生化与分生实验课件：实验三 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定

1、实验三实验三 血清血清球蛋白的分球蛋白的分离纯化与鉴定离纯化与鉴定本次实验的主要内容本次实验的主要内容p理论理论 掌握层析技术的基本原理及应用掌握层析技术的基本原理及应用 了解层析技术的分类了解层析技术的分类 掌握凝胶层析和离子交换层析的原理掌握凝胶层析和离子交换层析的原理p实验：血清实验：血清球蛋白的分离纯化与鉴定球蛋白的分离纯化与鉴定 实验原理实验原理 实验思路实验思路 实验流程及操作注意事项实验流程及操作注意事项层层 析析 技技 术术1 1概念：概念：层析法：又称色谱法，是一种广层析法：又称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术。定技术。2. 2.

2、 依据：混合物中各组分理化性依据：混合物中各组分理化性质的差异质的差异分子大小、酸碱性、吸分子大小、酸碱性、吸附力、分子形状、分子极性、亲和附力、分子形状、分子极性、亲和力以及分配系数等。力以及分配系数等。 固定相固定相固定不动。固定不动。 流动相流动相对固定相作单向相对运动，推动样品中对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分通过固定相向前移动。分离原理：分离原理：待分离混合物中各组分理化性质不同，待分离混合物中各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、相推

3、动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。定相中的迁移距离不等，达到分离。3 3基本原理基本原理：4 4分类：分类：流动相的物理状态流动相的物理状态层析方式层析方式气相层析气相层析液相层析液相层析气液层析气液层析气固层析气固层析液液层析液液层析液固层析液固层析纸层析纸层析薄层层析薄层层析柱层析柱层析层析原理：层析原理：吸附层析、分配层析、吸附层析、分配层析、凝胶层析、凝胶层析、离子交换层析、离子交换层析、亲和层析等。亲和层析等。5 5凝胶层析凝胶层析( (凝胶过滤、凝胶色谱、

4、分子筛层析、分子凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析排阻层析) )定义：指混合物随流动相流经固定相的层定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同按其分子大小不同而被分离的技术。而被分离的技术。基本原理：基本原理：固定相固定相：凝胶，不带电荷的具有三维空间的：凝胶，不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒内部多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒内部都具有很多细微的小孔，如同筛子一样，故都具有很多细微的小孔，如同筛子一样，故称分子筛。包括琼脂糖、称分子筛。包括琼脂糖、交联葡聚糖交联葡聚糖、聚丙、聚丙烯酰胺、琼脂糖烯酰胺、

5、琼脂糖- -葡聚糖复合凝胶。葡聚糖复合凝胶。流动相流动相：洗脱液。：洗脱液。u基本原理：基本原理：样品加于柱上，样品随洗脱液样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，的流动而向下移动，小分子能进入凝胶孔内小分子能进入凝胶孔内部，做不定性扩散运动，流程长，速度慢，部，做不定性扩散运动，流程长，速度慢，后流出；后流出；大分子不能进入凝胶孔内部，只能大分子不能进入凝胶孔内部，只能在颗粒间移动，作垂直向下运动，流程短，在颗粒间移动，作垂直向下运动，流程短，先流出先流出大小分子彼此分开。大小分子彼此分开。 l 分子大小不同混合物上柱；分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人洗脱开始，小分

6、子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开：大小分子分开：大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在柱中。大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在柱中。交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶 多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构珠状颗粒，商品名为珠状颗粒，商品名为Sephadex G系列。系列。 G：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和，和G-200八种，具体含义吸水量（八种，具体含义吸水量

7、（g）/10g干胶。干胶。 交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。因此，吸水性大。因此，“G”反映凝胶的交联程度，反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。膨胀程度及分部范围。长链状葡聚糖分子间以环氧丙烷连接长链状葡聚糖分子间以环氧丙烷连接影响因素影响因素* *层析柱的选择及装填：层析柱的选择及装填： 柱大小柱大小 分离样品量分离样品量 凝胶型号凝胶型号 分辨率：各种分子筛的孔隙大小分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝分布有一定范围，有最

8、大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子同的两种全排阻分子/ /完全渗透分子。完全渗透分子。* *洗脱液：溶解待分离物质，不变性洗脱液：溶解待分离物质，不变性* *加样量：加样量：1%1%5%5%* *凝胶的再生凝胶的再生凝胶型号凝胶型号颗粒大小（颗粒大小（m)溶胀体积溶胀体积(ml/g)分离范围（分离范围（Mr）G-1040120237102G-15501502.53.5 1.5103G-2550150461103 5103G-50401209111.5103 3104G-754012012153103 8104G

9、-1004012015204103 1105交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数6.离子交换层析离子交换层析 固定相：载有大量电荷的离子交换剂；固定相：载有大量电荷的离子交换剂； 流动相：具有一定流动相：具有一定pH值和离子强度的电解质值和离子强度的电解质溶液。溶液。 离子交换层析是利用离子交换剂对各离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同，借以分离混合物中种离子的亲和力不同，借以分离混合物中各种离子的一种层析技术。各种离子的一种层析技术。n 其主要特点是依靠带有相反电荷的颗粒之间其主要特点是依靠带有相反电荷的颗粒之间吸引力的作用。吸引力的作用。

10、当混合物溶液中带有与离子交换剂相反电荷当混合物溶液中带有与离子交换剂相反电荷的溶质流经离子交换剂时，后者即对不同溶质进的溶质流经离子交换剂时，后者即对不同溶质进行选择性吸附。行选择性吸附。 随后，用带有与溶质相同电荷的洗脱液进行随后，用带有与溶质相同电荷的洗脱液进行洗脱，被吸附的溶质可被置换而洗脱下来，从而洗脱，被吸附的溶质可被置换而洗脱下来，从而达到分离混合物中各种带电荷溶质的目的。达到分离混合物中各种带电荷溶质的目的。n离子交换剂根据其所带电荷的性质分为阴离离子交换剂根据其所带电荷的性质分为阴离子交换剂和阳离子交换剂两类。子交换剂和阳离子交换剂两类。n阴离子交换剂本身带有正电荷，可以吸引并

11、阴离子交换剂本身带有正电荷，可以吸引并结合混合物中带负电荷的物质；结合混合物中带负电荷的物质；n阳离子交换剂本身带有负电荷，可以吸引并阳离子交换剂本身带有负电荷，可以吸引并结合混合物中带正电荷的物质。结合混合物中带正电荷的物质。n许多生物物质，如氨基酸、蛋白质、核苷许多生物物质，如氨基酸、蛋白质、核苷酸等都具有离子化基团，它们可以带净正酸等都具有离子化基团，它们可以带净正电荷，也可以带净负电荷。其带净电荷情电荷，也可以带净负电荷。其带净电荷情况取决于溶液况取决于溶液pHpH值以及化合物的等电点，值以及化合物的等电点，因此可以利用化合物所带净电荷不同，从因此可以利用化合物所带净电荷不同，从混合物

12、中加以分离。混合物中加以分离。血清血清球蛋白的分离纯化与鉴定球蛋白的分离纯化与鉴定 清蛋白清蛋白 pIpI=4.9 57%=4.9 57%72%72% 1 1 2%2%5%5% 2 2 pIpI6 4%6 4%9%9% 6.5%6.5%12%12% pIpI=7.3 2%=7.3 2%20%20%球蛋白球蛋白 实验思路实验思路盐析法去除清蛋白盐析法去除清蛋白凝胶层析法脱盐凝胶层析法脱盐交联葡聚糖吸水浓缩交联葡聚糖吸水浓缩醋酸纤维素薄膜电泳鉴定醋酸纤维素薄膜电泳鉴定上午完成下午完成先先粗粗后后细细离子交换层析法纯化离子交换层析法纯化 - -球蛋白球蛋白 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白在

13、蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性，使蛋白质从溶液中沉淀析出的方法质的胶体性，使蛋白质从溶液中沉淀析出的方法称为盐析。称为盐析。 盐析法分离蛋白质：各种蛋白质的颗粒大小、亲盐析法分离蛋白质：各种蛋白质的颗粒大小、亲水程度、水程度、pI不同，盐析所需的盐浓度也不一样。不同，盐析所需的盐浓度也不一样。调节盐浓度可使不同的蛋白质沉淀，从而达到分调节盐浓度可使不同的蛋白质沉淀，从而达到分离的目的。离的目的。实验流程及操作注意事项实验流程及操作注意事项沉淀沉淀n常用中性盐：常用中性盐：硫酸铵硫酸铵、硫酸钠等。、硫酸钠等。 ：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，盐：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广

14、，盐析效果好，不易引起变性。可用硫酸析效果好，不易引起变性。可用硫酸/氨水按需要氨水按需要调节调节pH值。值。n本实验中清蛋白分子小，亲水性强，在本实验中清蛋白分子小，亲水性强，在饱和硫酸饱和硫酸铵溶液铵溶液中可沉淀析出，而球蛋白分子大，亲水性中可沉淀析出，而球蛋白分子大，亲水性相对弱，在相对弱，在半饱和硫酸铵溶液半饱和硫酸铵溶液中即可沉淀析出。中即可沉淀析出。因此调节盐浓度可使球蛋白与清蛋白分离。因此调节盐浓度可使球蛋白与清蛋白分离。凝胶层析脱盐：凝胶层析脱盐： 目的：将大分子的蛋白质与小分子硫酸铵分目的：将大分子的蛋白质与小分子硫酸铵分离开。离开。 固定相固定相：SephadexSepha

15、dex G-25 G-25 流动相流动相：pH6.5 pH6.5 醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液离子交换层析纯化离子交换层析纯化- -球蛋白球蛋白目的：将目的：将- -球蛋白与球蛋白与1 1，2 2，- -球蛋白分开球蛋白分开 固定相固定相：DEAEDEAE（二乙氨乙基）（二乙氨乙基）- -纤维素，纤维素， 阴离子交换剂阴离子交换剂 流动相流动相：pH6.5 pH6.5 醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液 浓缩：浓缩：SephadexSephadex G-25 G-25吸水，利吸水，利用高分子性质。用高分子性质。注意事项：注意事项：1 1硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入。硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入。2 2流洗柱

16、子：流洗柱子：3 34 4个柱长。个柱长。3 3上样：转圈滴加。上样：转圈滴加。4 4防止柱上液层干涸。防止柱上液层干涸。5 5洗脱液收集无需分部，用载玻片检测蛋白，洗脱液收集无需分部，用载玻片检测蛋白，无纳氏试剂。无纳氏试剂。6 6G-25G-25干胶用纸条少量多次加入，液层高干胶用纸条少量多次加入，液层高0.5mlPI PH=PI PHPI电泳用于分离物质的原理：电泳用于分离物质的原理：电泳的影响因素电泳的影响因素 分子量大小分子量大小分子所带电荷量分子所带电荷量分子形状分子形状 醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的羟基经乙酰介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。溶于有机溶剂后涂化所形成的纤维素醋酸酯。溶于有机溶剂后涂成薄膜，具均一的泡沫状结构，有强渗透性。成薄膜，具均一的泡沫状结构，有强渗透性。 电泳缓冲液：电泳缓冲液：pH8.6pH8.6的巴比妥缓冲液的巴比妥缓冲液 清蛋白清蛋白 pIpI=4.9 57%=4.