分子生物学考试

1、第一二章遗传物质的分子本质基因工程:分、切、接、转、筛遗传物质的发现：肺炎双球菌的体内转化实验（格里菲斯）（a）将光滑型肺炎双球菌注入小鼠体内，使小鼠致死。（b）将粗糙型肺炎双球菌注入小鼠体内，对小鼠无害。（c）将光滑型肺炎双球菌加热杀死后，再注入小鼠体内，对小鼠无害。（d）将加热杀死的光滑型肺炎双球菌与粗糙型肺炎双球菌一起注入小鼠体内，小鼠死掉。结论：加热杀死的S型细菌中，含有某种促成R型细菌转化为S型细菌的“转化因子”肺炎双球菌的体外转化实验艾弗里及同事取S型细菌，分离出其中的DNA，蛋白质，多糖以及将DNA与DNA酶混合，将以上四组分分别于R型细菌培养基混合培养；结果除有DNA组的培养液

2、中既能分离出R型细菌又能分离出S型细菌，其余各组均只有R型细菌。结论：只有DNA才是使R型细菌产生稳定遗传变化的物质。DNA作为遗传物质的证实：噬菌体侵染细胞的实验用放射性同位素35S标记蛋白质，32P标记DNA，用标记的噬菌体感染细菌，发现只有标记的DNA进入细菌细胞内，而标记的蛋白质留在细胞外。结论：DNA是遗传物质。证明DNA的半保留复制将大肠杆菌放在15N为唯一氮源的培养基上连续培养，使细胞内的DNA两条链上的14N被15N取代，收集菌体，一部分用于抽取DNA，一部分放在14N为氮源的培养基中继续培养一代，一部分提取DNA，另一部分继续培养，再提取DNA,用CsCl密度梯度离心的方法，

3、发现0代为一条高密度带，两条链上的N原子全部是15N，第一代为中密度带，第二代中有中密度带和低密度两条带。DNA的提取：1. 细胞裂解2. 去除蛋白等杂质（酚：氯仿：异戊醇25:24:1）3. 沉淀DNA（乙醇，异丙醇）4. 风干DNA5. 溶解DNA细胞破碎：机械方法：超声波处理法、研磨法（植物叶）匀浆法（动物组织）； 化学试剂法：用SDS、CTAB（植物组织）； 酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。DNA的测序：Sanger的双脱氧终止法核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链

4、就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5端，以双脱氧碱基为3端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。PCR技术（聚合酶链式反应）原理：双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。反应条件：Taq酶，dNTP,Mg离子，引物，模板过程：变性，退火，延伸核酸的分子杂交（Southern印记杂交）原理：具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补

5、配对原则退火形成双链的过程。步骤：（一）待测核酸样品的制备1、 裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段（二）待测DNA样品的电泳分离（三）凝胶中核酸的变性（碱变化）凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的 单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液（四）Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程（五）Southern杂交 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点预杂交液为不含DNA探针的杂交液2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交3、洗膜：去除游离的放射性探针或

6、非特异结合的DNA（六）杂交结果检测1、放射自显影2、比色或化学发光检测第三章 基因、基因组及基因组学基因：是DNA分子上具有特定功能的(或具有一定遗传效应的)核苷酸序列，是遗传的基本单位。（有编码序列和非编码序列两部分；后者包括调控序列、内含子及编码区两端的序列）转座成分or 移动基因:是一些可以在染色体基因组上从一个位置转移到另一个位置，甚至在不同染色体之间跃迁的DNA成分。有人将之形象地称为跳跃基因。（Ac/Ds因子）Ac-Ds系统 玉米糊粉层颜色的控制涉及多对相关基因。C基因为野生型时，胚乳呈紫色，若C基因突变为c阻断了紫色素的合成，那么胚乳为白色。在胚乳发育过程中，若突变发生回复则导

7、致产生斑点，回复突变发生得越早，产生的紫斑就越大，发生得越晚，则产生的紫斑就越小。McClintock认为突变基因c(无色)是由一个可移动的"控制因子(controlling element)"(现称转座子)引起的，称为解离因子(dissociator，Ds)，它能合成转座酶，它可以插入到基因C中，即转座。另一个可移动的控制因子是Ac，称激活因子(Activator)，它的存在可以激活Ds转座进入C基因或别的基因，也能使Ds从基因中转出，使突变基因回复。这就是Ac-Ds系统。断裂基因：在编码序列中间插有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，这些间隔区称为内含子；而编码区则称为外显

8、子。含有内含子的基因称为不连续基因或断裂基因。（内含子并非都含而不显，外显子并非都显）假基因：是一些核苷酸序列与其相应的正常功能基因基本相同、但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。（人类珠蛋白）重叠基因：核苷酸序列是彼此重叠的的基因称为重叠基因或嵌套基因。基因按其产物的功能可分为结构基因、调控基因和RNA基因。结构基因：可被转录形成mRNA，并进而翻译成多肽的基因。调控基因：指某些可调节控制结构基因表达的基因。RNA基因：是一些只转录不翻译的基因，包括核糖体RNA基因，专门转录rRNA；以及tRNA基因，专门转录tRNA。C值：生物体的单倍体基因组所含DNA总量称为C值。C值矛盾：生物体的复杂性

9、与DNA含量并不总是正相关。N值矛盾：生物体的复杂性与基因数之间并不总是正相关。原核生物的基因组包括两类DNA分子，染色体携带细胞生存和繁殖所需的全部遗传信息，质粒染色体以外独立存在的DNA分子。操纵子(operon)：功能上相关的几个结构基因前后相连，由一个共同的调节基因和一组共同的控制位点，即启动子(promoter)和操作子(operator)对其表达过程实行协同调节控制。细菌基因表达调控的这样一个完整的单元，称为操纵子。质粒DNA：细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，

10、常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。基因家族：真核生物基因组中，来源相同、结构相似、功能相关的一组基因。如人类珠蛋白和类珠蛋基因家族。根据基因家族成员的分布形式不同，基因家族分为：基因簇和散布的基因家族基因簇：基因家族的各成员紧密成簇排列成大段的串联重复单位，定位于染色体的特殊区域。它们是同一个祖先基因扩增的产物。如人类类链基因簇和类链基因簇。散布的基因家族：基因家族成员在DNA上无明显的物理联系，甚至分散在多条染色体上。如肌动蛋白基因家族和微管蛋白基因家族。重复基因：染色体上大量无转录活性的重复DNA序列家族，主要是基因以外的DNA序列。重复基因有两种组织形式：串联重复序列和散

11、布的重复序列根据重复单位的大小，重复基因可分为卫星DNA；小卫星DNA；微卫星DNA 卫星DNA：有些高度重复DNA序列的碱基组成和浮力密度同主体DNA有区别，在浮力密度梯度离心时，可形成不同于主DNA带的卫星带，此类DNA称为卫星DNA。散布的重复序列：短散布元件（Short interpersed element, SINE；长散布元件（Long interpersed element, LINE）细胞器基因组绝大多数为环状，少数低等真核生物为线性分子。第四章 DNA的生物合成 DNA复制的基本特点：模板，dNTP, Mg2+，解链，半保留复制，需引物，复制方向53，起始特定区域，终止区不

12、固定，方向一般为双向，半不连续，高度忠实性。与DNA复制有关的酶、蛋白质：DNA聚合酶、DNA解链酶、单链结合蛋白、DNA引发酶、DNA拓扑异构酶、DNA连接酶和端粒酶。所有DNA聚合酶、 RNA聚合酶的三维结构都相似，由finger、palm、thumb（手指、手掌、拇指）三个结构域组成。原核生物DNA pol E.coli DNA 聚合酶: DNA pol I；DNA pol II；DNA pol III；DNA pol IV；DNA pol V DNA pol I具有53聚合酶活性 5核酸外切酶活性（切除DNA5端的RNA引物） 3核酸外切酶活性（自我校对）Hans Klenow 用蛋白

13、水解酶水解DNA pol I 的323-324位，得到两个片段：大片段：75kd，605aa聚合酶活性（大）35核酸外切酶活性（小）；小片段：36kd，323aa 53核酸外切酶活性。DNA聚合酶53外切活性切口平移的功能用于制备探针！DNA pol II有53聚合酶活性 35核酸外切酶活性DNA pol III：多亚基；聚合酶活性是DNA pol I 的 50 倍；50,000base/min；10-20分子/cell；有35 核酸外切酶活性； 无53核酸外切酶活性；高进行性；真核生物DNA pol DNA pol a : 引物合成 DNA pol b : DNA repair DNA po

14、l g : 线粒体 DNA合成 DNA pol d : DNA pol III DNA pol e : DNA pol I半不连续复制是指DNA复制时，前导链上DNA的合成是连续的，后随链上是不连续的脉冲标记实验：以E.coli为材料，在培养时，培养基中加入同位素3H标记的 dNTP，经30秒后，DNA刚开始复制，分离DNA，然后在碱中沉淀，变性，让新合成的单链和模板链分开，再用CsCl密度梯度离心，以沉降的快慢来确定片段的大小，再检测放射标记，结果表明被3H标记的片段，也就是新合成的片段，沉淀系数为20S左右，即都是长10002000Nt的DNA片段，而亲本链要比它大2050倍；第二组实验是

15、脉冲追逐实验，先进行标记培养30秒，以后除去同位素继续培养几分钟，再分离DNA在碱中沉淀，检测结果为较长的片段。刚开始合成的片段都是短片段，以后再连接成长片段。前导链上的合成是连续的，只有后滞链上的合成才是半连续的。端粒：真核细胞内线性染色体末端的一种特殊结构，由DNA简单重复序列以及同这些序列专一性结合的蛋白质构成。端粒酶：一种反转录酶，由蛋白质和RNA两部分组成核糖蛋白复合体，其中RNA是一段模板序列，指导合成端粒DNA的重复序列片段。端粒的功能：稳定染色体末端结构，防止染色体间末端连接，并可补偿滞后链5'末端在消除RNA引物后造成的空缺。DNA复制的高度忠实性（1） 四种脱氧核苷

16、三磷酸浓度的平衡（2） DNApol的高度选择性（3） DNApol的自我校对（4） 错配修复（5） 使用RNA作为引物第六章 DNA 重组DNA重组：发生在DNA分子内或分子间核苷酸的交换、重排和转换现象，是已有遗传物质的重新组合。重组的生物学功能:产生新的基因/等位基因的组合（在减数分裂交换期间）产生新的基因（如抗体基因的重排） 特定的DNA元件的整合DNA修复 重组原理的应用用于染色体上的基因作图（重组频率与基因之间的距离相关）培育转基因细胞和生物重组的类型：同源重组 位点特异性重组 转座重组 1.同源重组 发生在近乎相同的序列之间（如在减数分裂），只依赖序列的同源性2.位点特异性重组发

17、生在具有一定相似性的序列之间，涉及特异性位点3.转座重组DNA元件从一个位点转移到另一个位点，通常没有序列的特异性同源重组：它发生在含有同源序列的两个DNA分子之间，即在两个DNA分子的同源序列之间直接进行交换。进行交换的同源序列可能是完全相同的，也可能是近乎相同的。细菌的接合、转导、转化和真核细胞的同源染色体之间的交换等都属于同源重组。同源重组机制-Holliday模型 过程：（1）两个同源的DNA相互靠近（2）两个DNA分子在相同的位置被一种特异性的内切酶切开 （3）被切开的链交换和连接形，中间物称为Holliday中间物或Holliday连接.Holliday模型的特点：两个DNA分子上

18、各有1条链在对应的位置发生两次断裂，有分支迁移。如果第二次断裂点和第一次断裂点在同一条链，则结果为非重组型DNA，如果第二次断裂点是在另外一条链上，则结果为重组型DNA。参与重组的主要蛋白RecA参与大肠杆菌所有的同源重组途径，有单体和多聚体两种形式。RecA的主要功能包括两个完全不同的活性：（1）促进2个DNA分子之间链的交换；（2）促进LexA 阻遏蛋白的自我水解（DNA修复）原理： RecA初级位点与单链DNA结合，* RecA的次级位点与1个双链DNA分子结合，* RecA催化链交换。RecA蛋白促进2个双链DNA分子链之间的交换同时满足三个条件 ：（1） 两个DNA分子中的一个必须含

19、有单链区域，以便于RecA能够结合（2） 两个DNA分子必须含有不低于50bp的同源序列（3） 同源序列内必须含有一个自由的末端，以启动链的交换RecA蛋白参与同源重组的具体步骤：（1） 联会前阶段 RecA通过它的第一个DNA结合位点与单链DNA结合，包被DNA，形成蛋白质-DNA丝状复合物（2） 联会阶段 RecA通过它的第二个DNA结合位点与一个双链DNA分子结合，形成3链DNA中间体，随后单链DNA侵入双链DNA，寻找同源序列。（3） 链交换阶段 由被RecA包被的单链DNA从53方向取代双链DNA分子中的同源老链，形成异源双链，并发生分叉迁移。大肠杆菌几种重要的同源重组途径：1） R

20、ecBCD途径 这是大肠杆菌最主要的重组途径。除了RecBCD以外，还需要RecA、SSB、RuvA、RuvB、RuvC、DNA聚合酶I、DNA 连接酶和DNA旋转酶。此外，还需要chi序列。RecBCD蛋白由RecB、RecC和RecD三个亚基组成。 具有5种酶的活性外切核酸酶V、解链酶、核酸内切酶、ATP酶和单链DNA外切酶。RecBCD蛋白的作用模型RecBCD与双链DNA分子自由末端结合，依靠ATP的水解为动力，延双链移动，解开双链，但它在上面一条链比在下面一条链移动的速度要快，于是一个单链的环形成了，这种环随着它沿DNA双链的移动而增大，先是依靠它的3外切酶活性降解上面的一条链。一旦

21、遇到序列，3外切酶活性减弱，而5外切酶活性被激活，于是下面一条的单链部分被迅速降解水解，留下上面一条链的单链部分。产生的单链DNA，为RecA作用的底物，由此启动了链的交换和重组反应。RecBCD结合在双链断裂，RecBCD解链并作为外切酶降解DNA，RecBCD停留在chi处，内切酶切开单链RecD在chi顺序解离RecBC继续作为解链酶 （2）RecF途径 这主要是质粒之间进行重组的途径，需要的蛋白质有RecA、RecJ、RecN、RecO、RecQ和Ruv等。（3）RecE途径位点特异性重组是指在DNA特定位点上发生的重组，它需要专门的蛋白质识别发生重组的特异性位点并催化重组反应。位点特

22、异性重组也发生链交换、形成Holliday结构、进行分叉迁移和Holliday结构解离。位点特异性重组可以发生在2个DNA分子之间（发生整合），也可以在1个DNA分子之内（发生缺失或倒位）。位点特异性重组的功能包括：（1）调节噬菌体的整合；（2）调节基因表达；（3）调节胚胎发育期间程序性的DNA重排。转座重组：DNA上的核苷酸序列从一个位置转位或跳跃到另外一个位置的现象。发生转位或跳跃的核苷酸序列被称为转座子或可移位的遗传元件。（与同源重组和位点特异性重组不同的是，转座子的靶点与转座子并不存在序列的同源性。接受转座子的靶位点可能是随机的，也可能具有一定的倾向性，这与转座子本身的性质有关。）原核

23、生物的转座子的类型及特点：插入序列（IS）；复杂型转座子；复合型转座子（TnA家族）；Mu噬菌体插入序列（IS）能够从DNA的一个位点插入到另一个位点，导致靶位点基因以及和靶位点基因在同一个操纵子内，但位于靶位点基因下游的基因表达受阻称为极性效应。极性效应：上游基因的敲除或插入导致其下游基因表达受阻的现象。IS：1）较小，长度一般在700bp -1800 bp之间；（2）绝大多数两端含有10bp-40bp长的反向重复序列；（3）通常内部只有一个基因，编码的蛋白质是专门催化转位反应的转座酶（tnpA），没有任何抗生素或其它毒性抗性基因；（4）通过“剪切”和“粘贴”的方式进行转座，转座结束后可导致

24、插入点序列重复。（5）有少数IS，没有明显的反向重复序列，它们是通过复制（滚环复制）与粘贴的方式进行转座的。 复杂型转座子：（1）长度较长；（2）两侧含有较长的反向重复序列；（3）内部含有一个或几个结构基因。常见的结构基因有：转座酶基因tnpA，解离酶基因tnpR和抗生素抗性基因。（4）转座完成以后可导致约5 bp长的靶位点序列加倍，从而在转座子两侧产生直接重复序列。复合型转座子：2个IS（同向或反向均可）插入到功能基因（抗生素或其它毒性抗性基因）两端，形成复合型转座因子。每个IS（作为第一类转座子）可以独立转位，也可以与插入的功能基因作为整体一起转位。Mu噬菌体：两侧无反向重复序列，基因组有

25、20多个基因，但只有A基因（编码转座酶）和B基因（与复制和转座有关）与转座有关联。在转座的过程中，可引起靶位点序列重复。在溶源状态下，它能在宿主DNA的不同位置间随机转移。由于Mu转移的靶位点不固定，很容易造成宿主细胞的各种突变，其名称与它的诱变子角色有关。 转座机制类型 (1) 复制型转座(2) 非复制型转座(3) 保守转座真核生物转座子的类型及特点真核生物的转座子类型：Ac-Ds系统，果蝇的P元件，“水手”元件，MITE；酵母的Ty元件，果蝇的copia元件，LINE和SINE等转座的分子机制：简单转座、复制型转座真核生物转座的分子机制：简单转座（“剪切”和“粘贴”机制 ），复制型转座（“

26、复制”和“粘贴”机制）第七章 DNA转录-RNA生物合成模板链（无意义链，Watson链）可作为模板转录为RNA的那条链，该链与转录的RNA碱基互补。另一条链称为该基因的编码链（有意义链，Crick链）。原核生物RNA聚合酶的结构与功能所有的三类RNA由同一种RNA聚合酶催化大肠杆菌的RNA聚合酶大小为465 kD，含有2 , 1, 1, 1, 1亚基。 全酶2 核心酶： 2 全酶由核心酶和因子组装而成。抑制剂：利福霉素和利链霉素因子具有两个功能：(1) 降低酶对非特异性DNA序列的亲和性。(2) 大大提高酶对启动子序列的亲和性。(70正常生长(主要的),32热休克(应急条件下),60N饥饿(

27、应急条件下)全酶的结构与功能:结合DNA ，结合NTPsb和 一起构成活性中心，a聚合酶的组装，转录的起始，与调节蛋白的相互作用，转录的起始和延伸，它们也能结合 DNA. r识别启动子序列。真核细胞的细胞核具有三种RNA聚合酶:RNA聚合酶I(A)：细胞核内的rRNA（5S rRNA除外）RNA聚合酶II(B) mRNA snRNARNA聚合酶III(C)小分子RNA（tRNA和5SrRNA）除此以外，线粒体和叶绿体也含有RNA聚合酶。-鹅膏蕈碱是真核生物RNApol抑制剂 。RNA pol详细的三维结构：钳、翼、舵、拉链、次级通道、离开通道（p163）启动子是位于结构基因5'端上游的

28、DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。 启动子包括两段一致序列： “-35 区” 、“-10 区增强元件：在某些转录活性超强的rRNA基因的上游40和60之间的区域，富含AT的序列，可将转录活性提高30倍。转录的起始：RNA聚合酶与启动子相互作用并形成活性转录起始复合物的过程，整个反应可分为以下几步：RNA聚合酶与dsDNA非特异性结合；RNA 聚合酶全酶与启动子形成封闭复合物；封闭复合物异构化，转变成开放复合物；第一个磷酸二酯键形成 ；启动子清空 细菌基因转录起始过程中开放复合物的形成 见右图转录的延伸当RNApol合成了大约十聚核苷酸的时候延伸开

29、始，这时转录物的长度足以让RNA取代因子，失去因子的核心酶通过松散的“滑动钳”构象握住DNA，以更快的速度沿着模板链向前推进。转录泡则随着核心酶的移动而移动，其大小维持在17 bp左右。转录泡的维持不仅需要聚合酶在转录泡前面解链以使新的模板链序列得以暴露，而且还要允许转录泡后面的DNA重新形成双链。解链形成的超螺旋可被结合在转录泡前面的拓扑异构酶解除。由于转录的方向始终是从53，新参入的核苷酸总是被添加在RNA链的3-OH端。每参入一个新的核苷酸，RNA-DNA杂交双链必须发生旋转。转录的终止两种机制：依赖于因子的终止；不需要因子，但需要RNA转录物3-端一段被称为终止子的序列。不需要因子的转

30、录终止：RNA聚合酶到达终止子的时候暂停，发夹结构形成，发夹结构破坏了RNA聚合酶和它的RNA产物之间的作用，富含U-的序列很容易与模板链解离，转录复合物解体，转录终止.依赖于因子的终止：转录复合体通过因子辅助，特异性识别自身合成RNA的富含胞苷和少含鸟苷的区域与茎-环区相连结构为转录终止信号，并从模板DNA解离释放的过程。 真核生物DNA转录启动子包括核心启动子和上游控制元件（UCE）转录终止需要一种特异性的DNA结合终止因子 mRNA的基因转录受到多种顺式作用元件的控制，包括核心启动子、调控元件、增强子和沉默子。核心启动子包括：TATA盒、起始子（Inr）、TFIIB识别元件（BRE）、下

31、游启动子元件（DPE）和GC盒。上游控制元件：在启动子上游存在的TATA框,CAAT框和多个GC框,它们均对启动子的启动过程起调控作用。顺式作用元件：在同一条核苷酸链上起调控基因作用的核酸序列弱化子：RNA合成终止时，起终止转录信号作用的那段DNA序列。沉默子：是一种抑制基因表达的顺式作用元件第八章 转录后加工基因转录的直接产物被称为初级转录物。初级转录物一般是无功能的，它们在细胞内必须经历一些结构和化学的变化即所谓的转录后加工以后才会有功能。RNA后加工主要有：增减某些氨基酸、修饰某些氨基酸真核细胞mRNA前体的后加工加工形式 1) 5-端 = 加帽2) 3-端 = 加尾3) 内部 = 剪接

32、4) 内部=甲基化 5) 编码区=编辑加帽和甲基化:帽子结构和类型 0、I和 II型,加帽反应：共转录1) 酶,磷酸水解酶；mRNA鸟苷酸转移酶；鸟嘌呤-7-甲基转移酶 2) 步骤开始于mRNA 5-三磷酸的 磷酸根水解,留下的5-二磷酸进攻GTP，与GMP形成共价交联，同时释放出PPi.鸟嘌呤随后在N7位置被甲基化，甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸为什么要有帽子？提高mRNA的稳定性参与识别起始密码子的过程，提高mRNA的可翻译性有助于mRNA通过核孔从细胞核运输到细胞质提高剪接反应的效率。帽子结构的功能:(1)有助于mRNA越过核膜，进入胞质； (2)保护5不被酶降解； (3)翻译时供IF（起始

33、因子）和核糖体识别。为什么只有mRNA加帽?之所以只有mRNA和某些snRNA才有帽子结构，是因为它们都由聚合酶II催化，当TFIIH磷酸化CTD重复序列后，它即可以将转录因子DSIF 招募到转录复合物，而新加入到复合物之中，DSIF随后将另外一种转录因子NELF招募进来，以阻滞转录。上述暂停允许加帽酶进入，来修饰转录物的5-端。第三种转录因子P-TEFb是一种激酶，在帽子结构形成不久也被招募到复合物，然后磷酸化CTD的Ser2和NELF，NELF随之失活，聚合酶II继续延伸。为什么必须有尾巴？保护mRNA免受3-外切核酸酶的消化，提高mRNA的稳定性。PABP能够与帽子相互作用增强mRNA的

34、可翻译性，提高其翻译的效率；影响最后一个内含子的剪接；某些本来缺乏终止密码子的mRNA通过加尾反应创造终止密码子。在UG后加尾可产生UGA，在UA后加尾产生UAA；通过选择性加尾调节基因的表达。核酶：是指本质为RNA或以RNA为主含有蛋白质辅基的一类具有催化功能的物质。GU-AG规则RNA内含子序列 5' 端 的起始两个核苷酸总是 5'-GU-3' ，并且其 3' 端 的最后两个核苷酸总是 5'-AG-3' 。左边的剪接位点称供体（donor）位点，右边的剪接位点称受体（acceptor）位点。mRNA前体的剪接机制 ：mRNA前体的剪接是高度精

35、确的。其精确性一方面取决于位于外显子和内含子交界处的剪接信号（可以将其视为内因），另外一方面取决于5种被称为snRNP（核内小核糖核蛋白）的核糖核酸蛋白质复合物（可以将其视为外因）。剪接反应的“内因”剪接信号剪接反应的“外因”snRNP和剪接因子剪接反应两次转酯反应剪接体的组装snRNP:核内小核糖核蛋白拼接体：主要由mRNA前体、mRNA前体结合蛋白和5种snRNP在细胞内，安装一定的次序组装成的超分子复合物BBP:分支点结合蛋白顺式作用元件：指同一DNA分子中具有转录调节功能的特异DNA序列。包括启动子、增强子等。反式作用因子：指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控

36、靶基因转录效率的蛋白质。多为转录因子。内含子的归巢：Intron（基因内区）中有ORF，可编码内切酶，使intron 以原来的DNA形式或作为RNA的DNA 拷贝插入一条新的靶位点。gRNA：指导RNA前体的后加工核糖核酸酶P：原核生物中，切除转移核糖核酸(tRNA)前体的5端序列产生成熟tRNA 5端的核糖核酸内切酶。该酶含有蛋白质和RNA两组分，其蛋白质组分没有催化活性，而RNA组分具有全酶的催化活性，是一种核酶。第九章 蛋白质的生物合成摆动规则：密码子在与反密码子之间进行碱基配对的时候，前两个碱基严格遵守标准的碱基配对规则，第三个碱基则具有一定的自由度。摆动规则的意义在于使得在翻译的过程

37、中，tRNA和mRNA有一对碱基不是严格配对，氢键较弱更容易分离，从而加快翻译的速度。损伤mRNA的抢救合成：无终子密码子的缺陷的mRNA结合的核糖体当翻译到断裂的末端，将裹足不前，难以解离。E. coli和其它细菌已发展了一套专门的机制处理这些无终止密码子的有缺陷的mRNA，这种机制为反式翻译。反式翻译不同于一般的顺式翻译，它将两个mRNA翻译成一条融合的肽链，其中有一个mRNA分子无终止密码子，另一个mRNA分子是tmRNA翻译的抑制剂林可霉素、氯霉素、红霉素、链霉素和四环素林可霉素：抑制原核生物的转肽活性氯霉素：抑制原核生物的转肽活性，结合在L16附近，似乎阻止氨酰-tRNA的酰胺基端与

38、A部位的正确结合。红霉素：阻止多肽链离开通道的入口。链霉素：干扰密码子与反密码子的配对，导致mRNA的误读，也能抑制起始反应。四环素：抑制酰胺-tRNA与A部的结合。第十章 多肽链折叠与翻译后加工蛋白质折叠的三条途径：（）不依赖于分子伴侣的折叠；（）受热激蛋白帮助的折叠；（）受热激蛋白和伴侣蛋白复合物帮助的折叠几种有促进蛋白折叠功能的大分子:1. 分子伴侣2. 蛋白二硫键异构酶 3. 肽-脯氨酰顺反异构酶 分子伴侣：细胞中一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。 （1）热休克蛋白(heat shock protein, HSP) HSP70、HSP40和Gr

39、eE族 （2）伴侣素(chaperonins) GroEL和GroES家族热休克蛋白促进蛋白质折叠的基本作用：结合保护待折叠多肽片段，再释放该片段进行折叠。形成HSP70和多肽片段依次结合、解离的循环。 伴侣素的主要作用:为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。10.2 蛋白质翻译后的定向与分拣 定向与分拣：蛋白质合成后所经历的转移和定位的过程称为蛋白质的定向与分拣。细胞内蛋白质定向、分拣的途径分为：共翻译途径在翻译延伸还没有结束的时候就被启动；翻译后途径需要在翻译结束以后才被启动。10.2.1 共翻译途经信号肽：是一段在一级结构上连的续氨基酸序列，是蛋白质分拣信号。能够引导蛋

40、白质从细胞液进入内质网、高尔基体、胞外、细胞核、线粒体叶绿体和过氧化物酶体。信号斑：是存在于已折叠的蛋白质表面的三维分拣信号。信号识别颗粒：Signal Recognition Particle（）第11章 原核生物基因表达调控基因表达调控水平：水平、转录水平、转录后加工水平、翻译水平、翻译后加工水平基因表达的调控方式：负调控:调控蛋白（阻遏蛋白）+DNA序列阻遏基因的表达(相应蛋白质降低) 正调控:调控蛋白（激活蛋白）+DNA序列促进基因的表达(相应蛋白质增加)相关效应物：诱导物或辅阻遏物负调控：无调节蛋白存在时 操纵子中的结构基因是表达的；加入调节蛋白与DNA序列相互作用之后，基因的表达就

41、被关闭了，这样的调控就叫做负调控。负调控系统中的调节蛋白叫做阻遏蛋白。在负调控中，反式作用的阻遏物与顺式作用的操纵子区域结合，关闭操纵子，终止基因的转录。许多阻遏物都能以活性和无活性的状态存在。 诱导物的结合能使阻遏物失活，辅阻遏物的结合则能激活无活性的阻遏物，使之变为活性状态。正调控：无调节蛋白存在时基因是关闭的，加入调节蛋白后调节蛋白与DNA的结合能促进结构基因的表达，这样的调节方式叫做正调控。正调节中的调节蛋白叫做激活蛋白或正调节蛋白。操纵子处于关闭状态是指它的表达水平很低，但总还是存在本底水平的基因表达。在正调控中，反式作用因子须与顺式作用位点结合以利于基因的转录。在正调控中，反式作用

42、因子须与顺式作用位点结合以利于基因的转录。顺式作用元件：是指对基因表达有调节活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处在一个DNA分子上的基因；同时，DNA序列通常不编码蛋白质，多位于基因旁侧或内含子中，如启动子、操纵子、终止子。顺式作用元件的作用属于顺式作用。反式作用因子是能调节与它们接触的基因的表达的各种扩散分子（RNA或蛋白质），如转录因子；其编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列不在同一个DNA分子上。基因的产物（RNA或蛋白质）的作用属反式作用。基因的产物（RNA或蛋白质）的作用属反式作用调控基因则属于反式作用元件其编码产生的调控蛋白为反式作用因子。操纵子：是原核生物基因表达和调控的基

43、本单位，包括结构基因和调控元件（调节基因、操作子（操纵基因，operator）和启动子、终止子）两部分。结构基因：操纵子中被调控的编码蛋白质的基因。调节基因：编码与操纵子结合的调控蛋白的基因。操作子(操纵基因)：凡能与调控蛋白特异性结合、从而影响基因转录强弱的序列，不论其对基因转录的作用是减弱、阻止或增强、开放，都可称为操作子。效应物：某些特定的物质能与调控蛋白结合，使调控蛋白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录的影响，这些特定物质可称为效应物。诱导物：其中凡能引起诱导发生的分子称为诱导物（inducer），它与调控蛋白的结合能促进基因的表达。诱导物能与处于活性状态的阻遏蛋白结合，使之失活

44、而不能与操作子结合，于是RNA聚合酶就能起始转录。辅阻遏物：能导致阻遏发生的分子称为辅阻遏物（corepressor），它与调控蛋白的结合能阻遏基因的表达式。辅阻遏物与阻遏物结合,使之变为活性形式(激活)后与操作子结合,抑制操纵子.操纵子类型：诱导性操纵子（如乳糖操纵子）、阻遏型操纵子（如色氨酸操纵子）别乳糖：乳糖的一种代谢产物。一种乳糖异构体，为乳糖操纵子的天然诱导物。操作子：凡能与调控蛋白特异性结合、从而影响基因转录强弱的序列，不论其对基因转录的作用是减弱、阻止或增强、开放，都可称为操作子。葡萄糖效应:指当葡萄糖和其它糖类一起作为细菌的碳源时葡萄糖总是优先被利用，葡萄糖的存在阻止了其它糖类

45、的利用的现象。乳糖操纵子的结构由阻遏蛋白基因（I）、启动子（P）、操纵基因（O）和编码与乳糖利用密切相关的三个酶的结构基因：Z（半乳糖苷酶）、Y （乳糖透过酶）、A （转乙酰酶）区段组成。阻遏蛋白基因（I）属于组成型的调控，是经常表达的，因此，lac操纵子通常是处于关闭状态的。lac操纵子的调控1、由调节基因表达的乳糖阻遏蛋白的可诱导的负调控2、由CAP-cAMP引起的正调控lac基因可诱导的负调控：1，lac阻遏蛋白与操作子结合，在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。I基因在其自身的启动子Pi控制下，低水平、组成型表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白。R以四聚体形

46、式与操纵子结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子Plac的结合，阻止了基因的转录起动。2 阻遏蛋白与操作子的解离，当有乳糖存在时，细胞中很低水平的乳糖透过酶能使乳糖透过细胞膜被细胞摄取。乳糖受半乳糖苷酶的催化转变为别乳糖，别乳糖是天然的诱导物，与阻遏蛋白结合使之变构，由四聚体解聚成单体，导致其与操作子的亲和力下降1000倍，结构基因开放，RNA聚合酶结合，转录开始。乳糖对lac操纵子的诱导作用：一些化学合成的乳糖类似物，不受半乳糖苷酶的催化分解，却也能与R特异性结合使R构象变化，诱导lac操纵子的开放。异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiog- alactoside，IPTG)：诱导剂，不被

47、细菌代谢而十分稳定，与阻遏蛋白特异性结合，并诱导阻遏蛋白构象发生改变，导致lac操纵子的开放。X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷）：人工合成的半乳糖苷，可被半乳糖苷酶水解产生蓝色化合物沉淀，因此可以用作半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG作为诱导物与LacI的基因产物阻遏蛋白结合，使之转变为无活性形式而不能与操作子结合，于是RNA聚合酶就能起始基因的转录（LacZ基因），表达。LacZ基因表达产物半乳糖苷酶则将底物X-gal水解，产生蓝色化合物。假如多克隆位点中插入了外源基因，则LacZ不能表达，于是X-gal也不被水解，底物就仍为白色。重组菌落就是白色，非重组菌就是蓝色。所谓蓝白斑筛选。色氨酸操纵子的结构：启动子（trpP）、一个操