43.31%，而在果糖-1,6-二磷酸的条件下，单位菌体埃博霉

32、素A和B却是对照组的132.2%和145.91%。添加果糖-1,6-二磷酸对埃博霉素合成起到了促进作用。图3.2不同条件下每一天的和单位菌体埃博霉素产量变化（A,C 埃博霉素A；B,D 埃博霉素B）第四章 抑制剂和效应剂的添加对相关基因表达量的影响4.1实验方法 4.1.1 RNA提取由于空气中以及人呼出的气体中含有大量RNase，RNase无处不在，因此RNA极易降解，因此在提取RNA的过程中特别小心。首先选择在比较偏僻的角落，避免人经常走动，在做实验之前将实验台用DEPC水擦拭数遍，实验所用的移液枪，枪盒也要是提RNA专用的，实验中所用的枪头，离心管也要是灭RNase的，枪盒要在125条件

33、下干热灭菌1h，试剂瓶，称溶菌酶所用的称量纸及药匙要在180条件下干热灭菌4h，已彻底灭活RNase。在提取RNA过程中要戴口罩和灭菌手套，在提取过程中要尽量避免说话以及人员走动，操作速度要快。4.1.2 cDNA的合成根据提取的RNA浓度，选择合适的RNA模版量进行反转录，从而确保进行定量PCR时cDNA的量一致。在本实验中每个反转录体系选取RNA的量为200ng。反转录体系见表4.1。表5.2 反转录体系组成试剂用量Total RNAXRandom Primer (N9)(0.1 g/ L)1 L2×TS Reaction Mix10 LTransScript RT/RI Enz

34、yme Mix1 LRNase-free Water to20 L按照表5.2将反应体系加入到200µL离心管中，盖好盖子然后在25条件下孵育10min，使随机引物充分与RNA结合；在42条件下孵育30min达到充分逆转录；最后在85条件下孵育5min，充分灭活TransScript®RT酶。在进行反转录之前将操作台及移液器用DEPC溶液擦拭几遍，使RNase失活，实验过程中所使用的枪头，离心管都是经过去RNase处理的。在实验过程中佩戴口罩和一次性灭菌手套 ，操作过程要稳，准，快，避免被空气中的RNase降解。反应完毕将cDNA放于-20条件下保存备用。4.1.3 Q-PCR分析通过Rotor-Gene 6软件使用荧光阈值手动设定为0.02决定CT值，然后输入到微软Excel中，比较delta-delta CT进行了分析。计算根据下列等式, C T=（CT，目的基因-CT，16S rDNA）D2-7-（CT，对照基因-CT，16S rDNA）D2，空白.F=2-CT。以发酵第二天的对照组的