肺结核的新诊断技术PPT课件

1、NTP中现行实验室技术中现行实验室技术 涂片：萋尼染色显微镜检涂片：萋尼染色显微镜检 培养：固体培养基：简单法、离心法培养：固体培养基：简单法、离心法 药敏：固体培养基：绝对浓度法、比例法药敏：固体培养基：绝对浓度法、比例法 菌种鉴定：鉴别培养基生化试验菌种鉴定：鉴别培养基生化试验传统实验室技术不能适应不断深入的结核病防治工作的需要传统实验室技术不能适应不断深入的结核病防治工作的需要第1页/共35页实验室新诊断技术总览实验室新诊断技术总览 细菌学检测方法 发光二极管荧光显微镜（LED） 液体培养 分子生物学检测方法 Genexpert HAIN Genechip 免疫学检测方法 ELISOPT

2、&TSPOT 和Quantiferon 血清学诊断方法第2页/共35页 CO2 pH第3页/共35页BACTEC TB460标本经前处理接种至含有标本经前处理接种至含有14C-棕榈酸的棕榈酸的12B培养基，培养基，37C培养。分枝杆菌分解培养。分枝杆菌分解14C-棕榈酸，产生棕榈酸，产生14CO2，BACTEC TB460仪自动检测，仪自动检测，14CO2含量，并换算成生长含量，并换算成生长指数（指数（GI）。）。快速：将分离培养的阳性检出时间由常规培养所需的快速：将分离培养的阳性检出时间由常规培养所需的2-8周周缩短至缩短至3-14天，将药敏试验的报告时间由常规方法的天，将药敏试验的

3、报告时间由常规方法的4周缩周缩短至短至1周。周。操作简便、灵敏度高，可进一步做药敏试验、菌种初步鉴定。操作简便、灵敏度高，可进一步做药敏试验、菌种初步鉴定。放射性同位素污染。放射性同位素污染。仪器与试剂价格昂贵。仪器与试剂价格昂贵。未实现全自动化未实现全自动化污染率高污染率高第4页/共35页是是BACTEC TB460的换代产品。标本经前处理后接种到系统的换代产品。标本经前处理后接种到系统配套的液体培养基，该培养基中包被有对氧浓度敏感的荧光物质，配套的液体培养基，该培养基中包被有对氧浓度敏感的荧光物质，当细菌生长代谢消耗培养基中的氧时，氧浓度降低，荧光被激发，当细菌生长代谢消耗培养基中的氧时，

4、氧浓度降低，荧光被激发，系统可以连续检测荧光水平，自动报告结果。系统可以连续检测荧光水平，自动报告结果。 系统进一步优化，操作更简便、自动化更强。系统进一步优化，操作更简便、自动化更强。 解决了解决了BACTEC TB460的同位素污染问题。的同位素污染问题。 24小时连续检测，有利于早期报告阳性结果。小时连续检测，有利于早期报告阳性结果。 仪器与试剂价格更昂贵。仪器与试剂价格更昂贵。 未能解决高污染率的问题未能解决高污染率的问题第5页/共35页1Cruciani M, et al. JCM 2004; 42:2321-23252 Mean of 14 studies in MGIT960 =

5、 10.7% (2.0-30.0) = acceptable range培养方法培养方法敏感性敏感性(95% CI)结果报告周期结果报告周期污染污染 (%)涂阳涂阳涂阴涂阴罗氏培养罗氏培养0.76 (0.73-0.79)22.333.73 5MGIT9600.88 (0.84-0.91)11.716.513.8-16.6210.7(2.0-30.0)5 10MGIT + 罗罗氏氏0.92 (0.87-0.95)第6页/共35页MGIT 7 mlMGIT 7 mlMGIT 7 mlMGIT 7 mlMGIT 7 mlMGIT 7 mlMGIT 7 ml +SMGIT 7 ml +IMGIT 7

6、ml +RMGIT 7 ml +EGCSIRE0,8 ml BACTEC MGIT SIRE 补充剂每种药物每种药物0,1 ml转移 0,5 ml 阳性 MGIT 培养物0,1 ml 阳性 MGIT 培养物9,9 ml 蒸馏水转移 0,5 ml插入BACTEC MGIT 960BACTEC MGIT 960 TB 药敏试验 第7页/共35页LED显微镜显微镜 发光二级管发光二级管 (LED) 技术技术 提供价廉、稳定的光源提供价廉、稳定的光源 寿命寿命 150,000 h 反复开关不影响寿命反复开关不影响寿命 不释放有毒气体不释放有毒气体 不需要暗室不需要暗室 操作人员工作负荷减轻操作人员工作

7、负荷减轻第8页/共35页第9页/共35页 GenoType MTBDRplus, HAIN 检测结核分枝杆菌复合群以及利福平、异烟肼耐药相关的检测结核分枝杆菌复合群以及利福平、异烟肼耐药相关的突变突变 检测检测XDR的试剂盒也已经发布的试剂盒也已经发布 INNO-Lipa Rif TB 检测结核分枝杆菌复合群以及于利福平耐药相关的突变检测结核分枝杆菌复合群以及于利福平耐药相关的突变 大多数利福平耐药的菌株同时也耐异烟肼大多数利福平耐药的菌株同时也耐异烟肼 WHO 鼓励使用的工具鼓励使用的工具 可使用涂阳痰标本和培养物进行操作可使用涂阳痰标本和培养物进行操作 快速、简便易用，仅需基本快速、简便易

8、用，仅需基本PCR技术技术 然而，价格比较昂贵，且不能检测造成耐药突变的热点区域外然而，价格比较昂贵，且不能检测造成耐药突变的热点区域外的突变的突变10第10页/共35页MTBDRplus 操作流程操作流程1) DNA提取提取用用NALC/NaOH处理痰标本处理痰标本2) PCR扩增扩增3) 杂交杂交扩增产物和扩增产物和 固化在固化在膜上的特异性探针杂交膜上的特异性探针杂交4) 结果判读结果判读第11页/共35页rpoB 野生型探针: WT1 - WT8rpoB 突变探针: MUT1-3: D516V, H526Y, H526D, S531L 野生型缺失 野生型突变MTBDRplus rpoB

9、511513516518522526531533rpoB WT2rpoB WT4rpoB WT6rpoB WT8rpoB WT7rpoB MUT1 (D516V)rpoB MUT3 (S531L)rpoB MUT2A (H526Y)rpoB MUT2B (H526D)514515rpoB WT1rpoB WT3rpoB WT5509508505第12页/共35页katG 基因突变MTBDRplus katG野生探针区域突变探针突变KatG WT315KatG MUT1S315T1KatG MUT2S315T2第13页/共35页MTBDRplus inhA野生探针区域突变探针突变InhA WT1

10、-15InhA MUT1C15T-16InhA MUT2A16GInhA WT2-8InhA MUT3AT8CInhA MUT3BT8AinhA 基因突变第14页/共35页MTBDRplus 反应条带(示范)第15页/共35页南非的经验：南非的经验： Genotype MTBDR plus assay: 直接从涂片阳性标本中检测直接从涂片阳性标本中检测rpob基因突变基因突变 (耐利福耐利福平平), katG 基因基因 (高浓度异烟肼耐药高浓度异烟肼耐药), inhA 基因基因(低浓度异烟肼耐药低浓度异烟肼耐药) 灵敏度、特异度，阳性预测值、阴性预测值灵敏度、特异度，阳性预测值、阴性预测值 耐

11、利福平耐利福平 98.9, 99.4, 97.9, 和和99.7 耐异烟肼耐异烟肼 94.2, 99.7, 99.1, 和和 97.9 耐耐MDR-TB 98.8, 100, 100, 和和 99.7Barnard M, et al. Am J Respir Crit Care Med 2008;177:787-92第16页/共35页激光共焦扫描仪软件判读结核耐药检测芯片获北京市自主创新产品证书样品制备仪杂交仪n 通 量：两个一线抗结核药n 速 度： 6 小时（比传统药敏试验法快 50-100 倍）n 灵敏度：103 CFU/反应n 特异性：对照设计严谨；自动判读基于rpoB/katG/inh

12、A的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 13:914-920, 2009（IF=2.3）17获国家医疗器械证书和欧盟CE认证第17页/共35页Xpert MTB/RIF 检测结核分枝杆菌检测结核分枝杆菌 检测利福平耐药检测利福平耐药 直接标本检测直接标本检测 100分钟可获得结果分钟可获得结果第18页/共35页工作流程工作流程 痰 简单，仅需1个步骤的准备工作 获得结果的时间 16 样本 / 天 / 模块 不需要生物安全规 综合控制性能性能 对 M

13、TB特异 敏感性与培养相似 通过rpoB 基因检测利福平耐药产品和系统设计产品和系统设计 GeneXpert 系统的检测模块 测试模块的扩大和交换 对非分枝杆菌实验室人员仅需要最多1天的培训GeneXpert样本准备、扩增、样本准备、扩增、检测自动化检测自动化痰标本可以直接放痰标本可以直接放入模块中，而无需入模块中，而无需与任何试剂进行混与任何试剂进行混合处理合处理第19页/共35页报告结果时间报告结果时间: 1 h 45 minGeneXpertDNA 分子与分子与PCR试剂混合试剂混合样本自动过滤和清洗样本自动过滤和清洗超声裂解捕获的生物体，释超声裂解捕获的生物体，释放放DNA半嵌套实时半

14、嵌套实时PCR扩增扩增 & 检测检测集成反应管集成反应管456浓缩细菌去除抑制剂浓缩细菌去除抑制剂12标本液化和作用标本液化和作用15分钟后转移分钟后转移 2 ml3 结束手工工作结束手工工作7结果可打印结果可打印Xpert MTB/RIF第20页/共35页单中心评估研究（初步结果）单中心评估研究（初步结果）不同研究设计和研究人群，肺结核和肺外结核标本不同研究设计和研究人群，肺结核和肺外结核标本检测结核检测结核汇总的未经校正的敏感性汇总的未经校正的敏感性 92%汇总的未经校正的特异性汇总的未经校正的特异性 98%检测利福平耐药检测利福平耐药汇总的未经校正的敏感性汇总的未经校正的敏感性

15、98%汇总的未经校正的特异性汇总的未经校正的特异性 99%第21页/共35页操作方面操作方面 废弃物管理废弃物管理 如痰标本容器如痰标本容器 储存和供应储存和供应 反应盒庞大反应盒庞大, 2 - 28C, 有效期有效期12个月个月 电力供应电力供应 UPS (400 VA) 或电池组或电池组 培训培训 需求不高需求不高 (使用计算机、预防污染使用计算机、预防污染) 生物安全生物安全 与涂片镜检相同与涂片镜检相同 每年校正每年校正 模块更换模块更换 安全安全 防盗防盗 (计算机计算机)第22页/共35页世界卫生组织快速开展快速开展Xpert MTB/RIF诊断试验诊断试验技术和实施方面的考虑技术

16、和实施方面的考虑2011年3月第23页/共35页WHO对对Xpert MTB/RIF的建议摘要：的建议摘要： 高度推荐用于怀疑高度推荐用于怀疑MDR-TB以及合并以及合并HIV感染的结感染的结核病病人的初诊诊断核病病人的初诊诊断 对于对于MDRTB、HIV不严重的地区，可以在涂片不严重的地区，可以在涂片之后考虑使用之后考虑使用Xpert MTB/RIF，特别是用于诊断，特别是用于诊断涂阴病人（取决于费用）涂阴病人（取决于费用） 肺外标本的有关证据尚有限肺外标本的有关证据尚有限 增加检测次数可能增加敏感性，但需考虑费用增加增加检测次数可能增加敏感性，但需考虑费用增加 适用于儿童适用于儿童 不能替

17、代传统涂片、培养、药敏试验不能替代传统涂片、培养、药敏试验第24页/共35页步骤 1: 特异抗原激发淋巴细胞IFN- 释放阴性对照ESAT-6或CFP-10孵育孵育显影步骤 2:用ELISA 检测 IFN- Y Y YYYYY Y YYYY洗涤Y Y YYYY 洗涤Y Y YQuantiFERON TB Gold实验第25页/共35页T-SPOT TB (ELISPOT)技术技术 单核细胞分离TB抗原刺激，IFN- 释放一抗捕获IFN- 与标记的二抗结合 酶作用标记物显色每一斑点代表释放IFN-的一个细胞Y Y Y YY Y Y YY Y Y YYYYYY Y Y YYYYYIFN-抗原第26

18、页/共35页小小 结结用途用途操作操作生物安生物安全要求全要求费用费用液体培养液体培养更敏感、快速的培养更敏感、快速的培养LPA/基因基因芯片芯片快速诊断快速诊断M/XDRLED涂阳病人发现涂阳病人发现Xpert快速诊断快速诊断NTP中如何应用中如何应用 给谁用？哪里做？怎么用？给谁用？哪里做？怎么用？第27页/共35页国家结核病参比实验室推荐建议国家结核病参比实验室推荐建议液体培养用于液体培养用于: 结核病可疑症状者检查, 可以作为结核病（耐药）的诊断依据和结核病患者治疗效果判断, 液体培养可以代替传统可以代替传统培养培养推荐理由推荐理由:1.液体培养在已经在我国注册；液体培养在已经在我国注

19、册；2.国内外研究显示其敏感性和国内外研究显示其敏感性和TAT优于传统培养；优于传统培养；3.数据显示在我国具有可行性数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；符合成本效果；推荐使用层级推荐使用层级: 区县、地市和省级（区县、地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）医疗机构和疾病预防机构）第28页/共35页国家结核病参比实验室推荐建议国家结核病参比实验室推荐建议GenXpert 即将可以用于即将可以用于: 结核病可疑症状者检查, 可以作为结核病的辅助诊断方法和结核病患者治疗效果判断, 它有望代替传统的培养和利福平代替传统的培养和利福平的药敏试验（可疑耐药结核病患者）的药敏试验（可疑耐药结核病患者）推

20、荐理由推荐理由:1.即将在我国获得注册证书；即将在我国获得注册证书；2.国内外研究显示其敏感性和特异性，阳性结果报告时间优于传统国内外研究显示其敏感性和特异性，阳性结果报告时间优于传统方法；方法；3.WHO 在全球推荐在全球推荐4.数据显示在我国具有可行性数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；符合成本效果；可能使用层级可能使用层级: 区县（？）、地市和省级区县（？）、地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）（医疗机构和疾病预防机构）第29页/共35页国家结核病参比实验室推荐建议国家结核病参比实验室推荐建议LPA可以用于可以用于: 可疑耐药结核病患者可疑耐药结核病患者查,它有望代替利福平和异烟肼的

21、传统代替利福平和异烟肼的传统药敏试验药敏试验推荐理由推荐理由:1.在我国获得注册证书；在我国获得注册证书；2.国内外研究显示其敏感性和特异性（国内外研究显示其敏感性和特异性（TAT)较好；较好；3.WHO 在全球推荐在全球推荐4.数据显示在我国具有可行性数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；符合成本效果；可能使用层级可能使用层级: 地市和省级地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）（医疗机构和疾病预防机构）第30页/共35页国家结核病参比实验室推荐建议国家结核病参比实验室推荐建议基因芯片可以用于基因芯片可以用于: 可疑耐药结核病患者可疑耐药结核病患者查,它有望代替利福平和异烟肼的传统代替利福平和异烟肼的传统药敏试验药敏试验推荐理由推荐理由:1.在我国获得注册证书；在我国获得注册证书；