餐厨废油脂高效利用菌种及其产物的研究

1、餐厨废油脂高效利用菌种及其产物的研究* 基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103）。第一作者简介：李泳诗（1994.1-），女，研究方向为生物技术。李泳诗，许进莉，陈盈盈，梁燕萍，黄静怡，刘敏玲，李秋霞，曾丽娟广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了利用餐厨废油脂制备生物表面活性剂，从长期受餐厨废油脂污染的土壤中筛选生物表面活性剂高产菌种。在研究过程中，主要对土壤样品进行平板初筛和摇瓶发酵复筛，对优选菌种进行菌体形态特征、生理生化特征和16S rDNA等方面的鉴定，对优选菌种发酵产物进行分离纯化、临界胶束浓度分析和乳化活性分析。获得1株高效的菌种NH

2、26，被鉴定为皮氏罗尔斯顿菌。菌种NH26的纯化产物经薄层层析显色分析和傅立叶红外光谱分析，被确定为脂肽类生物表面活性剂。该生物表面活性剂的临界胶束浓度为126 mg/L，能够使水的表面张力下降至22.465 mN·m-1。在临界胶束浓度下，该生物表面活性剂对花生油、大豆油、菜籽油、玉米油、煤油和柴油的乳化率均大于50%。关键词：餐厨废油脂；高效利用；生物表面活性剂；菌株Study on strain of high ability of utilizing waste cooking oil and characteristics of its productLI Yong-shi

3、, XU Jin-li, CHEN Ying-ying, LIANG Yan-ping, HUANG Jing-yi, LIU Min-ling, LI Qiu-xia, ZENG Li-juan, DENG Mao-cheng, CHEN Wei-xin, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to produce biosurfactant (BS) from waste cooking oil, strains having the ability to gener

4、ate biosurfactant were isolated and screened from the soil sample with long time contaminated by waste cooking oil. During the study process, initial screen with flat and repeat screen with shake flask fermentation were applied. The systematic investigations of morphology, physiological and biochemi

5、cal characteristics and 16S rDNA sequences analysis was carried out. At the same time, separation and purification means, critical micelle concentration (CMC) analysis and emulsifying activity analysis (E24) of the fermentation product with preferred strain were conducted on. A high producing biosur

6、factant strain NH26 was obtained and identified as Ralstonia pickettii. Purified product of NH26 was identified as lipopeptide biosurfactant by thin layer chromatograph (TLC) color reaction and fourier transform infrared (FT-IR) spectrum analysis. The critical micelle concentration of the lipopeptid

7、e was 126 mg/L and this moment could lower the surface tension of lipopeptide solution to 22.465 mN/m. The emulsification rates (E24) of this lipopeptide against to different oils, including peanut oil, soybean oil, vegetable seeds oil, corn oil, kerosene and diesel oil were measured and all exceede

8、d by 50% under the CMC.Key words：waste cooking oil；high utilization；biosurfactant；strain引言餐厨废油脂是人们在餐厨活动、食品加工等过程中产生的废弃油脂、油水混合物以及经过处理的“地沟油”1。据估计，我国食用油脂的年消费量达2250万吨左右，重返餐桌的“地沟油”约有300万吨2。国家已经明令禁止餐厨废油脂重返餐桌、食品工业、饲料工业以及涉及食物链的领域。但是，餐厨废油脂是一种具有利用性很强的特殊废弃物，国内外研究人员高度关注餐厨废油脂的回收利用，并在利用它制备生物柴油、化工原料等领域取得一些研究成果3。 生物

9、表面活性剂是由微生物代谢产生的表面活性剂，它具有化学表面活性剂无法比拟的优点，如无毒或低毒性、生物可降解性、对长链烃类化合物的优良乳化性以及环境友好性4。迄今为止，生物表面活性剂已在日用化工品生产、石油三次开采、环境污染治理等领域得到应用5。据报道，一些烃类化合物降解微生物往往能够产生生物表面活性剂6，但以餐厨废油脂制备生物表面活性剂仍然少有报道。为了高效地利用餐厨废油脂制备生物表面活性剂，我们开展了高效菌种的筛选工作，并对发酵产物的特性进行了初步分析。1 材料与方法1.1 材料 餐厨废油脂：采集某火锅店的废弃油脂，经水分去除的处理，作为培养基的碳源；筛选样品：在广东轻工职业技术学院南海校区内

10、选定一个小区域土地(直径约为20cm)，每天以少量餐厨废油脂浇淋，经5个月的自然培养，采集土壤作为菌种筛选样品。1.2 富集培养与平板分离 富集培养基：废油脂20 g/L，蛋白胨 5 g/L，NH4Cl 2 g/L，KH2PO4 1 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L， MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，NaCl 5 g/L，调节pH7.0。平板培养基：NH4NO3 1.5 g/L，KH2PO4 1 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 5

11、g/L，琼脂20 g/L，调节pH7.0。斜面培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母膏 10 g/L，琼脂 20 g/L，调节pH7.0。以上培养基的灭菌条件：121 °C灭菌20 min。 称取10 g土壤样品，放入200 mL的富集培养基中，于30 °C、200 rpm的条件下培养24 h。然后，用无菌水对培养液进行梯度稀释，涂布于分离平板上，在将等量的无菌废油脂涂布在分离平板上，于30 °C培养48 h。用无菌的竹签挑取菌落，接入斜面培养基，于30 °C培养20 h，放入4 °C冰箱进行保藏，备用。1.3 生物表面活性剂

12、产生菌的筛选 种子培养基：葡萄糖 20 g/L，酵母膏 10 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，调节pH7.0。摇瓶发酵培养基：废油脂40 g/L，蛋白胨 2 g/L，NH4Cl 2 g/L，KH2PO4 1 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L， MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，NaCl 5 g/L，调节pH7.0。以上培养基的灭菌条件：121 °C灭菌20 min。 将各菌株的斜面菌种接入种子培养基，于30

13、 °C、200 rpm的条件下培养12 h。然后，按10%的接种量，将种子培养液接入发酵培养基，于同样条件下培养48 h。调节发酵液的pH至8.0，于12000 rpm下离心20 min，将清液置于分液漏斗中，静置30 min，取下部的液体，采用A101型全自动表面张力仪（美国科诺工业有限公司）分别测定表面张力，并检测它对煤油的乳化率。根据表面张力和对煤油的乳化率，优选生物表面活性剂产生菌。1.4 优良菌种的鉴定 菌种经革兰氏染色，用普通显微镜观察菌体形态。用扫描电镜观察菌体，并进行摄像4。根据Bergys Manual of Determinative for Bacteriolo

14、gy介绍的方法7，对菌种进行生理生化试验。参考文献介绍的分子生物学鉴定方法8，对菌种进行16S rDNA鉴定。1.5 生物表面活性剂的提取与纯化 调节发酵液的pH至8.0，于12000 rpm下离心20 min，再调节pH至2.0，静置于4 °C下12 h，再经离心分离，收集沉淀物9。预先将200目硅胶装填在玻璃层析柱(25×400 mm)内，称取10 g 沉淀物，溶于甲醇，与少量的200目硅胶拌匀，装入玻璃层析柱顶部，依次用氯仿、氯仿/甲醇(10:1)的混合液、氯仿/甲醇(8:1)的混合液、氯仿/甲醇(6:1)的混合液、氯仿/甲醇(4:1)的混合液、氯仿/甲醇(2:1)的

15、混合液、甲醇进行洗脱，各种洗脱液的体积为200 mL，洗脱速度为1 mL/min，收集氯仿/甲醇混合液洗脱过程的流出液，每20 mL收集1管，于紫外分光光度计上扫描吸收值最大的波长，合并相同的流出液。采用旋转真空蒸发仪，蒸发去除各种流出液的溶剂，得到各种组分。将各种组分配制成1 g/L的溶液，测定表面张力，选择表面张力最低的组分进行进一步的分析。1.6 薄层层析与显色分析 将1.6中优选的组分点样于硅胶薄板上，采用氯仿/甲醇/水为65/25/4的展开剂进行层析9，烘干，置于115 °C下进行原位硫酸水解24 h。然后，分别采用茚三酮显色剂、苯酚-硫酸显色剂和碘蒸汽显色剂进行喷雾，烘干

16、，观察显色情况4。如果有显色，根据显色斑点测定Rf值。1.7 傅立叶红外光谱分析 将上述制备所得的组分与KBr混匀，经7000 kg的压力制成片剂，置于傅立叶红外光谱仪上扫描，扫描区间为4000 cm-1-400 cm-1，根据红外吸收光谱分析生物表面活性剂的官能团10。1.8 临界胶束浓度的分析 将上述制备所得的组分配制成梯度浓度的溶液，采用表面张力仪测定表面张力，以测量值绘制曲线，分析临界胶束浓度(CMC)。1.9 乳化活性的分析 将上述制备所得的组分配制成CMC，分别与等体积的花生油、大豆油、菜籽油、玉米油、煤油和柴油进行混合，经激烈振荡3 min，静置24 h，测量乳化率。1.10 表

17、面张力的测定方法 利用表面张力仪，采用铂金环法测量溶液的表面张力4。1.11 乳化率的测定方法 吸取被乳化的物质5 mL，加入具刻度试管，然后加入5 mL生物表面活性剂溶液，于3000 rpm的蜗旋振荡仪上振荡3 min，在室温环境中静置24 h，测量乳化层高度和总液层高度，按下式计算乳化率(E24)11：2 结果与讨论2.1 生物表面活性剂产生菌的筛选 平板培养基以废油脂为唯一碳源，经平板分离，共挑取33个能利用废油脂的菌株。通过摇瓶发酵筛选，较好的6株菌种的发酵结果如表1所示。6株菌种的发酵液对煤油的乳化率达40%以上，其中菌种NH26的乳化率最高，达到58.5%。煤油通常作为生物表面活性

18、剂的乳化对象，良好的生物表面活性剂对煤油的乳化率一般为50%65%1213。这6株菌种发酵液的表面张力居于22.46537.627 mN·m-1之间，其中菌种NH26的表面张力最低。表面张力是生物表面活性剂的重要指标，鼠李糖脂是常见的优良生物表面活性剂，据文献报道，它一般能够使水的表面张力由72 mN·m-1降低至29 mN·m-1左右1415。通过比较，菌种NH26是一株能够利用废油脂产生表面活性剂的菌种，且所产表面活性剂具有较强的活性，故优选该菌种进行进一步的研究。表1 较好6株菌种的摇瓶发酵结果Table 1 Result of shake flask fe

19、rmentation of 6 strains with better effect 菌株编号对煤油的乳化率(E24) / %表面张力 / mN·m-1NH07NH10NH15NH26NH29NH3146.7 ± 0.450.2 ± 0.640.2 ± 0.658.6 ± 0.540.7 ± 0.641.9 ± 0.530.512± 0.38532.834 ± 0.26935.753 ± 0.34122.465 ± 0.31637.627 ± 0.41534.336 

20、7; 0.3942.2 菌种NH26的鉴定 菌种NH26在分离平板上的菌落呈白色、圆形，边缘不整齐，表面粗燥、无光泽。革兰氏染色呈阳性，菌体为长杆状，经扫描电镜观察与摄像(如图1所示)，菌体大小约为(6.88.8) µm × (1.2 1.5) µm。菌种NH26的生理生化试验结果如表2所示。16S rDNA经PCR扩增、纯化与测序，获得1443 bp的序列。将该序列在NCBI中同源性检索，可发现菌种NH26与大量的皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)具有99%的同源性。采用Neighbor-joining法对菌种NH26构建系统发育树，如图2

21、所示。由图2可见，菌种NH26与登录号为NR102967.1的Ralstonia pickettii 12J的亲缘关系最接近。因此，菌种NH26被鉴定为皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)。图1 菌种NH26的扫面电镜照片(×5,000)Fig. 1 SEM photographs of cell morphology of strain NH26(×5,000)表2 菌种NH26的生理生化试验结果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain NH26试验项目反应结果芽孢染

22、色甲基红试验V-P试验吲哚试验氧化酶接触酶酪蛋白水解硝酸盐利用淀粉水解明胶液化葡萄糖发酵蔗糖利用麦芽糖利用柠檬酸利用-+-+-+注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。图2 菌种NH26的系统发育树Fig.2 The sequence phylogenetic analysis of strain NH262.3 薄层层析与显色分析 菌种NH26的产物经硅胶柱层析，获得表面张力为22.465 mN·m-1的组分，该组分的表面张力最低，在230 nm波长具有最大吸收值，故被选择为进一步分析的对象。通过硅胶板薄层层析、原位水解和显色反应，结果如表3所示。纯化产物经水解，与茚三酮显色剂反应有红

23、色斑点，表明有氨基酸或肽的存在；与碘蒸汽显色剂反应呈黄色斑点，表明有脂类物质的存在；与苯酚-硫酸显色剂无反应，表明无糖类物质存在。从显色结果判断，纯化组分可能是一种脂肽类生物表面活性剂。在层析板上，只有一个斑点存在，说明纯化产物的纯度较高，该产物的Rf值为0.56。表3 显色反应结果Table 3 Results of color reactions显色剂显色结果茚三酮碘蒸汽苯酚-硫酸红色斑点黄色斑点无显色2.4 傅立叶红外光谱分析 上述纯化产物的傅立叶红外光谱如图3所示。3444 cm-1和3352 cm-1处的宽吸收峰是OH和NH基团伸缩振动所产生；2963 cm-1和2807 cm-1处

24、的吸收峰是CH3、CH2基团伸缩振动所致，说明产物含有饱和脂肪链；1672 cm-1处的吸收峰是由酰胺键CO-N所致；1455 cm-1处的吸收峰是由C=O伸缩振动所致；1318 cm-1处的吸收峰是由C-O伸缩振动所引起。图3的红外光谱与一些文献报道的脂肽的特征吸收峰相似1617，因而进一步推断生物表面活性剂是脂肽。图3 傅立叶变换红外光谱Fig.3 FT-IR spectrum of the purified product2.5 临界胶束浓度的分析 据报道，不同生物表面活性剂的CMC差别较大，已知一些生物表面活性剂的CMC范围为30386 mg/L181920。在本实验中，不同浓度生物表

25、面活性剂的表面张力曲线如图4所示。从图中可看出，表面张力随着生物表面活性剂的浓度增大而呈下降趋势，当浓度增大至126 mg/L时，溶液的表面张力下降至22.465 mN·m-1。尔后继续增大浓度时，表面张力不再下降，因而可确定生物表面活性剂的CMC为126 mg/L。这表明了该表面活性剂具有高效性。图4 不同浓度的表面张力曲线Fig. 4 Changes of surface tension for different biosurfactant concentration2.6 乳化活性的分析 生物表面活性剂对不同烃类物质的乳化率如图5所示。可以看出，生物表面活性剂对花生油、大豆油

26、、菜籽油、玉米油、煤油和柴油的乳化率(E24)分别为52.7%、59.8%、53.1%、53.4%、58.6%和61.3%，E24均大于50%，表明菌种NH26具有较高的活性。图5 生物表面活性剂对不同烃类物质的乳化率Fig. 5 E24 of lipopeptide against different hydrocarbon compounds3 结论 以长期受餐厨废油脂污染的土壤为筛选材料，经过平板初筛和摇瓶发酵复筛，获得1株高效利用废油脂产生物表面活性剂的菌种NH26。对菌体形态特征、生理生化特征和16S rDNA等方面进行观测，菌种NH26被鉴定为皮氏罗尔斯顿菌。通过对菌种NH26发酵

27、产物的分离纯化、薄层层析显色分析和傅立叶红外光谱分析，纯化产物被确定为脂肽类生物表面活性剂。纯化所得脂肽的CMC为126 mg/L，它能够使水的表面张力下降至22.465 mN·m-1。在脂肽的CMC下，脂肽溶液对花生油、大豆油、菜籽油、玉米油、煤油和柴油的乳化率(E24)均大于50%，表明菌种NH26所产生物表面活性剂具有较强的乳化活性。本实验为废油脂的综合利用提供了一株具有巨大应用潜力的菌种，但仍需对发酵工艺和产物纯化工艺进行深入的研究，以便使它在废油脂综合利用工业中得到应用。参考文献1 傅丽萍, 毛倩倩. 餐厨废弃油脂处理管理和资源化利用探讨J. 再生资源与循环经济, 2012

28、, 9: 39-41. 2 许华峰. 废弃餐厨油脂的外国技术处理经验借鉴J. 广东科技, 2012, 15:233-234. 3 香永强, 樊静波. 餐厨废弃物油脂提取技术的研究J. 河南科技, 2013, 11: 30-31. 4 余奎, 李静, 邓毛程, 等. 一株鼠李糖脂产生菌的筛选及其产物特性分析J. 食品科技, 2014, 39(6): 12-16. 5 Khopade A., Ren B., Liu XY., et al. Production and characterization of biosurfactant from marine Streptomyces specie

29、s B3 J. Journal of Colloid and Interface Science, 2012, 367: 311-318. 6 Das P, Mukherjee S, Sen R. Improved bioavailability and biodegradation of a model polyaromatic hydrocarbon by a biosurfactant producing bacterium of marine origin J. Chemosphere, 2008, 72: 1229-1234.7 Holt SG, Kriey NR, Sneath P

30、HA, Staley JT, Williams ST. Bergys Manual of Determinative for Bacteriology. Williams and Wilkins, New York, 1998. 8 Deng MC., Li J., Liang FR., et al. Isolation and characterization of a novel hydrocarbon-degrading bacterium Achromobacter sp. HZ01 from the crude oil-contaminated seawater at the Daya Bay, southern China J. Marine Pollution Bulletin, 2014, 83:79-86. 9 曹小红, 廖振宇, 王春玲, 等. Bacillus natto TK-1产脂肽的纯化、抑菌活性及其表面活性剂特性J. 中国生物工程杂志, 2008, 28(1): 44-48. 10 赵辉, 闫华晓, 杨腾, 等. 高效生物表面活性剂产生菌筛选及其性质研究J. 生物技术, 2010, 20(1):76-78. 11 Cooper DG, Goldenberg BG. Su