色谱法叶绿素分离实验PPT课件

1、第第1节节 色谱法概述色谱法概述 一、色谱法一、色谱法 Tswett叶绿素分离实验叶绿素分离实验第1页/共48页 （1）色谱：植物色素经溶剂冲洗分离后如同白光色散成七色光带的现象 （2) 色谱法：用于产生色谱的分离方法 （3）色谱柱（chromatographic column） 装有用于分离的填充物的细长管（如玻璃管、不锈钢管） （4)固定相（stationary phase） （5）流动相（mobile phase） 液体流动相液体流动相气体流动相气体流动相超临界流体流动相超临界流体流动相固体固定相固体固定相液体固定相液体固定相第2页/共48页 (6）色谱分离本质: 利用混合物中各组分在流

2、动相和固定相之间相互作用力（如溶解能力、吸附力、极性、亲和力等）的强弱不同，而使各组分在色谱柱中分别以不同的速度移动而达到分离的定性与定量分析的方法。 二、色谱法分类二、色谱法分类1.流动相状态流动相状态液相色谱液相色谱(LC)气相色谱气相色谱(GC)超临界流体色谱超临界流体色谱(SFC)液液-固色谱固色谱(LSC)液液-液色谱液色谱(LLC)气气-固色谱固色谱(GSC)气气-液色谱液色谱(GLC)第3页/共48页2.按分离原理分类按分离原理分类 吸附色谱吸附色谱分配色谱（分配色谱（DC）离子交换色谱（离子交换色谱（IEC) )分子排阻色谱分子排阻色谱( (MEC）亲和色谱亲和色谱3.根据实验

3、操根据实验操作形式作形式柱色谱柱色谱 ( (CC）平面色谱平面色谱( (PC）薄层色谱（TLC）纸色谱（PC)薄膜色谱（TFC）第4页/共48页三、色谱法的特点三、色谱法的特点分离效能高分离效能高 分离与分析功能兼备分离与分析功能兼备 自动化程度高自动化程度高应用范围广应用范围广第5页/共48页第第2节节 经典柱色谱技术经典柱色谱技术 一、液一、液-固吸附柱色谱技术固吸附柱色谱技术1分离原理分离原理（1 1）液液-固吸附柱：固吸附柱：色谱法固定相是固体吸附剂，流动相为液色谱法固定相是固体吸附剂，流动相为液体的柱色谱法体的柱色谱法（2 2）分离机制）分离机制: :吸附剂表面对不同组分吸附力的不同

4、和流动相吸附剂表面对不同组分吸附力的不同和流动相对各组分的溶解能力（或称解吸能力、洗脱能力）的差异，最对各组分的溶解能力（或称解吸能力、洗脱能力）的差异，最终导致混合物中各组分流出色谱柱的先后顺序（或在色谱柱中终导致混合物中各组分流出色谱柱的先后顺序（或在色谱柱中停留的时间即保留时间）不同而达到分离。停留的时间即保留时间）不同而达到分离。（3 3）应用应用:分离酸性及中性化合物分离酸性及中性化合物 ( (如醇类和芳香烃等如醇类和芳香烃等) ) 第6页/共48页2吸附剂吸附剂（1）硅胶 (SiO2XH2O)A.吸附机制：表面有许多硅羟基（-Si-OH）的氢键作用 B.吸附活性 C.失活或脱活 D

5、.活化 硅胶活性与含水量的关系硅胶活性与含水量的关系 硅胶含水量硅胶含水量% %活度级活度级活性活性0 0I I大大小小5 5IIII1515IIIIII2525IVIV3838V V第7页/共48页（2）氧化铝）氧化铝 A.吸附机制:其表面铝羟基（Al-OH）的氢键作用B.活性 氧化铝含水量氧化铝含水量% %活度级活度级活性活性0 0I I大大小小5 5IIII1515IIIIII2525IVIV3838V V第8页/共48页C.氧化铝分类及应用范围 氧化铝种类氧化铝种类pH应用范围应用范围碱性氧化铝碱性氧化铝910分离碱性和中性化合物，如生物碱。分离碱性和中性化合物，如生物碱。中性氧化铝中

6、性氧化铝7.5分离酸性、中性和碱性化合物，如生物分离酸性、中性和碱性化合物，如生物碱、挥发油、萜类、甾体以及在酸碱碱、挥发油、萜类、甾体以及在酸碱中不稳定的酯类、苷类等化合物。中不稳定的酯类、苷类等化合物。酸性氧化铝酸性氧化铝45分离酸性和中性化合物，如氨基酸、酸分离酸性和中性化合物，如氨基酸、酸性色素。性色素。第9页/共48页（3）聚酰胺）聚酰胺 A.吸附机制：通过分子内的酰胺基与酚、酸、硝基、醌类化合物形成氢键而产生吸附作用 B.应用范围：适合于含-OH 的天然产物的有效成分分离 （4）大孔吸附树脂）大孔吸附树脂 A.吸附机制：大孔网状结构的高分子化合物，不溶于酸、碱及有机溶剂，吸附性与筛

7、分性原理相结合 B.应用范围：主要用于水溶性化合物(如皂苷）的分离纯化第10页/共48页3流动相流动相(又称为洗脱剂又称为洗脱剂 ) （1）流动相影响因素A.被测物质的结构、性质 物质的结构 常见官能团的极性由小到大的顺序是：烷烃烯烃醚类硝基化合物酯类酮类醛类硫醇胺类酰胺醇类酚类羧酸类。B.流动相极性: 相似相溶 C.吸附剂活性官能团极性与数目官能团极性与数目结构空间排列结构空间排列第11页/共48页 （2）如何选择流动相？最佳方案总是实验确定最佳方案总是实验确定 v想一想想一想 在吸附色谱在吸附色谱中，以硅胶为固定相，中，以硅胶为固定相，当用三氯甲烷为流动相当用三氯甲烷为流动相时，样品中某些

8、组分保时，样品中某些组分保留时间太短，若改用三留时间太短，若改用三氯甲烷氯甲烷甲醇（甲醇（1:1）时，）时，则样品中各组分的保留则样品中各组分的保留时间是变长，还是变得时间是变长，还是变得更短？为什么？更短？为什么？ 第12页/共48页4吸附柱色谱操作技术吸附柱色谱操作技术 （1）装柱 A.质量要求 装柱之前，先将空柱洗净干燥，再将空柱垂直固定在铁架台上。如果色谱柱下端没有砂芯横隔，就取一小团脱脂棉，用玻璃棒将其推至柱底，再在上面平铺上一层厚0.51cm的洗过、干燥石英砂，有助于分离时色层边缘整齐，加强分离效果。柱的长度与直径比一般为10 20:1。色谱柱的填装要均匀，不能有气泡。 B .装法

9、湿法装柱 干法装柱 第13页/共48页（2）加样）加样 干法加样 湿法加样 （3）洗脱）洗脱 v 洗脱剂 一种溶剂或几种溶剂按一定比例组成混合溶剂 v 操作要求 A.保持吸附层上方有一定量的洗脱剂，防止断层和旁流 B.控制洗脱剂的流速（510滴/min) 第14页/共48页（4）收集）收集 等份收集 (亦可用自动收集器) 按变换洗脱剂收集 （5）检验）检验可以为后续操作可以为后续操作第15页/共48页第16页/共48页二、凝胶柱色谱技术二、凝胶柱色谱技术1分离原理分离原理（1）凝胶 (2)分离原理 凝胶的孔穴大小与被分离组分大小相当，尺寸大的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔，甚至于

10、完全被排斥先流出色谱柱。尺寸小的组分分子，大孔小孔都可以渗进去，最后流出。 第17页/共48页2固定相固定相 (1)无机凝胶又称硬质凝胶-多孔硅胶、多孔玻璃珠 性能：化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱分离效能较低 (2)有机凝胶又称半硬质凝胶 性能：能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱分离效能较高。但在有机溶剂中有轻度膨胀。 (3)新型凝胶 -葡萄聚糖凝胶 第18页/共48页3流动相流动相 （1）要求 流动相必须与凝胶本身非常相似，能溶解样品，浸润凝胶，且具有较低的黏度，有利于大分子的扩散 (2）选用方法 水溶性样品

11、-水溶液为流动相 非水溶性样品 -有机溶剂为流动相 (3）常用的流动相 四氢呋喃、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、三氯甲烷和水等 第19页/共48页4凝胶柱色谱操作技术凝胶柱色谱操作技术 （1）溶胀 （2）装柱 （3）加样 （4）洗脱 （5）再生 用恰当的方法除去凝胶中的污染物，使其恢复其原来的性质 交联葡萄糖凝胶-温热的0.5mol/L氢氧化钠和0.5mol/L的氯化钠的混合液浸泡，用水冲洗到中性聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶-盐溶液浸泡，用水冲到中性 第20页/共48页第第3节节 薄层色谱分离检测技术薄层色谱分离检测技术 一、分离原理一、分离原理 薄层色谱是一种开放性色谱，是将混合组分样品溶液点在薄层

12、板一端的薄层色谱是一种开放性色谱，是将混合组分样品溶液点在薄层板一端的起始线上，点样处称为原点，在密闭容器中用适宜的流动相（薄层色谱法起始线上，点样处称为原点，在密闭容器中用适宜的流动相（薄层色谱法中又称为展开剂）展开。因吸附剂对不同组分的吸附能力不同，展开剂对中又称为展开剂）展开。因吸附剂对不同组分的吸附能力不同，展开剂对不同组分的解吸能力也不完全相同，造成各组分在薄层析上移动的速度有不同组分的解吸能力也不完全相同，造成各组分在薄层析上移动的速度有快有慢，经过一段时间展开后，不同的组分彼此分开，最终形成相互分离快有慢，经过一段时间展开后，不同的组分彼此分开，最终形成相互分离的斑点的斑点 薄层

13、色谱法薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC) 将固定相均匀平铺在光洁表面的玻璃、塑料或金属板上将固定相均匀平铺在光洁表面的玻璃、塑料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法 可分为可分为吸附吸附、分配、分子排阻色谱法等、分配、分子排阻色谱法等 第21页/共48页二、薄层色谱参数二、薄层色谱参数1比移值比移值(1(1）定义）定义 组分迁移的距离与展组分迁移的距离与展开剂迁移的距离之比开剂迁移的距离之比(2)计算方法计算方法原点到溶剂前沿的距离原点到斑点中心的距离fR0llRAAf）（0llRBBf）（第22页/共48

14、页2相对比移值相对比移值sisisfifrllllllRRR00)()(/(1(1）定义）定义 指被测组分的比移值与参照组分的比移值之比指被测组分的比移值与参照组分的比移值之比 (2(2）计算方法）计算方法(3(3）特点）特点消除系统误差，消除系统误差， 值的重复性和可靠性都比值的重复性和可靠性都比 好好 rRfR第23页/共48页3分离度分离度（1)1)定义定义衡量薄层色谱分离效果的重要指标，是衡量薄层色谱分离效果的重要指标，是指相邻两斑点中心至原点的距离之差与指相邻两斑点中心至原点的距离之差与两斑点平均径向宽度（两斑点平均径向宽度（径向宽度是指斑径向宽度是指斑点沿着展开方向的宽度点沿着展开

15、方向的宽度）的比值）的比值 (2(2）计算方法）计算方法21122112)( 22/ )(WWllWWllR第24页/共48页三、仪器与材料三、仪器与材料1吸附剂吸附剂粒径粒径 540 m硅胶硅胶聚酰胺聚酰胺 微晶纤维素微晶纤维素 氧化铝氧化铝硅藻土硅藻土常用常用硅胶硅胶H硅胶硅胶G硅胶硅胶GF254硅胶硅胶HF254 想一想想一想 H、G、F各代表何种意思？试解释硅胶各代表何种意思？试解释硅胶HF365？第25页/共48页2载载板板玻璃板玻璃板塑料膜塑料膜金属箔金属箔厚度厚度 2mm 规格规格5cm20cm10cm10cm10cm15cm10cm20cm 种类种类要求要求 表面光滑、平整清洁

16、表面光滑、平整清洁 玻板处理措施玻板处理措施清洁剂或铬酸洗液浸泡洗涤，用清水充分清洗，再用清洁剂或铬酸洗液浸泡洗涤，用清水充分清洗，再用蒸馏水或去离子水冲洗，表面应不附水珠，晾干备用蒸馏水或去离子水冲洗，表面应不附水珠，晾干备用 第26页/共48页3点样器点样器 手动手动全自动点样仪全自动点样仪定量毛细管 平口微量注射器平口微量注射器 第27页/共48页3展开容展开容器器 平底色谱专用展开缸平底色谱专用展开缸双槽薄层色谱专用展开缸双槽薄层色谱专用展开缸 第28页/共48页4显色剂显色剂显色剂适用范围显色方法斑点颜色浓硫酸乙醇溶液多数有机化合物喷雾加热多数加热后呈黑色碘多数有机化合物薰蒸多数显黄

17、棕色磷钼酸乙醇溶液醛等还原性物质喷雾烘干蓝色茚三酮试液氨基酸类喷雾或浸渍紫色或黄色三氯化铁-铁氰化钾试液含酚羟基化合物喷雾或浸渍红褐色或棕红色第29页/共48页5显色装置显色装置 喷雾瓶喷雾瓶浸渍槽浸渍槽蒸气熏蒸蒸气熏蒸 -双槽展开缸双槽展开缸 第30页/共48页6检视装检视装置置 紫外分析仪紫外分析仪(三用三用)摄像设备摄像设备薄层色谱扫描仪薄层色谱扫描仪(CS9301型）型）第31页/共48页四、操作技术四、操作技术1薄层薄层板制备板制备自制薄自制薄层板层板 市售薄市售薄层板层板 无黏合剂无黏合剂分类分类含黏合剂含黏合剂10%15%煅石膏煅石膏 0.2%0.5%羧甲基纤羧甲基纤维素钠水溶液

18、维素钠水溶液 操作方法操作方法普通薄层板普通薄层板(玻璃、聚酰胺薄膜和铝基玻璃、聚酰胺薄膜和铝基)高效薄层板（高效薄层板（固定相粒径为固定相粒径为57 ） um分类分类操作方法操作方法临用前一般应在临用前一般应在110活化活化30分钟。聚酰胺薄膜不需分钟。聚酰胺薄膜不需活化。铝基片薄层板和聚酰胺薄膜可根据需要剪裁活化。铝基片薄层板和聚酰胺薄膜可根据需要剪裁 第32页/共48页操作方法操作方法 将1份固定相和3份水（或羧甲基纤维素钠水溶液）在研钵中沿同一方向研磨混匀，去除表面的气泡后，置玻璃板上使涂布均匀，或倒入涂布器（见图8-14）中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布(涂层厚度为0.2mm0.

19、3 mm)，取涂好的薄层板，置水平台上于室温下晾干后，在110活化30分钟，立即置于有干燥剂的干燥器中备用 。手动涂布器手动涂布器 第33页/共48页2点样点样 普通板普通板点样基线点样基线-距底边距底边2.0cm 圆点状圆点状-R3mm条带状条带状-宽度宽度510mm 点或条带间距点或条带间距-8mm 点样量点样量- 10ul高效板高效板点样基线点样基线-距底边距底边0.81cm 圆点状圆点状-R2mm条带状条带状-宽度宽度48mm 点或条带间距点或条带间距-5mm 点样量点样量- 5ul第34页/共48页3. 展开展开 （1）展开要求）展开要求 查阅查阅 A.何为边缘效应何为边缘效应?何因

20、何因?如何防止如何防止? B.展开剂加入量展开剂加入量?展开剂展开距离展开剂展开距离?（2）展开方式）展开方式 上行上行近水平近水平双向双向多次多次第35页/共48页上行展开上行展开近水平展开近水平展开第36页/共48页4检视检视有色物质斑点有色物质斑点-目光检视目光检视无色物质斑点无色物质斑点荧光检出法荧光检出法 化学检出法化学检出法 五、检测技术五、检测技术1系统适用性试验系统适用性试验检测灵敏度检测灵敏度 比移值比移值 分离效能分离效能 第37页/共48页2鉴鉴别别等浓度对照法等浓度对照法-同板同板-大致同位、同大、同色泽大致同位、同大、同色泽等体积混合法等体积混合法-斑点单一、紧密斑点

21、单一、紧密 结构相似对比法结构相似对比法-Rf不同或两斑点不同或两斑点3杂质检查杂质检查 杂质对照品法杂质对照品法 样品溶液的自身稀释对照法样品溶液的自身稀释对照法 二者合用法二者合用法第38页/共48页4定量方法定量方法（1）目视比色法）目视比色法 -半定量法（精度半定量法（精度10%）（2）斑点洗脱法）斑点洗脱法 （3）薄层扫描法）薄层扫描法(正在减少使用正在减少使用) 第39页/共48页第第4节节 纸色谱分离技术纸色谱分离技术 一、分离原理一、分离原理(液液-液萃取液萃取 ) 利用样品中不同组分在两相溶剂中溶解性（或分配系数）不利用样品中不同组分在两相溶剂中溶解性（或分配系数）不同，当流

22、动相携带样品流经固定相（被吸附或固定在惰性材料同，当流动相携带样品流经固定相（被吸附或固定在惰性材料上的液体）时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取、再溶解、上的液体）时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取、再溶解、再萃取，再萃取，样品经过多次反复分配后，造成分配系数稍有，样品经过多次反复分配后，造成分配系数稍有差异的组分移行的距离不同面实现分离差异的组分移行的距离不同面实现分离 .二、仪器与材料二、仪器与材料 1色谱滤纸色谱滤纸想一想想一想:色谱滤纸如何选择色谱滤纸如何选择?第40页/共48页2展开剂展开剂（1）纸色谱固定相一般是什么）纸色谱固定相一般是什么?（2）纸色谱展开剂如何选择）纸色谱展

23、开剂如何选择?3展开容器展开容器 圆形或长方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃盖且能密闭圆形或长方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃盖且能密闭 下行纸色谱展开缸下行纸色谱展开缸第41页/共48页三、操作技术三、操作技术1色谱滤纸的准备色谱滤纸的准备（1）用于下行法的色谱滤纸）用于下行法的色谱滤纸 （2）用于上行法的色谱滤纸）用于上行法的色谱滤纸 2点样点样 样品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用定量样品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用定量毛细管或微量注射器吸取溶液，点于点样基线上，溶液宜分毛细管或微量注射器吸取溶液，点于点样基线上，溶液宜分次点加，每次点加后，俟其自然干燥、低温烘干或经温热气次点加，每次点加后，俟其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干，点样流吹干，点样直径为直径为2 mm4mm，点样量取决于色谱滤纸，点样量取决于色谱滤纸的薄厚程度和显色剂的灵敏度，一般几到几十微克。的薄厚程度和显色剂的灵