第1部分专题5课题3血红蛋白的提取和分离

1、第第1部部分分专专题题5课课题题3理解教材理解教材新知新知把握热点把握热点考向考向应用创新应用创新演练演练知识点一知识点一知识点二知识点二考向一考向一考向二考向二返回返回返回返回返回返回返回返回 1.透析法分离蛋白质的目的是除去小分子透析法分离蛋白质的目的是除去小分子 杂质。杂质。 2利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对 分子质量大的先洗脱出来，相对分子分子质量大的先洗脱出来，相对分子 质量小的后洗脱出来。质量小的后洗脱出来。3在电泳中，待分离样品中分子带电性质的差异以及分在电泳中，待分离样品中分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状都会影响分子的迁移速度。子本身

2、的大小、形状都会影响分子的迁移速度。4SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移速率完全取决于分子聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移速率完全取决于分子的大小。的大小。5蛋白质提取和分离的一般步骤是：样品处理与粗分蛋白质提取和分离的一般步骤是：样品处理与粗分离、纯化和纯度鉴定。离、纯化和纯度鉴定。6在对蛋白质进行纯度鉴定时，使用最多的方法是在对蛋白质进行纯度鉴定时，使用最多的方法是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。返回返回返回返回 自读教材自读教材夯基础夯基础 形状和大小形状和大小电荷电荷亲和力亲和力1蛋白质分离的理论依据蛋白质分离的理论依据返回返回 2分离的方法分离的方法 (1)凝胶色谱法：根据凝胶色谱

3、法：根据 分离蛋白分离蛋白质的一种有效方法，也称做质的一种有效方法，也称做 法。法。 (2)电泳：电泳： 概念：指概念：指 在电场的作用下发生在电场的作用下发生 的过程。的过程。 原理：在一定的原理：在一定的 下，多肽、核酸等生物大分下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上子的可解离基团会带上 ，在电场的作用下，这，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。的电极移动。相对分子质量的大小相对分子质量的大小分配色谱分配色谱带电粒子带电粒子迁移迁移pH正电或负电正电或负电相反相反返回返回影响电泳效果的因素：影响电泳效果的因素：带电性质带电性质大小大

4、小形状形状迁移速度迁移速度 方法：常用的电泳方法有方法：常用的电泳方法有 电泳和电泳和 电泳。电泳。琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶酰胺凝胶返回返回 3缓冲溶液缓冲溶液 (1)配制：由配制：由12种种 溶解于水中配制而成，通溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的过调节缓冲剂的 就可以得到不同就可以得到不同pH范围内使用范围内使用的缓冲液。的缓冲液。 (2)作用：在一定范围内，抑制外界的作用：在一定范围内，抑制外界的 对溶液对溶液pH的影响，维持的影响，维持pH基本不变。基本不变。缓冲剂缓冲剂使用比例使用比例酸和碱酸和碱返回返回 跟随名师跟随名师解疑难解疑难 1凝胶色谱法凝胶色谱法 (1)

5、凝胶：是一些微小多孔的球体，内含许多贯穿的凝胶：是一些微小多孔的球体，内含许多贯穿的通道，具有多孔的凝胶，又称为分子筛。通道，具有多孔的凝胶，又称为分子筛。 (2)原理：原理：返回返回相对分子质量大相对分子质量大相对分子质量小相对分子质量小直径直径大小大小大于凝胶颗粒空隙直径，大于凝胶颗粒空隙直径，被排阻在外面被排阻在外面小于凝胶颗粒空隙直径，小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部可以进入颗粒内部运动运动方式方式垂直向下移动垂直向下移动无规则扩散进入凝胶颗粒无规则扩散进入凝胶颗粒运动运动速度速度较快较快较慢较慢运动运动路程路程较短较短较长较长洗脱洗脱次序次序先从凝胶柱洗脱出来先从凝胶柱洗脱出来

6、后从凝胶柱洗脱出来后从凝胶柱洗脱出来返回返回 2电泳的常用方法电泳的常用方法 (1)琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子的带电性质差异、各种分子在电场中的迁移速率因各种分子的带电性质差异、分子大小、形状不同而不同，从而得以分离。分子大小、形状不同而不同，从而得以分离。 (2)聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：返回返回凝胶形成：凝胶形成：单体单体(丙烯酰胺丙烯酰胺) 交联剂交联剂(N，N亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺) 引发剂和催化剂引发剂和催化剂三维网状结构凝胶三维网状结构凝胶返回返回 加入加入

7、SDS的作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成的作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链，与各种蛋白质形成蛋白质单条肽链，与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，复合物，SDS所所带负电荷的量远远超过了蛋白质分子原有电荷量，掩盖了带负电荷的量远远超过了蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。的大小。 特别提醒特别提醒测定蛋白质相对分子质量通常用测定蛋白质相对分子质量通常用SDS聚聚丙烯酰胺凝胶电泳，原因是在一定浓度范围内聚丙烯酰胺丙烯酰胺凝胶电泳，原因是在一定浓度范围内聚丙烯酰胺对热稳定性强，可用检测仪直

8、接测定。对热稳定性强，可用检测仪直接测定。返回返回 自读教材自读教材夯基础夯基础 杂蛋白杂蛋白1样品处理样品处理 (1)红细胞的洗涤：红细胞的洗涤： 目的：去除目的：去除 ，以利于后续步骤的分离纯化。，以利于后续步骤的分离纯化。 措施：分离措施：分离(低速短时间离心低速短时间离心)用胶头吸管吸去上层用胶头吸管吸去上层透明黄色血浆透明黄色血浆下层暗红色的红细胞用生理盐水洗涤下层暗红色的红细胞用生理盐水洗涤(如此如此重复三次重复三次)。返回返回(2)血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：目的：使红细胞破裂释放目的：使红细胞破裂释放 。过程：过程：血红蛋白血红蛋白返回返回离心离心滤纸滤纸脂溶性沉淀层脂溶性

9、沉淀层分液漏斗分液漏斗返回返回 2粗分离粗分离透析透析 (1)方法：将血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋方法：将血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入一定量适宜浓度的磷酸缓冲液中，透析放入一定量适宜浓度的磷酸缓冲液中，透析12 h。 (2)目的：将目的：将 的杂质除去。的杂质除去。 (3)原理：透析袋能使原理：透析袋能使 自由进出，而将自由进出，而将 保留在袋内。保留在袋内。小分子小分子大分子大分子物质物质相对分子质量较小相对分子质量较小返回返回 3纯化纯化 通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。 (1)凝胶色谱柱的制作：凝胶色谱柱的制

10、作： 取长取长40 cm，内径为，内径为1.6 cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 柱底制作：打孔柱底制作：打孔挖凹穴挖凹穴安装安装 覆盖尼龙网，覆盖尼龙网，再用再用100目尼龙纱包好。目尼龙纱包好。 柱顶制作：打孔柱顶制作：打孔安装玻璃管。安装玻璃管。 组装：将上述三者按相应位置组装，并在下端出口连接带组装：将上述三者按相应位置组装，并在下端出口连接带开关的尼龙管，尼龙管放入收集器。开关的尼龙管，尼龙管放入收集器。移液管头部移液管头部返回返回 (2)凝胶色谱柱的装填：凝胶色谱柱的装填： 色谱柱固定于支架上。色谱柱固定于支架上。 干凝胶的计算和称量。干凝胶的计算和称量

11、。 溶胀：干凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成溶胀：干凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成 。 装填：打开装填：打开 ，将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色，将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内。谱柱内。 洗涤平衡：装填完后，立即连接洗脱瓶，用洗涤平衡：装填完后，立即连接洗脱瓶，用20 mmol/L的的磷酸缓冲液洗涤平衡凝胶磷酸缓冲液洗涤平衡凝胶12 h。凝胶悬浮液凝胶悬浮液下端出口下端出口返回返回 (3)样品的加入和洗脱：样品的加入和洗脱： 调整缓冲液面：与调整缓冲液面：与 平齐平齐 滴加透析样品：用量为滴加透析样品：用量为1 mL 样品渗入凝胶床：样品完全进入凝胶层样品渗入凝胶床：样品完全进入凝胶层 洗脱：打开下

12、端出口，用洗脱：打开下端出口，用 洗脱洗脱 收集：待红色的蛋白质接近色谱柱收集：待红色的蛋白质接近色谱柱 时，用试管时，用试管收集流出液，每试管收集流出液，每试管5 mL，连续收集，连续收集凝胶面凝胶面磷酸缓冲液磷酸缓冲液底端底端返回返回 4纯度鉴定纯度鉴定 在鉴定的方法中，使用最多的是在鉴定的方法中，使用最多的是 电泳。电泳。SDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶返回返回 1洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？ 提示：提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提

13、前至于破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。分离的难度。返回返回 2在血红蛋白释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目在血红蛋白释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？的是什么？ 提示：提示：加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。细胞膜的主要加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。细胞膜的主要成分中含磷脂，磷脂易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能成分中含磷脂，磷脂易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂以释放血红蛋白。加速红细胞破裂以释放血红蛋白。 3血红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分血

14、红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？离有什么意义？ 提示：提示：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。返回返回 跟随名师跟随名师解疑难解疑难 实验结果分析与评价实验结果分析与评价 1对血液样品处理后样品发生的变化对血液样品处理后样品发生的变化 (1)正常现象：由于血红蛋白与氧气结合呈鲜红色，与二正常现象：由于血红蛋白与氧气结合呈鲜红色，与二氧

15、化碳结合呈暗红色，所以刚分离的血红蛋白溶液呈红色。氧化碳结合呈暗红色，所以刚分离的血红蛋白溶液呈红色。 (2)分层不明显的原因：洗涤次数少，未完全除去血浆蛋分层不明显的原因：洗涤次数少，未完全除去血浆蛋白。白。 (3)红细胞不纯净的原因：离心速度过高或时间过长，使红细胞不纯净的原因：离心速度过高或时间过长，使白细胞和淋巴细胞一同沉淀而造成。白细胞和淋巴细胞一同沉淀而造成。返回返回2判断装填的凝胶色谱柱成功与否判断装填的凝胶色谱柱成功与否返回返回 3对分离效果的判断对分离效果的判断 (1)若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成

16、功，分离操作正确。液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。 (2)若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。分离效果不好，装填不成功。 特别提醒特别提醒洗脱液的流速是影响分离效果的重要因洗脱液的流速是影响分离效果的重要因素之一，如果样品出现浑浊、有沉淀，可离心或过滤后再素之一，如果样品出现浑浊、有沉淀，可离心或过滤后再加样，洗脱液应维持流速的恒定，即维持洗脱液加在色谱加样，洗脱液应维持流速的恒定，即维持洗脱液加在色谱柱上的压力恒定。柱上的压力恒定。返回返回返回返回 例例1 下图表示对某蛋白质溶液进行下图表示对某蛋白质溶液进行

17、SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果凝胶电泳的结果(相似于纸层析法分离色素相似于纸层析法分离色素)，下列相关叙，下列相关叙述不正确的是述不正确的是 ()返回返回 A蛋白质上某些基团解离后可使蛋白蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子质带电，电场中带电的蛋白质分子(或或多肽多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动会向着与其所带电荷相反的电极移动 B蛋白质在蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶中的迁聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少移速度完全取决于其所带净电荷多少 C蛋白质在蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度基本聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度基本取决于相对分子质

18、量的大小取决于相对分子质量的大小 D电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种，但也可电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种，但也可能只有一种能只有一种返回返回 解析解析蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。电或负电，在电场中发生迁移。SDS聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳所加的泳所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带电荷，故其移动可完全掩盖蛋白质本身所带电荷，故其移动速度与本身所带电荷无关，而由其分子大小决定。速度与本身所带电荷无关，而由其分子大小决定。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳会使蛋白质水解成肽链，故结果所示聚丙烯酰胺凝胶电泳会使蛋白质水

19、解成肽链，故结果所示可能只有一种蛋白质可能只有一种蛋白质(有两种肽链有两种肽链)，也可能是两种蛋白质。，也可能是两种蛋白质。 答案答案B返回返回 蛋白质在凝胶色谱柱中行进的速度和途径主要与蛋蛋白质在凝胶色谱柱中行进的速度和途径主要与蛋白质分子的大小相关；在电场中的运动速度和方向除了白质分子的大小相关；在电场中的运动速度和方向除了与蛋白质的分子大小相关外，蛋白质的带电性质、电量、与蛋白质的分子大小相关外，蛋白质的带电性质、电量、形状都影响其在电场中的运动方向和运动速度。形状都影响其在电场中的运动方向和运动速度。返回返回 例例2 凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，凝胶色谱技术是一种快速而又

20、简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：用于工业生产。据图回答问题：返回返回 (1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是洗脱出来的是_，原因是，原因是_。 (2)自己

21、制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由位置相当于多孔板的结构可由_替代。替代。 (3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是在，原因是_。返回返回 (4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体_(填填“相同相同”或或“不同不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速，洗脱时，对洗脱液的流速要求是要求是_。 (5)若选用若选用SephadexG75，则，则“G”表示表示_，75表示表示_。返回返回 解析解析本题主要考查凝胶色谱法的原理和操作注意本题主要考查凝胶色谱法的原

22、理和操作注意事项，可按以下思路进行分析作答。事项，可按以下思路进行分析作答。 (1)原理：由于不同蛋白质其相对分子质量不同，相原理：由于不同蛋白质其相对分子质量不同，相对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶内部通道，只能在对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程短，速度快，易洗脱；相对分子质量凝胶外部移动，路程短，速度快，易洗脱；相对分子质量较小的则进入凝胶内部通道，路程长，速度慢。较小的则进入凝胶内部通道，路程长，速度慢。返回返回 (2)注意事项：注意事项： 凝胶色谱柱的制作：底部橡皮塞的凹穴上覆盖尼龙凝胶色谱柱的制作：底部橡皮塞的凹穴上覆盖尼龙网和网和100目的尼龙纱，相当于多孔板。目的尼龙纱，相当于多孔板。 凝胶色谱柱的装填：装填时尽量紧密，不得有气泡凝胶色谱柱的装填：装填时尽量紧密，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。分离效果。 装填材料即交联葡聚糖凝胶的特点及表示方法。装填材料即交联葡聚糖凝胶的特点及表示方法。 样品的加入和洗脱：洗脱时和浸泡凝胶所用液体均样品的加入和洗脱：洗脱时和浸泡凝胶所用液体均是物