蛋白质与DNA的相互作用PPT课件

1、 分类： 与单链RNA结合 与茎环结构结合 与双链DNA结合：普遍性结合 特异性结合第1页/共36页 蛋白质与DNA结合的特性：1.DNA识别部位有二度对称性。蛋白质一般是有二度对称结构的二聚体，两个单体具有旋转对称性，与硷基的旋转对称吻合。2.蛋白质和DNA的接触区只在DNA的一侧。3.在结合过程中，蛋白质和DNA都有构像改变。4.普遍性结合：蛋白质中带正电荷氨基酸与DNA骨架的磷酸基团形成离子键。5. 特异性结合：识别螺旋区内氨基酸与DNA特定硷基接触。第2页/共36页 蛋白质与DNA的普遍性结合中DNA特点： 蛋白质与DNA主链骨架接触，大多数涉及磷酸二酯键中的氧原子。 与DNA硷基序列

2、特异性无关 结构的匹配性： 旋转对称性 特定距离的相反电荷 形成氢键基团排布上的匹配 形成足够大的范德华力第3页/共36页1.蛋白质和DNA都存在0.7nm 的重复距离 DNA双螺旋单链相邻磷酸基团间的距离是0.7nm。 折叠，N原子间距离是0.7nm 伸展折叠C间距离是0.7nm 螺旋，Arg和Lys被另外三个残基隔开，带正电荷侧链的距离是0.7nm.2.DNA对称性 平移对称： GCATCT GCATCT CGTAGA CGTAGA 第4页/共36页二重轴对称 GCATCT TCTACG CGTAGA AGATGC 二重旋转对称 GCATCT AGATGC CGTAGA TCTACG旋转对

3、称 GCATCT CGTACA CGTAGA GCATGT 第5页/共36页 蛋白质与DNA特异性结合中DNA特点： 大沟内存在特异性识别信息 氨基酸与碱基对共平面 氨基酸和碱基对之间形成氢键 第6页/共36页第7页/共36页第8页/共36页NNOHNNNHNNONHCOOCCNHHNHHHGluAgrH第9页/共36页 蛋白质与DNA普遍结合中蛋白质特点： -折叠结构的带正电荷残基与磷酸集团结合 可能是通过识别小沟结构实现 1.富含脯氨酸和碱性氨基酸 组蛋白有重复的SPKK Ser/Thr-Pro-Lys/ArgLys/Arg PRGRP序列与A-T碱基对结合 KPRGRPK序列也能与小沟A

4、-T结合 2.碱性螺旋 组蛋白H1C端57个氨基酸 Lys和Gly,Lys在螺旋两侧，Gly夹在中间 第10页/共36页3.蛋白磷酸化作用 SP X X： Ser磷酸化 TPKK： Tyr磷酸化 磷酸化后和DNA结合能力下降 磷酸化失去氢键第11页/共36页 蛋白质与DNA特异性结合中蛋白质特点： 1.蛋白质多形成二聚体第12页/共36页 HTH复合物第13页/共36页第14页/共36页 同源盒结构第15页/共36页 亮氨酸拉链结构NH2COOH碱性氨基酸AgrAgr和LysLys第16页/共36页锌指结构 Agr和G形成氢键第17页/共36页第18页/共36页 细胞核蛋白质的提取 收集细胞，

5、洗去血清和培养基 裂解细胞：Triton X-100 NP-40 去胞浆成分 裂解细胞核：高浓度KCl :600mM 变更缓冲液浓度第19页/共36页 快速抽提 裂解液： 提取液： 10mM HRPES 250mM Tris 1mM EDTA 60mM KCl 60mM KCl 1mM DTT 1mM DTT 1mM PMSF 1mM PMSF pH 7.9 0.5% NP-40 pH 7.9第20页/共36页 1X107细胞100ul裂解液、冰浴5分钟、离心沉淀用不含NP-40的裂解液洗一次100ul提取缓冲液干冰异丙醇速冻，反复冻融3次离心沉淀 800C保存第21页/共36页 凝胶滞后试验

6、第22页/共36页1.蛋白质和DNA结合复合物半衰期短 电泳缓冲液低离子强度 凝胶的笼效应2.探针以20-200bp 为宜。过小不利于蛋白结合，过大增加非特异性结合。3.用竞争性抑制检测DNA与蛋白质结合的特异性4.加3ug Poly(dI-dC)减少非特异性结合5.超级凝胶电泳增强蛋白质的凝胶阻滞作用6.只能确定结合，无法确定序列第23页/共36页DNA足迹分析第24页/共36页DNA足迹分析第25页/共36页1.DNAase随机水解核苷酸磷酸二酯键 每一个DNA分子最好只切一次2.蛋白质与DNA结合保护DNA不被切割3.电泳用的是变性凝胶： 相差一个核苷酸DNA彼此分开 蛋白质从DNA分子

7、上脱落4.可确定与蛋白质结合的DNA序列5.DNA序列是固定的第26页/共36页第27页/共36页随机PCR 凝胶阻滞试验：蛋白质和DNA结不结合， 不能确定结合的序列 DNA足迹分析：蛋白质结合DNA的序列 不能确定序列硷基变化对 结合的影响 随机PCR:结合序列硷基变化对结合的影响第28页/共36页 寡核苷酸设计与合成：1.AAGAATTCNNNNNNNNNGGATCCAA2. 引物合成3.标准结合反应寡核苷酸的合成4.电泳回收第29页/共36页 探针标记： 合成的含随机序列的单链寡核苷酸 3引物 32PdCTP dNTP(不包括dCTP) Klenow酶电泳纯化第30页/共36页 凝胶阻

8、滞试验纯化探针1.蛋白质与标准结合寡核苷酸结合 蛋白质与随机寡核苷酸结合 电泳（样品隔开，防污染）2.凝胶回收3.酚、氯仿去蛋白4.PCR（底物加32PdCTP）5.PCR产物再做凝胶阻滞试验，反复纯化第31页/共36页 特异结合序列的克隆和序列分析： 酶切随机核苷酸序列与质粒重组 用引物对质粒序列进行分析 N1 N2 N3 N4 N5A 14/0.32 13/0.30 4/0.11 5/0.11 14/0.32C 9/0.21 12/0.27 23/0.52 26/0.59 7/0.16G 4/0.01 6/0.14 6/0.14 9/0.21 19/0.43T 17/0.39 13/0.30 11/0.25 4/0.01 4/0.01 T/A A/T/C C C G/A 超过50%：确定不可替换25-50%：两种硷基可替换小于25%：没有硷基特异性 第32页/共36页SouthWestern杂交试验 确定与DNA结合的蛋白质分子量 蛋白质进行SDS-Pa