如何正确的进行ELISA测定操作(精)

1、如何正确的进行ELISA测定操作临床 ELISAELISA 测定现通常为采用手工操作的以微孔板条为 固相的测定模式， 测定操作非常简单， 一般涉及到标本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告及 解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚。现分述如下。一、临床标本的收集和保存用于 ELISAELISA 测定的临床标本最为常用的是血清 （浆），有时因为 特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。目前临 床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、 肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。对用

2、于激素 和治疗药物测定的血清标本的收集， 要注意收集时间甚或体位有可能 会对测定结果产生影响。如可的松在早晨 4 46 6 点之间，会有一峰值 出现：生长激素、促黄体激素（LHLH）和促卵泡激素（FSHFSH）均以阵 发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间 间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。又如当从卧位变为站 立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应 根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体 的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响，只是在处理和保存方面要考虑以下几个 方面：(1)

3、 要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团， 其有类似过氧化物的活性，因此，在以 HRPHRP 为标记酶的 ELISAELISA 测定 中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸 附于固相，从而与后面加入的 HRPHRP 底物反应显色。(2) 样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则 细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作 用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的 伊半乳糖苷酶本身会对用 相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。(3) 血清标本如是以无菌操作分离，则可以在 2 28 8 C 下保存一 周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本

4、的长时间保存，应在-70-70 C 以下。(4) 冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。 标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生 破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。(5) 标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应 离心沉淀后取上清检测。二、试剂准备在临床实验室，对试剂准备一般不太注意，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用， 而忽略了这种做法有可能影响后面 温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现 假阴性。因此在 ELISAELISA 测定中试剂的准备最为关键的

5、是，在实验开 始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置2020 分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要 是为了在后面的温育反应步骤中， 能使反应微孔内的温度能较快地达 到所要求的高度，以满足测定要求。其次，目前的商品ELISAELISA 试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。此外，当试剂盒以0P0PD D 为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。三、加血清样本及反应试剂在现在的 ELISAELISA 商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是唯一的要 使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器

6、加样必须注意的关 键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。 加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非 包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则 反应液界面有差异。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中 滴加， 除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象， 这样就会在孔内的非包 被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。所以，有时候一份标本 用相同的试剂盒这次测定为阳性， 下次测定为阴性，往往就是上述加 样及试剂的错误所致。四、温育温育是 ELISAELISA 测定中影响测定成败最为

7、关键的一个因素。ELISAELISA 作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行， 要使液 相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。 温育所需时间与温度成反比， 即温度 越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有3737 C和室温，其次是 4343 C 和 2 28 8 C。温育这一步是临床 ELISAELISA 测定中最容易出现问题的步骤。通常目 前国内 ELISAELISA 商品试剂盒的反应温育时间为 3737 C 3030 分钟1 1 小时, 进口 ELISELISA A试剂盒则通常为 3737C 1 12 2 小时才能有较完

8、全的结合， 低于 1 1 小时，可能会影响测定下限。因此，关于温育，在实际测定操 作中一定要注意以下几点：要保证在设定的温度下有足够的反应时间。一般来说，加完样本 和/ /或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温 度从室温升至 3737 C,需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非 水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而在临床实验室中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时， 这样 就很容易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问 题。曾有一地处南方的血站同行提出了一个问题，就是在每一年的冬季总有那么一个多月的时间，在做 HBsAgHBsAg 测定的室内质控中，测定 由卫生部临床检验中心供应的 1 1 ng/mlng/ml 弱阳性样本时，总是测不出 来，不知原因为何？这可能就与南方冬天室内温度较低有关，此时微孔板转入温箱后 3737 C温育时间不够，以致弱阳性样本测定为阴性。因此，为保证 3737C 下足够的温育时间，临床实验室可自行确定本实 验室不同季节（不同室温下）微孔板从室温拿至温箱