生化检验技术基础PPT课件

1、一、比色分析一、比色分析1 1比色分析理论比色分析理论Beer-Lambert Beer-Lambert 定律定律 A = lgA = lg（I I0 0/I/I）KCL KCL 或或 I II I0 01010- -KCLKCL I I0 0：入射光强度：入射光强度 I I：透过光强度：透过光强度 K K：常数：常数 C C：溶液浓度：溶液浓度 L L：溶液的厚度：溶液的厚度第1页/共96页（1 1）郎伯定律）郎伯定律 I0 It l L -dIIdl， -dIaIdl， dI/I=-adl 积分 It L dI/I -a dl 得： ln(I0 / It)-aL I0 0 将ln改为lg，

2、则为：lg（ I0 / It）-0.434aLKL 令lg（ I0 / It） A，则A KL第2页/共96页（2 2）比尔定律）比尔定律 A AK K”C C（3 3）郎伯）郎伯- -比尔定律比尔定律 A AKLCKLC第3页/共96页透光率（透光率（transmittancetransmittance，T T，透射率），透射率） T TI / II / I0 0吸光度（吸光度（absorbanceabsorbance，A A）光密度（光密度（eptical densityeptical density，D D或或ODOD） A Alg Ilg I0 0/I/I-lgT-lgT T T101

3、0-A-A1010-KCL-KCL A AKCLKCL当当L L用用cmcm，C C用用mol/Lmol/L表示，则表示，则K K即称之为摩尔吸光系数，用即称之为摩尔吸光系数，用表示。表示。当当C C1mol/L1mol/L，L L1cm1cm，则，则A A。第4页/共96页T T与与A A的关系的关系 透光率（T） 吸光度（A） 1 0.000 0.75 0.125 0.5 0.301 0.25 0.602 0.17 0.770 0.1 1.000 0.05 1.301 0.01 2.000 0.001 3.000第5页/共96页2 2影响因素影响因素（1 1）化学因素的影响）化学因素的影响

4、 溶液中溶质可因浓度的改变而发生离解、缔合，与溶剂间的作用等原溶液中溶质可因浓度的改变而发生离解、缔合，与溶剂间的作用等原因而出现偏离比尔定律的现象。由化学因素引起的偏离，有时可控制溶液因而出现偏离比尔定律的现象。由化学因素引起的偏离，有时可控制溶液条件设法减免。此外，能产生荧光的物质也可导致偏离比尔定律。条件设法减免。此外，能产生荧光的物质也可导致偏离比尔定律。第6页/共96页（2 2）非单色光的影响）非单色光的影响 比尔定律的一个重要条件是单色光，但在比色分析中常有不同波长的比尔定律的一个重要条件是单色光，但在比色分析中常有不同波长的光同时存在。这就使吸光度发生改变，从而偏离比尔定律。光同

5、时存在。这就使吸光度发生改变，从而偏离比尔定律。第7页/共96页波长的选择波长的选择可见绿色带黄深黄桔红深红深紫青紫紫蓝蓝色带绿绿色带蓝深绿Ultra-violet紫外200400深紫深红桔红深黄绿色带黄暗绿绿色带蓝蓝色带绿紫蓝青紫被测溶液颜色颜色750800610750595610560580580595500560490500480490435480400435波长(nm)第8页/共96页（3 3）光学因素的影响）光学因素的影响 散射是向空间各个方向，而使透射光减弱。反射可使光能损失，当光散射是向空间各个方向，而使透射光减弱。反射可使光能损失，当光线通过两种不同介质时，则发生反射。当样本溶

6、液与空白溶液的折射率有线通过两种不同介质时，则发生反射。当样本溶液与空白溶液的折射率有较大差异时，导致吸收值的偏差。较大差异时，导致吸收值的偏差。（4 4）非平行光通过吸收池时，由于光线的倾斜使厚度）非平行光通过吸收池时，由于光线的倾斜使厚度L L增大而影响测量值。增大而影响测量值。第9页/共96页3 3比色法的误差比色法的误差（1 1）仪器误差）仪器误差 滤光片，狭缝过宽，光电池疲滤光片，狭缝过宽，光电池疲劳，仪器结构，散热不良。劳，仪器结构，散热不良。（2 2）方法误差）方法误差 （3 3）操作误差）操作误差第10页/共96页比色法举例比色法举例1. 1. 总蛋白总蛋白(TP)(TP)蛋白

7、质中的肽键+Cu 2+ 碱性条件 紫红色络合物引起在波长540560nm范围内吸光度的上升, 与总蛋白含量成正比2. 2. 白蛋白白蛋白(ALB)(ALB)白蛋白+溴甲酚绿 pH4.2 白蛋白溴甲酚绿复合物引起在波长630nm范围内吸光度的上升, 与白蛋白含量成正比第11页/共96页二、分光光度计二、分光光度计1 1光源光源热光源热光源: : 钨灯、卤钨灯（钨灯、卤钨灯（3203202500nm2500nm）气体放电光源：气体放电光源： 氢灯、氘灯（氢灯、氘灯（185185375nm375nm）。）。 氘灯发光强度比氢灯强氘灯发光强度比氢灯强3 35 5倍，是目前紫外光区常用光源。倍，是目前紫

8、外光区常用光源。 第12页/共96页 2. 2. 单色器单色器 单色器是一种用来把光源发出的复合光分解成单色光，并能任意改变所需波长单色器是一种用来把光源发出的复合光分解成单色光，并能任意改变所需波长的装置。的装置。 (1)(1)棱镜棱镜 玻璃棱镜的折射率大、色散能力也大，因而分辨本领高。但它吸收紫外光，因玻璃棱镜的折射率大、色散能力也大，因而分辨本领高。但它吸收紫外光，因此只适用于此只适用于3503503000nm3000nm的波长范围。的波长范围。 石英棱镜对紫外光吸收少，适用于石英棱镜对紫外光吸收少，适用于195-4000nm195-4000nm间分光。但由于石英棱镜折射间分光。但由于石

9、英棱镜折射率低于玻璃，因而色散能力差。率低于玻璃，因而色散能力差。第13页/共96页 (2)(2)光栅光栅 光栅是利用光的衍射、干涉原理制成的色散元件。目前，全息光栅在质量上，光栅是利用光的衍射、干涉原理制成的色散元件。目前，全息光栅在质量上，成本上都大大优于机械光栅。因光栅分光在紫外和可见光区均适用，且色散力强、成本上都大大优于机械光栅。因光栅分光在紫外和可见光区均适用，且色散力强、分辨率高，故近年生产的分光光度计大都采用光栅作单色器。分辨率高，故近年生产的分光光度计大都采用光栅作单色器。第14页/共96页3 3比色杯比色杯 比色杯可由玻璃和石英等材料制成，比色杯可由玻璃和石英等材料制成，玻

10、璃适用于玻璃适用于350nm350nm以上光区，而石英以上光区，而石英杯则适用于紫外和可见光区。杯则适用于紫外和可见光区。第15页/共96页4 4检测器检测器 在分光光度计中，把光信号转变在分光光度计中，把光信号转变成电信号输出的装置称检测器。成电信号输出的装置称检测器。 光电池光电池 光电管光电管 光电倍增管光电倍增管 第16页/共96页双波长分光光度计 来自光源的光被两个单色器分别分离出波长为来自光源的光被两个单色器分别分离出波长为1 1和和2 2的两束单色光。经过的两束单色光。经过折波器后，两束波长不同的单色光交替地照射于同一样品杯。样品杯背后的光折波器后，两束波长不同的单色光交替地照射

11、于同一样品杯。样品杯背后的光电倍增管交替地接收到两种波长照射吸收池后所产生的信号。此信号经电子电电倍增管交替地接收到两种波长照射吸收池后所产生的信号。此信号经电子电路转化为两个吸光度之差路转化为两个吸光度之差A A。第17页/共96页三、酶法分析三、酶法分析 酶法分析包括两方面的内容：酶法分析包括两方面的内容： 借助酶来测定某一化合物的浓借助酶来测定某一化合物的浓度，如测定体液中的葡萄糖、甘油三度，如测定体液中的葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、尿素、尿酸、肌酐等。酯、胆固醇、尿素、尿酸、肌酐等。 借助酶来测定另一种酶的活性，借助酶来测定另一种酶的活性，实际上是用酶来测定待测酶的产物，实际上是用酶来测

12、定待测酶的产物，如转氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。如转氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。第18页/共96页葡萄糖葡萄糖葡萄糖O2H2O 葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸H2O2H2O2苯酚4-氨基安替比林 过氧化物酶 醌亚胺H2O尿素尿素尿素H2O 脲酶 2NH4+CO2NH4+-酮戊二酸NADH 谷氨酸脱氢酶 谷氨酸NAD+H2O第19页/共96页肌酸激酶（肌酸激酶（CK）磷酸肌酸ADP CK 肌酸ATP葡萄糖ATP HK 葡萄糖-6-磷酸ADP葡萄糖-6-磷酸NADP G6PDH 6-磷酸葡萄糖酸NADPHH+丙氨酸氨基转移酶（丙氨酸氨基转移酶（ALTALT）丙氨酸-酮戊二酸 ALT 丙酮酸谷氨酸丙酮酸NADH

13、H+ LDH 乳酸NAD+H2O第20页/共96页酶催化特点酶催化特点高度的特异性高催化效率作用条件温和第21页/共96页酶的活性部位酶的活性部位底物结合部位催化部位第22页/共96页酶的辅助因子酶的辅助因子金属离子辅基和辅酶NAD ，NADP第23页/共96页酶的分类酶的分类1. 氧化还原酶2. 转移酶3. 水解酶4. 裂合酶5. 异构酶6. 合成酶第24页/共96页酶的系统命名酶的系统命名应将酶的一种或两种底物以及催化反应的性质明确标明。乳酸脱氢酶 L-乳酸：NAD+氧化还原酶肌酸激酶 ATP：肌酸磷酸转移酶第25页/共96页酶的活性单位酶的活性单位 一国际单位为在一分钟内催化转变1个微摩

14、尔的反应物的酶量. IUU U/L 1Katal为每秒钟转化1mole底物的酶量 1国际单位=16.67nKatal 1Katal=6107国际单位第26页/共96页酶活性测定酶活性测定影响酶活性测定：底物、激活剂、抑制剂、缓冲液、pH、温度、酶浓度。在最适条件下以求达到最大的反应速度。但由于底物的溶解度低，或售价太高，或需连锁的酶反应，则必须对测定条件作修正。第27页/共96页酶活性测定的最适条件酶活性测定的最适条件1. 1.合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度2. 2.指示酶和辅助酶的种类和浓度指示酶和辅助酶的种类和浓度3. 3.反应

15、混合液的最适反应混合液的最适pHpH，缓冲液种类和浓度，缓冲液种类和浓度4. 4.去除各种抑制剂去除各种抑制剂第28页/共96页酶促反应的两个阶段酶促反应的两个阶段 反应级数 0级 1级 P 1.可逆反应可逆反应 2.产物抑制产物抑制 3.酶变性失活酶变性失活 v=dP/dt 4.底物不饱和底物不饱和 S 时间 t第29页/共96页酶反应进程和酶浓度曲线酶反应进程和酶浓度曲线 酶量E 40 1.E越大，线性反 产 应期越短 物 2.E相同，S越小， P 20 线性反应期越短 10 5 0 5 10 15 20 时间(min)第30页/共96页酶反应时间曲线酶反应时间曲线 时间(min) 5(t

16、0) 反应时间越短， 10(t1) 线性范围越大 15(t2) 20(t3) 0 10 20 30 40 酶量E第31页/共96页米氏方程米氏方程E + SESE + Pkkkk+1+2-2-1v=VSKm+Sv V2S Km第32页/共96页米氏曲线米氏曲线SVVmaxKmVmax 2KmKm第33页/共96页米氏常数米氏常数米米- -孟氏公式：孟氏公式：v vVmS/(KmVmS/(KmS)S)当当SKmSKmSKm时，则时，则v vVmVm，即反，即反应速度是一个常数，为零级反应速度是一个常数，为零级反应。应。如如SSKmKm时，混合级反应时，混合级反应。第34页/共96页米氏常数的意义

17、米氏常数的意义 如如v v0.5Vm0.5Vm，则，则KmKmSS，KmKm值等于酶促反应的初速度为最大速度的一半时所值等于酶促反应的初速度为最大速度的一半时所需的底物浓度。需的底物浓度。 KmKm等于等于ESES的解离常数；而的解离常数；而KmKm的倒数可代表酶和底物的亲和力。的倒数可代表酶和底物的亲和力。 KmKm是酶的特征性常数，当是酶的特征性常数，当pHpH、温度和离子强度恒定时，、温度和离子强度恒定时，KmKm只和酶及底物的性质只和酶及底物的性质有关，而与酶浓度无关。有关，而与酶浓度无关。 纯度不同的同一种酶，如杂质中没有可使底物发生旁反应的其它酶或酶的激活纯度不同的同一种酶，如杂质

18、中没有可使底物发生旁反应的其它酶或酶的激活剂和抑制剂，则剂和抑制剂，则KmKm的变化不大。的变化不大。第35页/共96页米氏常数的应用米氏常数的应用（1 1）如已知酶的）如已知酶的KmKm，可计算某一底，可计算某一底物浓度时的物浓度时的v/Vmv/Vm。（2 2）如要求）如要求v v占占VmVm一定的百分比，一定的百分比，也可算出所需底物浓度为其也可算出所需底物浓度为其KmKm的多的多少倍。少倍。（3 3）利用工具酶来测定某一底物的）利用工具酶来测定某一底物的浓度时，可计算工具酶的用量。浓度时，可计算工具酶的用量。第36页/共96页（4 4）测定几个同工酶对同一底物）测定几个同工酶对同一底物的

19、的KmKm，可估计是原级（，可估计是原级（ KmKm常有差常有差异）还是次生性同工酶（异）还是次生性同工酶（ KmKm接近接近或相同）。或相同）。（5 5）测定正逆方向底物的）测定正逆方向底物的KmKm，可，可大体知道该酶催化哪一方向为主。大体知道该酶催化哪一方向为主。（6 6）如已知一组酶中各酶的）如已知一组酶中各酶的KmKm及及其相应底物的浓度，有助于寻找其相应底物的浓度，有助于寻找限速步骤。限速步骤。第37页/共96页KmKm的求取的求取 Lineweaver-Burk作图法 1/v(Km/Vm)(1/S)1/Vm Eadie-Hofstee作图法 vVmKm(v/S) Eisentha

20、l和Cornish-Bowden作图法 设Y轴和X轴分别为求取Vm及Km的座标，将不同S浓度点在X轴的负侧；相应的反应速度点在Y轴上，连接各线，交点在Y轴上的座标为Vm，在X轴上的座标为Km。第38页/共96页酶活性测定的基本知识酶活性测定的基本知识 酶活性是通过测定酶促反应过程酶活性是通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获生成量，即测定酶促反应的速率来获得的。得的。第39页/共96页（1 1）定时法）定时法 测定酶反应开始后某一时间内（测定酶反应开始后某一时间内（t t1 1到到t t2 2）产物或底物浓度的总变化

21、量来求取）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法称为定时法。酶反应初速度的方法称为定时法。 产产 2 2 物物 3 3 生生 1 1 成成 t t1 1 t t2 2 第40页/共96页（2 2）连续监测法）连续监测法 连续测定（每连续测定（每15s15s1min1min监测一次）酶反应过程中某一反应产物或底物的监测一次）酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应初速度的方法称为连续监测法，又称动力学法浓度随时间的变化来求出酶反应初速度的方法称为连续监测法，又称动力学法或速率法。这种方法的优点是可将多点的测定结果连接成线，很易找到成直线或速率法。这种方法的优点是可将

22、多点的测定结果连接成线，很易找到成直线的区段，来计算酶活性。此法较为准确。的区段，来计算酶活性。此法较为准确。 分为直接连续监测法和间接连续监测法。分为直接连续监测法和间接连续监测法。 法法. .第41页/共96页连续监测法的测定时间连续监测法的测定时间 吸 光 度 A3 A2 A1 t1 t2 t3 t4 时间第42页/共96页（3 3）平衡法）平衡法 通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活性的方法称为平衡底物浓度总变化量来求出酶活性的方法称为平衡法。用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减法。用平衡法测定时，因产物的增加或底

23、物的减少与反应时间不成线性，故不能把少与反应时间不成线性，故不能把PP或或SS的总的总变化量除以变化量除以t t来代表每分钟产物或底物的变化。来代表每分钟产物或底物的变化。另外，平衡法也会受到产物抑制、可逆反应等因另外，平衡法也会受到产物抑制、可逆反应等因素的影响，由于反应时间较定时法长，故这种影素的影响，由于反应时间较定时法长，故这种影响会更大，测定结果也较连续监测法低。对于有响会更大，测定结果也较连续监测法低。对于有些零级反应期很短的酶促反应，用连续监测法和些零级反应期很短的酶促反应，用连续监测法和定时法很难测出其初速度，也只得采用平衡法测定时法很难测出其初速度，也只得采用平衡法测定。定。

24、第43页/共96页定时法与连续法比较定时法与连续法比较 定时法定时法 条件无限制 试剂需量少，经济 采用放射性试剂时，灵敏度高 结果不能立刻揭晓 人工操作多，费时 毋需偶联酶 产物会生抑制作用 连续法连续法 因偶联酶使条件受限制 需量较大 与放射性试剂来比，灵敏度低 结果立刻揭晓 人工操作少 偶联酶的费用很大 偶联作用能消耗产物第44页/共96页（一）工具酶及酶偶联反应（一）工具酶及酶偶联反应 通过酶偶联反应间接地测出通过酶偶联反应间接地测出第一个酶促反应中待测物的浓度或第一个酶促反应中待测物的浓度或待测酶的活性。那些作为试剂用于待测酶的活性。那些作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为测定

25、化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。工具酶。第45页/共96页AB 酶1 CDC（或D）E 酶2 FGF（或G）H 酶3 IJ酶1：待测酶酶2：辅助酶酶3：指示酶E、H：辅助底物第46页/共96页在利用工具酶的反应中，唯一的限在利用工具酶的反应中，唯一的限速因子应该是待测化合物或待测酶。速因子应该是待测化合物或待测酶。对工具酶试剂中的杂质（杂酶、抑对工具酶试剂中的杂质（杂酶、抑制剂等）的含量也有一定的限制，制剂等）的含量也有一定的限制，以减少或避免干扰测定的副反应。以减少或避免干扰测定的副反应。第47页/共96页 如果工具酶制剂中污染了待测酶会对测定结果产生严重影响。如果工具酶制剂中污染了待测酶

26、会对测定结果产生严重影响。 如天冬氨酸转氨酶（如天冬氨酸转氨酶（ASTAST）测定的工具酶是苹果酸脱氢酶（）测定的工具酶是苹果酸脱氢酶（MDHMDH），如污染），如污染0.03%0.03%的的ASTAST，则当，则当ASTAST活性为活性为7U/L7U/L时，测定误差为时，测定误差为6%6%。 而测定丙氨酸转氨酶（而测定丙氨酸转氨酶（ALTALT）的工具酶是乳酸脱氢酶（）的工具酶是乳酸脱氢酶（LDHLDH），如污染），如污染0.03%0.03%的的ALTALT，则当，则当ALTALT活性为活性为5U/L5U/L时测定误差也是时测定误差也是6%6%。第48页/共96页（二）常用监测物质的特性（二

27、）常用监测物质的特性1 1NADHNADH或或NADPHNADPH：乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDHLDH） NADNAD+ +或或NADPNADP+ +苹果酸脱氢酶（苹果酸脱氢酶（MDHMDH） NADNAD+ +或或NADPNADP+ +谷氨酸脱氢酶（谷氨酸脱氢酶（GLDHGLDH） NADNAD+ +或或NADPNADP+ +6-6-磷酸葡萄糖脱氢酶（磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDG6PD） 动物动物G6PD NADPG6PD NADP+ + 微生物微生物G6PD NADG6PD NAD+ +第49页/共96页NADHNADH或或NADPHNADPH在在340nm340nm有特征性光吸有特征性

28、光吸收，而它们的氧化型收，而它们的氧化型NADNAD+ +或或NADPNADP+ +则则没有这个吸收峰，没有这个吸收峰，340nm340nm波长处的波长处的吸光度与吸光度与NADNAD（P P）H H的浓度成正比。的浓度成正比。另外另外NADNAD（P P）H H有强烈的荧光，其有强烈的荧光，其激发波长为激发波长为340nm340nm，发射波长为，发射波长为460nm460nm。第50页/共96页max ：340nm第51页/共96页肌酸激酶（肌酸激酶（CK）磷酸肌酸ADP CK 肌酸ATP葡萄糖ATP HK 葡萄糖-6-磷酸ADP葡萄糖-6-磷酸NADP G6PDH 6-磷酸葡萄糖酸NADP

29、HH+丙氨酸氨基转移酶（丙氨酸氨基转移酶（ALTALT）丙氨酸-酮戊二酸 ALT 丙酮酸谷氨酸丙酮酸NADHH+ LDH 乳酸NAD+H2O第52页/共96页2 2H H2 2O O2 2指示反应指示反应葡萄糖氧化酶、尿酸酶、甘油氧化葡萄糖氧化酶、尿酸酶、甘油氧化酶、胆固醇氧化酶：用于葡萄糖、酶、胆固醇氧化酶：用于葡萄糖、尿酸、甘油、胆固醇的测定，可使尿酸、甘油、胆固醇的测定，可使相应底物被相应底物被O O2 2氧化成氧化成H H2 2O O2 2，H H2 2O O2 2可通可通过下列指示反应来检测过下列指示反应来检测。第53页/共96页 使单一的色素原显色。无色色素原过氧化物酶（使单一的色

30、素原显色。无色色素原过氧化物酶（PODPOD）存在下被）存在下被H H2 2O O2 2氧化后氧化后可生成有色的色素。可生成有色的色素。 使成对的色素原显色。必须要两个色素原共同存在，再在指示酶使成对的色素原显色。必须要两个色素原共同存在，再在指示酶PODPOD的催化的催化下生成色素。下生成色素。 发光反应。发光反应。H H2 2O O2 2也可用化学发光反应来监测，它是凭借某些荧光前身物在氧也可用化学发光反应来监测，它是凭借某些荧光前身物在氧化后，处于激发状态的分子可发射光子，光子量和化后，处于激发状态的分子可发射光子，光子量和H H2 2O O2 2的浓度成正比。的浓度成正比。第54页/共

31、96页葡萄糖葡萄糖葡萄糖O2H2O 葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸H2O2H2O2苯酚4-氨基安替比林 过氧化物酶 醌亚胺H2O甘油三酯甘油三酯甘油三酯H2O 脂蛋白脂酶 甘油脂肪酸甘油ATP 甘油激酶 -磷酸甘油ADP -磷酸甘油O2 甘油磷酸氧化酶 磷酸二羟丙酮H2O2 H2O2 +4-氨基安替比林+ESPAS 过氧化物酶 醌亚胺H2O ESPAS:N-乙基-N-(3-磺丙基)-间-茴香胺第55页/共96页3 3硝基苯衍生物硝基苯衍生物 芳香酯酶、磷酸酯酶和硫酸酯酶：对芳香酯酶、磷酸酯酶和硫酸酯酶：对- -硝基酚和有机酸或无机酸形成的酯类硝基酚和有机酸或无机酸形成的酯类 糖苷酶：对硝基酚和糖苷衍生

32、物糖苷酶：对硝基酚和糖苷衍生物 -谷氨酰转肽酶、芳香酰胺酶和胰蛋白酶：对谷氨酰转肽酶、芳香酰胺酶和胰蛋白酶：对- -硝基苯胺的氨基酰衍生物硝基苯胺的氨基酰衍生物 故硝基苯酚或硝基苯胺作为底物的结合型化合物均无色，而一旦水解或游离型产物故硝基苯酚或硝基苯胺作为底物的结合型化合物均无色，而一旦水解或游离型产物在在pHpH大于大于8 8的碱性条件下能生成黄色的醌类离子型化合物，在的碱性条件下能生成黄色的醌类离子型化合物，在400nm400nm410nm410nm有光吸有光吸收峰，其吸光度与浓度成正比。收峰，其吸光度与浓度成正比。第56页/共96页max：405nm第57页/共96页碱性磷酸酶（碱性磷

33、酸酶（ALPALP）磷酸对硝基苯H2O ALP 磷酸盐对硝基苯酚 - -谷氨酰转移酶（谷氨酰转移酶（ -GT-GT） -谷氨酰对硝基苯胺双甘肽 -GT 谷氨酰基双甘肽对硝基苯胺第58页/共96页（三）酶法分析的类型（三）酶法分析的类型 用工具酶测定体液中代谢物用工具酶测定体液中代谢物的浓度，一般可用两种不同的测定方的浓度，一般可用两种不同的测定方法。法。第59页/共96页1 1代谢物浓度的酶法分析代谢物浓度的酶法分析（1 1）终点法）终点法 将待测底物与工具酶保温一定时间后，全部转变成可监测的化合物，然后测将待测底物与工具酶保温一定时间后，全部转变成可监测的化合物，然后测定后者的总量来计算待测

34、物的总量或浓度。定后者的总量来计算待测物的总量或浓度。 尿素尿素H H2 2O O 尿素酶尿素酶 COCO2 22NH2NH3 3 乙醇乙醇NADNAD+ + 醇脱氢酶醇脱氢酶 乙醛乙醛NADHNADHH H+ + 反应常呈一级反应。反应常呈一级反应。 使待测底物完全转变所需的时间取决于加入的工具酶量。使待测底物完全转变所需的时间取决于加入的工具酶量。第60页/共96页（2 2）动力学法）动力学法 待测物不必完全转变成可监测的化合物，而是利用工具酶反应速率来待测物不必完全转变成可监测的化合物，而是利用工具酶反应速率来定量其浓度：定量其浓度： 一是利用零级反应，如待测物是某个工具酶的激活剂或抑制

35、剂，其浓一是利用零级反应，如待测物是某个工具酶的激活剂或抑制剂，其浓度可决定该工具酶的反应速度，可采用此方法。因测定时该工具酶本身及度可决定该工具酶的反应速度，可采用此方法。因测定时该工具酶本身及其底物都是足量的，故反应为零级反应。其底物都是足量的，故反应为零级反应。 第61页/共96页例：测定血清中肝素AT 肝素 AT（AT为肝素与AT复合物）AT凝血酶 凝血酶-AT（无活性）残余凝血酶甲苯磺酰-甘-脯-精-4NA 凝血酶 甲苯磺酰-甘-脯-精4-硝基苯胺 第62页/共96页 二是利用一级反应，本法的基本要求是作为某一工具酶底物的待测物的浓二是利用一级反应，本法的基本要求是作为某一工具酶底物

36、的待测物的浓度度SS必须远小于该工具酶的必须远小于该工具酶的KmKm。此时反应速度基本上与。此时反应速度基本上与SS成正比，呈一级反成正比，呈一级反应。应。 动力学法较终点法具有简便、省时、干扰少、可测定低浓度物质、不需样动力学法较终点法具有简便、省时、干扰少、可测定低浓度物质、不需样品对照以及易于自动化等优点，成为自动化分析的主要方法。但此法必须同时品对照以及易于自动化等优点，成为自动化分析的主要方法。但此法必须同时测定标准样品的反应速度，来推算未知样品中待测物的浓度。测定标准样品的反应速度，来推算未知样品中待测物的浓度。第63页/共96页2 2酶活性测定的酶法分析酶活性测定的酶法分析 这类

37、酶学分析法是用工具酶来测定这类酶学分析法是用工具酶来测定待测酶的产物以求取待测酶的活性，待测酶的产物以求取待测酶的活性，适合于待测酶产物不能直接监测的情适合于待测酶产物不能直接监测的情况。况。 也可有终点法和动力学法两种。也可有终点法和动力学法两种。 第64页/共96页（1 1）终点法）终点法 将底物与待测酶反应一定时间将底物与待测酶反应一定时间后，终止反应，再用指示酶测定该后，终止反应，再用指示酶测定该时间内产物的生成量即可算出酶活时间内产物的生成量即可算出酶活性。性。 第65页/共96页（2 2）偶联反应的基本动力学）偶联反应的基本动力学 S Ex P1 Ei P2 应先将样品与工具酶预保

38、温，使样品中的内源性干扰物充分催化消耗，然后加应先将样品与工具酶预保温，使样品中的内源性干扰物充分催化消耗，然后加入底物入底物S S起动反应。起动反应。 起动后，因起动后，因P P从零开始升高，故工具酶反应速度也较低，不能代表待测酶反应速从零开始升高，故工具酶反应速度也较低，不能代表待测酶反应速度，这一时期称为延滞期。度，这一时期称为延滞期。 随着反应进行，进入恒态期，只要工具酶用量足够，就能正确地反映酶的活性随着反应进行，进入恒态期，只要工具酶用量足够，就能正确地反映酶的活性. .第66页/共96页 A 延迟期 恒态期 非恒态期 1.5 1.0 S Ex P1 Ei P2 0.5 0 30

39、60 90 120 150 180 秒 （以NADH减少为指示反应） 如Ei用量过少，Ex的速度Vx大于Ei的速度，即P1生成的速度大于P1消失的速度，可导致P1的逐渐堆积，不能成为恒态或其延滞期极长。但如Ei用量足够，Vi等于或大于Vx，则P1一旦生成可较快或很快转变成P2，P1产生与消失速度一致而成为恒态。第67页/共96页（四）酶活性浓度的计算（四）酶活性浓度的计算 Vt106U/L（A/min） VsLA 吸光度变化吸光度变化V Vt t为反应系统总体积为反应系统总体积V Vs s为样品体积为样品体积 为被测物的摩尔吸光系数为被测物的摩尔吸光系数(mol(mol-1-1 cm cm-1

40、-1) )L L为光径为光径10106 6是将是将molmol转化成转化成molmol。第68页/共96页常数常数K K值的意义和设置值的意义和设置 Vt106U/L（A/min） VsL （A/min）K Vt106 K VsL 第69页/共96页常数常数K K值的检验值的检验 ：pHpH；温度；单色光；仪器信号接收；温度；单色光；仪器信号接收V V：仪器加样系统：仪器加样系统 对一些性质稳定的物质如对硝基酚、对硝基苯胺，可以用高纯试剂配成标准品，对一些性质稳定的物质如对硝基酚、对硝基苯胺，可以用高纯试剂配成标准品，将它们作为标本进行酶的测定，根据其浓度和吸光度变化可计算出实际将它们作为标本

41、进行酶的测定，根据其浓度和吸光度变化可计算出实际K K值。值。 对对NAD(P)HNAD(P)H，可使用测葡萄糖试剂盒，对已知浓度的葡萄糖标准品进行终点法测，可使用测葡萄糖试剂盒，对已知浓度的葡萄糖标准品进行终点法测定，此法产生与葡萄糖相等摩尔数的定，此法产生与葡萄糖相等摩尔数的NAD(P)HNAD(P)H，故不难从吸光度变化求出，故不难从吸光度变化求出K K值。值。第70页/共96页 利用标准管的方法较简单，但标利用标准管的方法较简单，但标准管的浓度必须在该比色法或紫外分光准管的浓度必须在该比色法或紫外分光光度法测定的浓度线性范围内。标准曲光度法测定的浓度线性范围内。标准曲线法可得浓度和吸光

42、度的线性范围，消线法可得浓度和吸光度的线性范围，消除浓度过高偏离线性的影响，但标准曲除浓度过高偏离线性的影响，但标准曲线的制备时间与测定样品的时间不同，线的制备时间与测定样品的时间不同，容易产生试剂批号、配制、实验温度、容易产生试剂批号、配制、实验温度、仪器工作状态等因素造成的误差。仪器工作状态等因素造成的误差。第71页/共96页单试剂、双试剂、液体试剂单试剂、双试剂、液体试剂1. 1. 单试剂的优缺点单试剂的优缺点 优点：优点：操作简便适用于各类生化分析仪操作简便适用于各类生化分析仪 缺点：缺点：配方复杂（稳定剂、掩蔽剂），稳定配方复杂（稳定剂、掩蔽剂），稳定性差，不能完全避免内外源物质干扰

43、。性差，不能完全避免内外源物质干扰。2. 2. 双试剂的特点双试剂的特点 （1 1）可较彻底排除样品空白和内外源干扰物）可较彻底排除样品空白和内外源干扰物 （2 2）更加符合酶偶联反应的特性和过程）更加符合酶偶联反应的特性和过程 （3 3）试剂配方简单）试剂配方简单 （4 4）试剂稳定，便于储存，运输和使用）试剂稳定，便于储存，运输和使用 （5 5）可用抑制法直接测定某些同工酶）可用抑制法直接测定某些同工酶第72页/共96页3. 3. 液体试剂的优点液体试剂的优点 （1 1）不需手工调制，省工省时）不需手工调制，省工省时 （2 2）试剂批间差小，重复性好）试剂批间差小，重复性好 （3 3）杜绝

44、干粉试剂重溶时因水质差引起试剂变质）杜绝干粉试剂重溶时因水质差引起试剂变质 （4 4）有利于急诊标本）有利于急诊标本 （5 5）按需取量，避免浪费）按需取量，避免浪费第73页/共96页自动生化分析仪主要参数自动生化分析仪主要参数1.1.测定方法学类型的选择测定方法学类型的选择: : 终点法终点法, ,速率法速率法, ,固定时间法固定时间法2.2.温度温度3.3.波长波长4.4.样品与试剂量样品与试剂量5.5.延迟时间延迟时间6.6.测定时间测定时间7.7.浓度校正因子浓度校正因子第74页/共96页四、免疫浊度分析法四、免疫浊度分析法 抗体（抗体（AbAb）与可溶性抗原（）与可溶性抗原（AgAg

45、）反）反应，形成一定结构的免疫复合物，成应，形成一定结构的免疫复合物，成为悬浮于反应溶液中的微粒。在沉淀为悬浮于反应溶液中的微粒。在沉淀反应中形成的复合物微粒具有特殊的反应中形成的复合物微粒具有特殊的光学性质，可用仪器检测，提高了方光学性质，可用仪器检测，提高了方法的速度、灵敏度和易操作性。法的速度、灵敏度和易操作性。第75页/共96页抗原抗原- -抗体沉淀反应的特征抗体沉淀反应的特征1. 1. 抗体过剩区：抗体过剩区：随着抗原浓度增加，随着抗原浓度增加，ICIC也相应增加，浊度增加。也相应增加，浊度增加。2. 2. 等价点：等价点：抗原抗体相当时，所有抗体与抗原形成抗原抗体相当时，所有抗体与

46、抗原形成ICIC，浊度最大，达到，浊度最大，达到等价点。等价点。3. 3. 抗原过剩区：抗原过剩区：抗原过量存在，不但不会形成更多的抗原过量存在，不但不会形成更多的ICIC，反而会引起原，反而会引起原先的先的ICIC溶解，浊度下降，产生虚假的低浓度结果。溶解，浊度下降，产生虚假的低浓度结果。第76页/共96页1 1透射比浊测定法透射比浊测定法 是测定入射光强度由于溶液中粒子的散射而降低的程度，它并不直接测定散射是测定入射光强度由于溶液中粒子的散射而降低的程度，它并不直接测定散射的光强。这一点与分光光度测定法极为类似。用这种方法时，多用聚乙二醇的光强。这一点与分光光度测定法极为类似。用这种方法时

47、，多用聚乙二醇（PEGPEG）作为反应增强剂。这种非离子型聚合物可以降低抗原抗体复合物的溶解）作为反应增强剂。这种非离子型聚合物可以降低抗原抗体复合物的溶解度。度。2 2散射比浊测定法散射比浊测定法 它是直接测定溶液中微粒所散射的光强。散射比浊法也已经用于自动分析仪器它是直接测定溶液中微粒所散射的光强。散射比浊法也已经用于自动分析仪器中。中。第77页/共96页3 3免疫浊度测定中应注意的问题免疫浊度测定中应注意的问题（1 1）伪浊度的影响。）伪浊度的影响。 非特异的交叉反应非特异的交叉反应 增浊剂浓度增浊剂浓度 反应时间反应时间 样品本身的浊度样品本身的浊度 试剂的污染和变质试剂的污染和变质

48、器材不够清洁器材不够清洁第78页/共96页(2)(2)钩状效应（钩状效应（hook effecthook effect）的影响。）的影响。当当AgAg和和AbAb浓度比例不当时，不能有浓度比例不当时，不能有效地形成免疫复合物，产生弱阳性效地形成免疫复合物，产生弱阳性甚至假阴性结果。甚至假阴性结果。(3)(3)严格的室内质控是极必要的。严格的室内质控是极必要的。(4)(4)标准曲线的制作标准曲线的制作. .第79页/共96页五、方法学评价五、方法学评价（一）准确度试验 准确度是指测定值与准确度是指测定值与“真值真值”的符合程度。是评价一项实验方法是否可取的符合程度。是评价一项实验方法是否可取的重

49、要指标。的重要指标。 1 1标准物鉴定标准物鉴定 为了确定和评价方法的准确性，常用基准标准液或参考血清为样本进行检为了确定和评价方法的准确性，常用基准标准液或参考血清为样本进行检测，所得结果经统计学处理，以衡量方法的准确性。测，所得结果经统计学处理，以衡量方法的准确性。第80页/共96页2 2回收试验回收试验 回收率的计算是（回收值回收率的计算是（回收值/ /加入加入值）值）100100，这里的回收值是指，这里的回收值是指标本中加入标准液后的测定值减去标本中加入标准液后的测定值减去标本原来的测定值。回收率达到标本原来的测定值。回收率达到1001005 5者为准确性符合要求的者为准确性符合要求的

50、方法。方法。第81页/共96页回收试验应注意：回收试验应注意： 样品的选用样品的选用 样品最好应用新鲜混合血样品最好应用新鲜混合血清。清。 标准物的加入标准物的加入 应先配制成适当浓度的应先配制成适当浓度的标准物溶液，再加入到基础样品中。所加标标准物溶液，再加入到基础样品中。所加标准溶液量越少越好。准溶液量越少越好。 标准物的加入浓度标准物的加入浓度 最好同时设计几个最好同时设计几个加入不同浓度标准液的试验样品。加入标准加入不同浓度标准液的试验样品。加入标准液后的试验样品的总浓度不能超过本方法的液后的试验样品的总浓度不能超过本方法的线性范围。线性范围。 操作准确操作准确 标准液的加入量必须准确

51、无标准液的加入量必须准确无误，应经多次试验。误，应经多次试验。第82页/共96页（二）精密度试验（二）精密度试验 目前常以重复性试验来衡量一个方法的精密目前常以重复性试验来衡量一个方法的精密度 。 一 般 来 说 ， 标 准 差 、 变 异 系 数 （度 。 一 般 来 说 ， 标 准 差 、 变 异 系 数 （ C VC V s/xs/x100100）小的实验方法精密。）小的实验方法精密。 1 1批内精密度试验批内精密度试验 取一份样品，用欲测项取一份样品，用欲测项目实验方法进行操作，反复测定目实验方法进行操作，反复测定2020次以上，计算次以上，计算每一次的测定结果，然后计算每一次的测定结

52、果，然后计算x x、s s、CVCV。 2 2批间精密度试验批间精密度试验 这种试验也是同一份标这种试验也是同一份标本进行重复测定，至少为本进行重复测定，至少为2020次。但是重复测定不次。但是重复测定不是在一天内完成，而是每天随患者标本一起测定，是在一天内完成，而是每天随患者标本一起测定，再计算再计算x x、s s、CVCV。第83页/共96页（三）灵敏度试验（三）灵敏度试验 灵敏度是单位浓度变化所引起的指示物理量的变化。在定量分析中是指被检灵敏度是单位浓度变化所引起的指示物理量的变化。在定量分析中是指被检测物单位浓度的变化所引起的物理量的变化。测物单位浓度的变化所引起的物理量的变化。 所选

53、用的方法，应进行线性试验，选用线性范围宽度适宜的方法。线性检验所选用的方法，应进行线性试验，选用线性范围宽度适宜的方法。线性检验所得结果，可用回归方程（所得结果，可用回归方程（Y Ya abXbX）处理，回归系数（）处理，回归系数（b b）为灵敏度大小）为灵敏度大小的指标，回归系数大，灵敏度高，反之亦然。不同方法也可用回归系数进行的指标，回归系数大，灵敏度高，反之亦然。不同方法也可用回归系数进行比较，回归系数大的灵敏度高。比较，回归系数大的灵敏度高。第84页/共96页（四）线性试验（四）线性试验 线性试验是衡量一个方法的检测范围的一种实验。通过线性试验，可以了解该方线性试验是衡量一个方法的检测

54、范围的一种实验。通过线性试验，可以了解该方法的最高检测值和最低检测值。法的最高检测值和最低检测值。 超出上下限值的结果是不可靠的，为使结果可靠，遇到这种情况应加大样品用量超出上下限值的结果是不可靠的，为使结果可靠，遇到这种情况应加大样品用量或稀释样品后再次检测。或稀释样品后再次检测。 线性试验的方法基本同标准曲线的制备。一般先进行线性试验，然后在线性范围线性试验的方法基本同标准曲线的制备。一般先进行线性试验，然后在线性范围内制备标准曲线。内制备标准曲线。第85页/共96页（五）特异性及干扰试验（五）特异性及干扰试验 干扰是指标本中存在分析物以外的其他物干扰是指标本中存在分析物以外的其他物质，致使测定结果