花药培养1PPT课件

1、项目六草莓花药培养泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第1页/共66页教学目标工作任务实践操作问题探究知识拓展作 业教学内容泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第2页/共66页教学终极目标会草莓花药培养和脱毒苗快速繁殖会采集合适的草莓花蕾做为外植体消毒灭菌 能剥取花药诱导愈伤组织并分化小苗、继代增殖能对花药培养试管苗染色体观察会进行试管苗驯化、移栽促 成 目 标教学目标泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第3页/共66页 草莓（Fragari aananassa Duch）是蔷薇科草莓属多年生草本植物，果实鲜艳美丽、芳香浓郁、柔软多汁。且富含糖、蛋白质、磷、钙、铁及大量维生素

2、和有机酸。除鲜食外，还可以加工成果浆、果汁、果酒及各种冷饮和速冻食品，深受广大消费者欢迎。 项目介绍泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第4页/共66页泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第5页/共66页花蕾表面消毒、花药培养 任务3对向日葵下胚轴和子叶的原生质游离 任务1诱导试管苗、鉴定并增殖培养任务4试管苗移栽和管理任务5 配制草莓花药培养的培养基任务2工作任务泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第6页/共66页任务1采集草莓花蕾、检查花粉的发育时期一、检查花粉的发育时期（材料选择）单核靠边期的花药。 方法：从田间采集花蕾数个，从每花蕾1 12 2枚花药于载玻片上，加醋酸

3、洋红1 12 2滴，用玻棒或镊子将花药压碎，剔除碎片，加盖盖玻片镜检（压片染色法）。 观察几个视野，若多数花粉只有一个核并被挤向一侧，即为单核靠边期，表明此时花药适合作外植体。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第7页/共66页 通常花粉单核靠边期的草莓是：未开放，花萼略长于花冠或花冠刚露白，花冠白色或淡绿色且不松动，花药微黄而充实。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第8页/共66页（二）材料预处理 将从田间采集的花蕾，用湿纱布包好放塑料袋中，扎好袋口，置44左右冷藏箱中放置24244848小时。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第9页/共66页配制草莓花药培养的培养基。

4、任务2愈伤组织诱导：丰香、明宝B5B5或MS+BA2.0+KT2.0+IAA4.0MS+BA2.0+KT2.0+IAA4.0分化培养： MS+BA2.0+ZT2.0+NAA0.2MS+BA2.0+ZT2.0+NAA0.2诱导生根： 1/2MS+NAA0.1泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第10页/共66页花蕾表面消毒、花药培养任务3 材料消毒：将接种材料用自来水洗干净20min20min，用无菌纸轻轻擦干。然后将材料放入已消毒过的广口瓶内，加入70%70%酒精浸润30s30s，倒去酒精，再倒入0.1%0.1%升汞消毒8min8min，倒去消毒液后用无菌水冲洗4 4次。 接种：用消过毒

5、的镊子或接种环将花药接种于愈伤诱导培养基上。接种密度宜高。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第11页/共66页 接种后将材料放置培养室内进行培养，温度为25，光强10003000 lx，每日光照12小时。培养1520d后，花药开始产生愈伤组织，待愈伤组织长至24mm时，转入芽分化培养基（MS+6BA0.5mg/L+KT0.5mg/L）。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第12页/共66页 诱导试管苗、鉴定并进行增殖培养任务4 草莓花药培养自然加倍频率很高，尤其是继代培养的材料，因而可不进行人工加倍处理。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第13页/共66页 将高23cm，

6、根系发达的小植株移入温室，打开瓶盖炼苗3d。然后洗去培养基，即可移栽。试管苗驯化和移栽任务5 疏松通气、适宜的保水性、清洁卫生是组培苗对基质的基本要求。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第14页/共66页泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第15页/共66页试管苗移栽及环境调控任务6 幼苗出瓶操作过程要小心仔细，可在容器中加适量水后，用玻璃棒轻轻搅动后倒出，再用镊子夹取，取出的幼苗用水将根部的琼脂等冲洗干净，移栽至苗床。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第16页/共66页泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第17页/共66页泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物

7、第18页/共66页外植体选准备外植体选准备诱导花粉脱分化、分裂诱导花粉脱分化、分裂花粉植株鉴定花粉植株鉴定花药培养技术花药培养技术驯化和移栽驯化和移栽分化、壮苗培养分化、壮苗培养完整植株形成完整植株形成实践操作泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第19页/共66页目的：诱导产生单倍体植株。什么是花药花粉培养？花粉和花药的培养(pollen and anther culture) 是指将花粉发育至一定阶段的花药接种在人工培养基上，改变其正常发育和机能，以形成花粉胚或愈伤组织，不经受精而发生细胞分裂，进而由单个花粉粒分化成完整单倍体植株的技术。问题探究泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生

8、物第20页/共66页花粉粒（也称小孢子）是由花粉母细胞经减数分裂形成。它的染色体数目为体细胞的一半，为单倍体细胞。雄蕊结构：花的雄性器官。包括花丝、花药两部分。其中花药部分由药隔（2n2n）和花粉粒(1n)(1n)组成。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第21页/共66页Anther花粉囊 style花柱 Pollen 花粉Filament 花丝 egg cell卵细胞 Embryo sac 胚囊petal花瓣 ovary子房 stigma柱头secundary-Receptacle花托 sepal萼片Embryo sac nucleus胚囊核 staminode退化雄蕊Germina

9、ting pollen 发芽的花粉 ovule胚珠泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第22页/共66页泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第23页/共66页7 7天天1414天天2121303040后后曼陀罗的花药培养泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第24页/共66页什么是单倍体植株？什么是单倍体植株？单倍体细胞 植物进行有丝分裂时，要进行一种特殊的细胞分裂，即减数分裂。减数分裂后形成的雌、雄配子，其染色体数目为体细胞的一半。将这种具有单套染色体的细胞称为单倍体细胞。单倍体植物(haplobiont) 单倍体细胞在人工离体条件下培养，使其单性发育成植物体。这种具有单套染

10、色体的植物称为单倍体植物。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第25页/共66页 花粉是植物的生殖器官，花粉细胞是通过减数分裂而来，因此，花粉细胞内只含有正常植株染色体组数的一半。 几个染色体组就是几倍体，如： 八倍体 单倍体 四倍体 六倍体 单倍体 三倍体 四倍体 单倍体 二倍体 二倍体 单倍体 一倍体 1 1、单倍体内含有的染色体组数同配子体一样。 2 2、单倍体是一个相对的概念，是相对正常植株而言的。 3 3、单倍体不一定就是一倍体，它可以是二倍体、三倍体或更高 倍体。 . 单倍体概念的理解单倍体泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第26页/共66页泉泉 州州 师师 范范 学

11、学 院生物院生物第27页/共66页为什么多数植物采用单核期花粉培养容易成功？（一）花粉发育时期： 1、适宜时期：单核期,尤其是单核中、晚期(单核靠边期) 选择合适的花粉发育时期是提高花粉植株诱导成功率的重要因素，并非任何时期的花粉都能诱导出花粉植株，只有花粉发育到一定的时期，才对离体培养敏感，对大多数植物而言，适宜的花粉时期是单核期，尤其是单核中、晚期。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第28页/共66页雄配子体的发育 营养细胞生殖细胞精子小孢子的发育时期单核期：单核早期，单核晚期；双核期：双核早期，双核晚期；三核期：三核型花粉植物。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第29页/

12、共66页小孢子不同发育时期对胚状体和愈伤组织诱导率的影响泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第30页/共66页不同植物种类，诱导愈伤组织和胚状体发生，均有适宜的小孢子发育时期泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第31页/共66页 （1 1）小孢子发育的第三期（小孢子经二次有丝分裂形成成熟花粉）的初期是胚胎形成的临界期。离体培养时，若小孢子的发育期超越这一时期胚状体就不能形成。Niesch(1968)Niesch(1968)提出，小孢子的双核期，淀粉逐渐积累形成，小孢子就不能再生成植物体。 （2 2）小孢子发育的过程中，花药内源激素的平衡不断改变，随着花粉的成熟，激素平衡变得不适合小

13、孢子的脱分化；或者随着花粉成熟，花粉花粉脱分化必备的物质消耗殆尽，因此，小孢子就不能再生成植物体。原因泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第32页/共66页 培养花药之前，需要制片镜检，确定花粉发育时期。进 行细胞学花粉发育时期的镜检。花粉发育时期的检测 （1 1）压片染色法A A、醋酸洋红：100ml100ml，45%45%醋酸水溶液加入250ml250ml烧杯，酒精灯上加热到沸后，慢慢加入2g2g洋红粉末，再加热1010分钟，冷却后加入数滴2 2的铁明矾溶液（2g2g硫酸铁钾或硫酸铁铵加水至100ml100ml），暗红色即可，滤纸过滤入棕色瓶中，置冰箱保存。B B、碘碘化钾：1g1g

14、碘、2g2g碘化钾加水稀释至100ml100ml。（2 2）压片染色法与花器官形态特征结合法花粉单核晚期的烟草花蕾花萼与花冠等长 Different flower stages as used in anther culture. Stage 2 is the optimum stage of development for use in tobacco anther culture 泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第33页/共66页花粉植株的形态发生方式？1 1、器官发生型 花粉-多细胞花粉粒-细胞团（愈伤组织）-继代培养- -单倍体植株。2 2、胚状体发生型 花粉-多细胞花粉粒-

15、进一步培养-胚壮体-释放-植物体。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第34页/共66页花粉培养过程花粉培养 从花药中游离出花粉粒，通过培养使花粉粒脱分化启动发育为单倍体植株的技术。特点: : 它可以避免花药壁、药隔及花丝等体细胞愈伤组织的干扰，可以获得大量的花粉植株。花粉的分离与纯化：分离法：自然散落法、挤压法、机械游离法（磁力搅拌）纯 化：用不同孔径的无菌筛子除杂。 茄子用270270目screenscreen泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第35页/共66页微室培养平培养：花粉在固体培养基中进行培养，使其形 1.1.成花粉胚状体，最终分化为植株。2.2.液体培养: : 悬

16、浮培养，通气性差。3.3.双层培养：上- -液体+ +下- -固体4.4.看护培养：花粉- -滤纸- -固体培养基5.5.微室培养：6.6.条件培养：在花药培养基中加入失活的花药提取物。花粉培养的方式：泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第36页/共66页基本培养基植物种类不同对培养基的要求不同。如：值得一提的是培养基中高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织形成。铁对花粉胚发育很重要。培养基泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第37页/共66页植物激素的种类和浓度必须结合植物种类和器官发生方式来考虑细胞分裂素和细胞分裂素和CMCM促进花粉分化成胚状体，生长素类尤其是促进花粉分化成胚状

17、体，生长素类尤其是2,4-D2,4-D促进愈伤组促进愈伤组织形成，但织形成，但2,4-D2,4-D抑制愈伤组织分化成胚状体。抑制愈伤组织分化成胚状体。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第38页/共66页分化培养：根据培养目的，调节植物激素分化培养：降auxin,提cytokinin-有利于芽的形成壮苗培养：同时下降，有利于胚状体的正常生长。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第39页/共66页花药离体培养中维持培养基渗透压主要依赖于糖，启动小孢子细胞脱分化对糖的要求，单子叶植物比双子叶植物高。 石刁柏花药培养中，对多细胞花粉粒的诱导效果3w8w蔗糖种类和浓度的筛选泉泉 州州 师师

18、 范范 学学 院生物院生物第40页/共66页添加物 CM CM 、LHLH、CH CH 玉米汁、马铃薯汁、酵母提取液、氨基酸等对提高花粉愈伤组织和胚状体诱导率、促进其生长有良好效果。 活性炭能促进胚状体发育，提高花粉植株产量。主要是吸附培养基中抑制生长的有害物质。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第41页/共66页 1) 1) 花药培养形成单倍体植株。但花药中的药壁、药隔等为二倍体组织也可能被诱导发育成植株。 2 2）经染色体组型分析，花药培养中发现有非单倍体植株的存在。 3 3）激素对倍性变化有很大影响。花粉植株的倍性诱导单倍体植株的倍性 通过胚状体产生的花粉植株，几乎都是单倍体。而

19、经过愈伤组织产的花粉植株中不少是二倍体。愈伤组织继代培养时间愈长，二倍体的比例愈高。泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第42页/共66页单倍体的鉴定方法 鉴定花药和花粉植株染色体倍性的方法有：1. 形态鉴定2. 结实性鉴定3. 染色体数目鉴定4. 遗传标记鉴定。 泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第43页/共66页单倍体植株的染色体加倍单倍体植株染色体的加倍方法：1.自然加倍 2.人工加倍 3.从愈伤组织再生草莓泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第44页/共66页1）人工诱导染色体加倍常用化学诱导方法，有秋水仙素、富民农、对二氯苯、8-羟基喹啉等。 秋水仙素是由地中海生

20、长的一种百合科植物秋水仙的种子和球茎提取出来的物质。能溶于水、酒精，可阻止细胞有丝分裂时纺锤丝的形成。 （1）小苗浸泡加倍 （2）顶芽或腋芽处理加倍 （3）培养基加倍泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第45页/共66页单倍体在植物育种中的应用1 1、单倍体育种的概念指将具有单套染色体的单倍体植物，加倍-纯合二倍体-选出具有优良性状的个体-繁育成新品种；或选出具有单一优良性状的个体-育种的原始材料，称之为-单倍体育种相关阅读泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第46页/共66页2、单倍体育种的优越性 控制杂种分离，短育种年限。加速F1代杂合体的纯化。 提高常规育种的效率有利于隐性性

21、状的选择快速获得自交系的超雄株其他：如提纯复壮泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第47页/共66页控制杂种分离，短育种年限，加速F1代杂合体的纯化泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第48页/共66页提高常规育种的效率泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第49页/共66页提高常规育种的效率2泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第50页/共66页有利于隐性性状的选择A泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第51页/共66页快速获得自交系的超雄株泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第52页/共66页单倍体育种的研究进展 1964 1964年，印度GuhaGuha

22、和MaheshwariMaheshwari对毛叶曼陀罗的花药进行培养并获得了单倍体植株，从此以后，这项技术被迅速推广。毛叶曼陀罗【功 效】：定喘，风湿痹痛，脚气，疮疡疼痛。并作外科手术麻醉剂。【性味归经】：辛，温，有毒。【处方名】：洋金花、曼陀罗花【拉丁名】：毛曼陀罗 Datura innoxia Mill.泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第53页/共66页1 1、水稻 我国的水稻花培新品种主要有中国科学院李梅芳培育的“中花”系列丰产优质的粳稻新品种，还有各省、地农业院校和科研院所培育出的不同物点的粳稻和糯稻新品种，如晚熟粳稻“朝花矮”、“晚粳1111号”（广西韩光禧），中晚熟抗病粳

23、稻“浙农大4040号”、“4545号”，早熟籼稻“赣早籼1111号”（江西农科院）等。2、小麦 中科院遗传所育成的“花培1号”，北京农林科学院的胡道芬等 用复合杂交F1代的花粉育成了第一个冬小麦品种“京花1号”，接着又育 成了京花3号、5号等品种，以后，全国各地的农科院所也取得了丰硕的成果。中国主要农作物第54页/共66页3 3、玉米 广西玉米研究所杭玲等育成了玉米的花培品种“桂三1 1号”。 此外，在其他作物上也取得了一系列的成果，如在烟草上育成了“单育1 1号”，甜椒上育成了“海花3 3号”等这些成果都是通过单倍体育种获得的。甜椒烟草玉米泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第55页/共66页花粉孢子体概念的建立 植物有性生殖时，精细胞和卵细胞融合形成二倍体的合子，合子反复有丝分裂形成胚，“胚”是一株幼小植物，称孢子体。那么“合子” 是孢子体世代的一个原始细胞，合子的第一次有丝分裂，也就是第一次孢子体有丝分裂。 泉泉 州州 师师 范范 学学 院生物院生物第56页/共66页 离体培养条件下，花粉是产生花粉植株的原始细胞，其第一次有丝分裂，在本质上与合子的第一次孢子体分裂相似，尽管它是单倍性的。 根据上述概念，我们把花粉形成植株的途径，称为“