从掌叶大黄中提取的化合物对抗增殖雌激素受体基因的影响

1、从掌叶大黄中提取的化合物对抗增殖雌激素受体基因的影响掌叶大黄，在韩国是一种传统药材。在以前的研究中用于在重组酵母系统中筛选人雌激素受体（ER）表达质粒和质粒的雌激素活性。掌叶大黄中正己烷的EC50值，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇，和甲醇提取物的水溶物的雌激素活性检测分别为0.145，0.093，0.125，1.459，2.853克/毫升，在二氯甲烷部分，雌激素有明显的活性。使用活性追踪的方法，从二氯甲烷馏分分离已知得有蒽醌，大黄酚（1），大黄素甲醚（2），大黄素（3），芦荟大黄素（4）、大黄酸（5）。其中化合物3具有最高的雌激素的相对效力（RP，17bestradiol = 

2、1）（6.3×10-2），其次是化合物4（3.8×10-3），化合物5（2.6×10-4），此外，掌叶大黄中二氯甲烷部位的化合物3和组分3（包含化合物3）对是ER阳性（MCF-7）和阴性（MDA-MB-231）的乳腺癌细胞系对表现出较强的细胞毒作用。关键词：掌叶大黄蒽醌类成分，酵母测定，雌激素样作用，抗增殖作用引言：传统上，许多植物被当成天然药物治愈了许多疾病。今天。植物雌激素更广泛的用于对抗更年期疾病包括乳腺癌（埃德勒克罗茨和哲，1997）。利用现有的合成雌激素更年期雌激素替代疗法有一些副作用，包括乳腺癌和子宫内膜癌由于非选择性的雌激素样作用其发生风险显著增加（

3、Colditz等人，1995，1992；亨德森等人，1988；博尔顿等人，1998）。一般来说，中药是安全的，不具有合成雌激素的副作用。雌激素的成长在女性和男性生殖系统中许多目标的分化和功能起着重要的作用。雌激素还具有多种药理作用，如保护骨质量，维护保护心血管，脑保护（Smith，1994；Ciocca和roig，1995）。在更年期许多健康问题的风险都显著增加，如雌激素缺乏症，潮热，睡眠，阴道干燥，关节疼痛，情绪波动，骨密度降低，心血管疾病，等（埃克等人，1993；帕拉西奥斯，1999；赖默等人，2003）。天然中草药，如掌叶大黄（蓼科），在中医中通常应用于治疗癌症。在以前的研究中，掌叶大黄

4、用于筛查妇科癌症的雌激素活性和抗癌活性，在体外用人乳腺，卵巢妇科肿瘤活性，宫颈癌和肺癌细胞株（Kang et al，2006）。，在掌叶大黄.的根茎中含有一种活性成分大黄素（1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌），具有抗癌，抗菌，做利尿剂和血管舒张的作用（Tsai and Chen, 1992; Liang et al., 1993; Koyama et al., 1988; Zhou and Chen,1988; Huang et al.1991)。也有报道，大黄素对HER-2/neu过度表达的肺癌细胞有治疗作用，并且对HER-2/neu基因过表达的乳腺癌细胞转移有抑制作用。(Zhang and

5、 Hung, 1996; Zhang et al, 1998)。然而，除大黄素外，掌叶大黄其他雌激素和抗增殖的成分和其生物效应仍然未知。探讨掌叶大黄的雌激素成分，人类雌激素受体表达载体和报告质粒重组酵母系统一个人类雌激素受体表达载体和报告质粒重组酵母制。此外，还使用人乳腺癌细胞株MCF-7（ER阳性）和MDA-MB-231（ER）对体外抗妇科癌症抗癌活性进行评估。植物材料2005年10月，大黄的根在韩国汉城牦牛龙寺的传统中药市场购买。凭证标本存放在成均馆大学药学院。酵母的雌激素活性检测唐纳德博士从酿酒酵母获得了bj3505（杜克大学医学中心的体育公司，美国）。bj3505重组酵母株在颤动的孵化

6、器上，温度为30。选择性培养基含300 RPM的酵母氮基（没有氨基酸67毫克/毫升），1 %葡萄糖，L -赖氨酸（36毫克/毫升）和L -组氨酸（24毫克/毫升）。孵化后的酵母样品稀放在一个600 nm的光密度值（OD值），0.25和100µL，96孔培养板的选择培养基里。每个样品在quadruplicate assayed什么。-半乳糖苷酶的诱导活动是在100µL（Z缓冲区（60毫米的磷酸氢二钠，磷酸二氢钠40毫米，10毫米氯化钾，1nM硫酸镁，pH值7.0 2毫克/毫升）含邻硝基苯基-D-半乳糖苷（ONPG），0.1%十

7、二烷基硫酸钠，- toethanol mercap 50毫米和200 U /毫升（enzogenetics oxalyticase，科瓦利斯，OR）。之后20分钟左右，在同步titertek MCC 344板阅读器读取每个孔的od590 和od420的测量值(Kang et al., 2006)。细胞增殖试验细胞增殖的体外实验有MCF-7（ER阳性乳腺癌）的磺基罗丹明B（SRB）法和MDA-MB-231（ER阴性的乳腺癌）细胞株法（Skehan等人。，1990）。对于SRB法，在96孔培养板每孔中的培养基中加入100µL的细胞悬液（4-5万细胞

8、/毫升）。依附一天后，将时间控制板归零。掌叶大黄组分中的二氯甲烷馏分（Fr.1Fr.10）和化合物1-5直接添加到细胞孵育板上在5% Co2，37的条件下培育48 h 。细胞固定在50µL的40的50%的三氯乙酸（TCA）中1h 并且用自来水将板洗涤5次，然后吹干燥。添加五十微升的SRB溶液（0.4% 1%乙酸）和让细胞在室温下染色30分钟。残余的染料用1%醋酸洗涤和并且在板上晾干。在每个板上加100µL Tris缓冲溶液（10毫米，pH 10.5）加入。光盘（外径各井）密度测定用微孔板仪在540 nm。每个板酶标仪测定的光

9、密度（OD）为540 nm。提取和分离掌叶大黄的根（2.4公斤）用甲醇在室温下提取两次。然后将甲醇提取液蒸减压干燥，残留物会在水中悬浮。最终的结果是是正己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇连续分层。蒸发压力下有机馏分在浓缩成的提取物分别为正己烷（13.5克），二氯甲烷（7.4克），乙酸乙酯（167.5克），正丁醇（46.1g），和水（66.1克）。具有雌激素样活性的二氯甲烷提取物，在硅凝胶进行柱色谱法在使用正己烷、乙酸乙酯连续洗脱顺序（5：3：1，1，1：1）和正己烷、乙酸乙酯、甲醇（20:20：1，1，10:10，5:10：2）。结合薄层层析模式产量馏分为Fr.1Fr.10。馏分Fr.1, Fr

10、.3, and Fr.8在硅凝胶上分别用用正己烷-乙酸乙酯（15:1）、正己烷-乙酸乙酯（3:1）、正己烷-乙酸乙酯-甲醇（15:10:2）作为洗脱剂生产大黄酚（1），大黄素（3），和大黄酸（5）。分别将馏分Fr.2 a和 Fr.4由硅凝胶层析(n-hexane/EtOAc = 15 : 1, 3 : 1)和Sephadex LH-20柱层析(CH2Cl2/MeOH = 4 : 6, 3 : 7)得到大黄素甲醚（2）、芦荟大黄素（4）。大黄酚（1）黄棕色非晶粉末，核磁共振谱（300兆赫，CDCl3）2.44（3H，S，3-ch3），7.08（1H，BR，H-2），7.27（1H，D，J

11、0;= 8.6赫兹，H-7），7.63（1H，BR，H-4），7.64（1H，T字形，j = 8.4，7.2赫兹，H-6），7.80（1H，D，J = 7.8赫兹，5），11.98（1H，S，OH），12.09（1H，S，OH）；电喷雾质谱m/z 277 M + Na+。大黄素甲醚（2）橙色非晶粉末；核磁共振谱（300兆赫，CDCl3）2.45（3H，S，3-ch3），3.94（3H，S，6-och3），6.72（1H，BR，H-7），7.10（1H，BR，H-2），7.36（1H，BR，H-4），7.65（1H，BR的，H5），12.10（1H，BR S，OH），12.3

12、0（1H，S，OH）；电喷雾质谱m/z 307 M + Na+。大黄素（3）规范的的非晶体粉末；核磁共振谱（300兆赫，DMSO）2.45（3H，S，3-ch3），6.62（1H，D，J = 2.5赫兹，H-7），7.15（1H，D，J = 2.5赫兹，5），7.20（1H，BR，H-2），7.53（1H，BR S，H），12.05（1H，BR S，OH），12.12（1H，BR S，OH）；电喷雾质谱m/z 293 M + Na+。芦荟大黄素（4）棕色无定形粉末；核磁共振谱（300兆赫，DMSO）4.66（2H，S，3-ch2 -），5.61（1H，BR的，呵呵

13、），7.33（1H，BR，H-2），7.42（1H，D，J = 8赫兹，H-7），7.73（1H，BR S，H4），7.75（1H，D，J = 8赫兹，5），7.84（1H，T型，J = 8.4,7.2 Hz，H-6），11.98（2H，BR的，ohx2）；电喷雾质谱m/z 293 M + Na +。大黄酸（5）黄色无非晶体粉末；核磁共振谱（300兆赫，DMSO）7.43（1H，DD，j = 8.4，1.2 Hz，H-7），7.75（1H，DD，j = 7.5，1.2 Hz，

14、5），7.78（1H，D，J = 1.2赫兹，H-2），7.86（1H，DD，J= 8.4，7.8 Hz，H-6），8.15（1H，D，J = 1.8赫兹，H-4），11.91（2H，BR的，ohx2），13.77（1H，BR，COOH）；电喷雾质谱m/z 307 M + Na+。结果与讨论在以往的研究中，常在掌叶大黄提取用来抗人乳腺，卵巢妇科肿瘤活性，宫颈癌和肺癌细胞株的雌激素活性和抗肿瘤体 (Kang et al., 2006)。在现在的研究中，常从掌叶大黄各种蒽醌成分中，用人类雌激素受体表达载体和报告质粒重组酵母系统来搜索雌激素成分和表征提取物 (aloeemodin

15、, emodin, chrysophanol, etc.)。酵母培养中添加二甲基亚砜试样 (OD420 nm = 0.1)，终浓度在0.001和1000µ克/毫升之间，孵育24 h，观察-半乳糖苷酶和细胞增殖活性。 总结在表一，雌激素活性溶剂组分按下列顺序依次增加：二氯甲烷组分（EC50 0.093µgml），乙酸乙酯（EC50 0.125gml），正己烷（EC50 0.145gml），正丁醇（EC50 1.459gml），和H2O（EC50 2.853µ克/毫升）。这表明二氯甲烷组分雌激素活性最高。在硅凝胶柱层析洗脱的顺序为：正己烷-乙酸乙酯（5:1、3:1和1

16、:1）和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（20201，10101和10：5：2）。馏分中薄层色谱模式产量组分为Fr.1Fr.10。二氯甲烷馏分中雌激素活性如表2依次增加：Fr.3,Fr.4, Fr.2, Fr.10, Fr.1, Fr.5 and Fr.8。各自的EC50值分别为：0.102, 0.186, 0.201, 2.358, 2.452, 2.862和3.048 µg/mL，阳性对照 (E2; EC50 value: 0.078 µg/mL)。进一步的详细的化学成分，二氯甲烷的馏分（fr.1-fr.10）在硅胶上反复层析，从馏分 Fr.1, Fr.3和Fr.8中脱离出化

17、合物1,3和5，分别从 Fr.2 和Fr.4中脱离出化合物2和4。五个已知化合物大黄酚（1）、大黄素甲醚（2），芦荟（3）、大黄素（4）、大黄酸（5）通过光谱数据与文献价值的确定 (Liu et al., 2004; Zhou et al., 2006)。如表3所示，二氯甲烷馏分中已知五个蒽醌类化合物的雌激素活性按下列顺序依次增加：大黄素，芦荟大黄素，大黄酸，大黄酚。各自的EC50值分别为： 0.08, 1.32, 18.96, 和 23.44 µg/mL，对于阳性对照17-雌二醇（E2；EC50值：0.005µ克/毫升）。大黄素甲醚没有雌激素效应（> 100

18、1;克/毫升）。植物雌激素是的植物自然产生，有干扰雌激素的作用，可通过与雌激素受体或间接调节内源性雌激素浓度直接作用化合物的能力(Woods, 2002)。早期的研究指出了放牧对植物含有的丰富的植物雌激素有不良的影响，但是，到了今天，植物雌激素更广泛用于对抗更年期症状和降低激素依赖性疾病，如乳腺癌的发病率(Adlercreutz和 Mazur, 1997).。Chen et al。(2002) 。最近报道，蒽醌类化合物中三个结构类似的大黄素甲醚，大黄酚，大黄素对HL-60细胞最有细胞毒性的作用。在此之前，甲醇或乙醇提取物（掌叶大黄）被证明能够抑制增长SK-OV-3和A549细胞(Kang et

19、 al., 2006)。为了进一步研究这些肿瘤细胞的细胞毒性，许多研究已进行了对乳腺癌细胞株MCF-7（ER阳性）和MDA-MB-231（ER）实验。 如表4所示，二氯甲烷馏分Fr.1, Fr.2, Fr.3, Fr.4和Fr. 7中的蒽醌MCF-7和MDA-MB-231细胞依次降低。然而，非蒽醌馏分Fr.5, Fr.6, Fr.8, Fr.9和 Fr.10中MCF-7和MDA-MB-231细胞浓度小于100µg/mL，不受影响。今天，大黄素和芦荟大黄素更多的用来诱导（MCF-7）和阴性（MDA-MB-231）细胞毒性。这些结果表明，大黄素和芦荟大黄素有雌激素，因此是天然雌激素很好的

20、替代乳腺癌的抗癌剂。尽管这项研究的结果在实验室内用来ER-调节反应和抗乳腺癌细胞的增殖，我们建议，掌叶大黄的雌激素成分，如大黄素和芦荟大黄素，具有ER-mediated（雌激素）和ER-independent（抗乳腺癌）在细胞水平的影响，可以作为抗癌药物。使用体外模型，与目标分子介导雌激素或抗肿瘤活性的鉴定进行功能分析。致谢该研究是由韩国京畿道省政府“grrc”项目的支持下完成的参考文献Adlercreutz, H. and Mazur, W., Phyto-oestrogens and Western diseases. Ann. Med., 29, 95-120 (1997).Bolton

21、, J. L., Pisha, E., Zhang, F., and Qiu S., Role of quinoids in estrogen carcinogenesis. Chem. Res. Toxicol., 11, 1113-1127 (1998).Chen, Y. C., Shen, S. C., Lee, W. R., Hsu, F. L., Lin, H. Y., Ko,C. H., and Tseng, S. W., Emodin induces apoptosis in human promyeloleukemic HL-60 cells accompanied by ac

22、tivation of caspase 3 cascade but independent of reactive oxygen species production. Biochem. Pharmacol., 64, 1713-1724(2002).Ciocca, D. R. and Roig, L. M., Estrogen receptors in human nontarget tissues: biological and clinical implications. Endocr. Rev., 16, 35-62 (1995).Colditz, G. A., Hankinson,

23、S. E., Hunter, D. J., Willett, W. C., Manson, J. E., Stampfer, M. J., Hennekens, C., Rosner, B.,Speizer, F. E., and Engl, N., The use of estrogens and progestins and the risk of breast cancer in postmenopausal women. J. Med., 332, 1589-1593 (1995).Eaker, E. D., Chesebro, J. H., Sacks, F. M., Wenger,

24、 N. K.,Whisnant, J. P., and Winston, M., Cardiovascular disease in women. Circulation, 88, 1999-2009 (1993).Henderson, B. E., Ross, R., and Bernstein, L., Estrogens as a cause of human cancer: the Richard and Hinda Rosenthal Foundation award lecture. Cancer Res., 48, 246-253 (1988).Huang, H. C., Chu

25、, S. H., and Chao-lee, P.D., Vasorelaxants from Chinese herbs, emodin and scoparone, possess immuno-suppressive properties. Eur. J. Pharmacol., 198,211-213 (1991).Kang, S. C., Lee, C.M., Choi, H., Lee, J.H., Oh, J. S., Kwak,J.H., and Zee, O.P., Evaluation of oriental medicinal herbs for estrogenic a

26、nd antiproliferative activities. Phythother. Res.,20, 1017-1019 (2006).Koyama, M., Kelly, T. R., and Watanabe, K. A., Novel type of potential anticancer agents derived from chrysophanol and emodin. J. Med. Chem., 31, 283-284 (1998).Liang, J. W., Hsiu, S. L., Huang, H. C., and Lee-chao, P.D.,HPLC ana

27、lysis of emodin in serum, herbs and Chinese herbal prescriptions. J. Food Drug Anal., 1, 251-257 (1993).Liu, R., Li, A., and Sun, A., Preparative isolation and purification of hydroxyanthraquinones and cinnamic acid from the Chinese medicinal herb Rheum officinale Baill. by high-speed counter-curren

28、t chromatography. J. Chromatography A, 1052, 217-221 (2004). Palacios, S., Current perspectives on the benefits of HRT in menopausal women. Maturitas, 33(S1), 1-13 (1999).Rymer, J., Wilson, R., and Ballard, K., Making decisions about hormone replacement therapy. British Medical J., 326, 322-326 (200

29、3).Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., McMahon, J.,Vistica, D., Warren, J. T., Bokesch, H., Kenney, S., and Boyd,M. R., Comparison of in vitro anticancer-drug-screening data generated with a tetrazolium assay versus a protein assay against a diverse panel of human tumor cell lines. J.

30、Natl.Cancer Inst., 82, 1107-1112 (1990).Smith, S. S., Female sex steroid hormones: from receptors to networks to performance-actions on the sensorimotor system. Prog. Neurobiol., 44, 55-86 (1994).Tsai, T. H. and Chen, C. F., Ultraviolet spectrum identification of emodin in rabbit plasma by HPLC and its pharmacokinetics application. Asia Pac. J. Pharmacol., 7, 53-56 (199