STAT信号转导机制研究

1、il 11保护中子照射后肠上皮损伤的jak/stat信号转导机制研究(作者:单位:邮编:)作者：王瑞娟，彭瑞云，高亚兵,常公民，徐新萍，付凯飞,罗庆良【摘要】 目的：探讨il "对中子照射后肠上皮内jak/stat通路的影响，并观察其对bax和bel2表达的影响。方法：balb/c小鼠和iec 6细胞经4 gy中子照射和il 11处理分别作为肠上 皮损伤的体内外模型，采用he染色、western blot、emsa、免 疫组化和图像分析技术分别检测肠道病理变化、jak1和stat3活性及bax和bel 2的表达。结果:中子照射后，小鼠肠道损伤极 为严重，且未见明显再生；il &quo

2、t;治疗组隐窝上皮细胞及存活隐窝数量较多。(2)中子照射后，iec6细胞jak1和stat3活性均减弱，il11处理可增加二者活性。(3)中子照射后，小鼠肠道bax表达增加,bel2表达无明显改变；应用il 11可降低bax表达，增加bel2表达。结论：在中子辐射时，il11可通过激活jak/stat通路,并下调bax表达，上调bel 2表达，对肠上皮起到一定的保护作用。【关键词】放射；肠上皮；il 11; jak/stat;凋亡abstract aim: to explore the effect of il 11 on the activation of jak/stat pathway

3、and the expressions of bax and bel 2 in the intestinal epithelial cells exposed to neutron radiation. methods: the balb/c mice and iec 6, irradiated by 4 gy neutron with or without il 11 treatment, served as in vivo and in vitro model seperately. the changes of the intestines, activity of jak1 and s

4、tat3 and expressions of bax and bel 2 were observed by he staining, western blot, emsa, immuno histochemistry and image analysis. results: (1)mice exposed to neutron radiation showed severe intestinal damages and no obvious regeneration was seen. il 11 treated mice had a larger number of cryptal epi

5、thelial cells and crypts. (2)neutron radiation decreased the activities of jak1 and stat3, while il 11 increased their activities(3) neutron radiation decreased the expression of bax and didn't change the level of bel 2 in the murine intestine. il 11 administration decreased the expression of ba

6、x and increased that of bel 2. conclusion: the mechanism of the intestinal protection of il 11 in neutron irradiation might be that il 11 stimulation triggered activation of jak/stat pathway, down regulated the expression of bax and upregulated the expression of bel 2.keywords radiation; in testinal

7、 epithelium; in terleukin11;jak/stat; apoptosis肠上皮对细胞毒性事件尤其是中子辐射高度敏感，目前尚无防 治良策。白细胞介素11 ( interleukin 11, il 11 )是一种多效能 的细胞因子，有研究显示其在一些肠道损伤模型中可保护肠隐窝干 细胞1, 2 本课题组前期研究结果表明，il11可刺激肠上皮细胞表面il 11受体表达上调，抑制中子辐射后肠上皮细胞凋亡，促 进增殖3o但有关il 11诱导的jak/stat通路在其中的改变及 意义如何，迄今未见报道。肠道放射损伤时，细胞凋亡是其损伤的主 要反应之一，bel 2和bax是细胞凋亡的重要

8、调控分子，同时也受 到信号转导子和转录激活子3 ( signal transducer and activator of transcription 3, stat3 )的调控1, 4 为此,本研究复制了 il 11保护中子照射肠上皮损伤的体内外模型，并探讨了 jak/stat 通路及bel 2、bax在其中的变化及意义，以期为其防治提供依据 和线索。1材料和方法1.1材料 大鼠空肠上皮细胞系(intestinal epithelium cell line no.6, iec 6 )由本所罗庆良研究员惠赠。il 11粉剂购于杭州九 源基因公司。兔抗磷酸化jak1为cell signaling

9、technology公司产 品。hrp标记的山羊抗兔igg、兔抗卩actin.兔抗bax及兔抗 bel 2为santa cruz公司产品。bca蛋白浓度测定试剂盒和 western发光底物试剂盒为pierce公司产品。预染蛋白标志物为new england biolab 产品。凝胶迁移分析（electrophoretic mobility shift assay, emsa ）试剂盒为promega公司产品，stat3特异结合序列 由上海生工合成，y 32p atp购自北京福瑞生物公司。sp免疫 组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2方法1.2.1细胞培养及il 11处理细胞分为正

10、常对照组 （control x中子照射组（n ' 照前il "预处理组（b"）和 照射后il "处理组（ah）o iec 6细胞接种在含100ml/l胎 牛血清的高糖型dmem培养液中，贴壁后将血清浓度降至25 ml/l 继续培养24 h,随后在照前il "预处理组细胞培养液中加入100 pg/l的il 11, il "预处理12 h后照射。照射后il “处理 组于照射后即刻加入il 11o1.2.2动物分组及il “治疗94只雄性balb/c小鼠（18 22 g ）随机分为正常对照组（24只x 照射组（40只）和il 11 治疗组（3

11、0只） il 11治疗组于照射后即刻给予600 |jg/kg的il11, 1 次/d,连用 3d。1.2.3中子照射方法中子（其中混有10%的丫射线）照射剂量 率39.69 cgy/min,平均能量5.0 mev,吸收剂量为4 gy。1.2.4动物活杀及肠道病理检查 于照射后6 h、1 d. 2 d和3d活杀照射和正常组动物，il "治疗组照射后3d开始活杀。取 空肠固定于40 g/l甲醛（以pbs稀释）中，石蜡包埋，切片，he染 色观察病理形态改变。1.2.5 jak1激酶磷酸化活化的western blot检测 分别于照射后5、10.15和30 min收集细胞，加入裂解液冰浴40

12、 min, 12 000r/min离心15 min,收集上清即为细胞总蛋白。bca蛋白浓度测定试 剂盒测定蛋白浓度后，将蛋白进行sds page电泳分离，并转移 至硝酸纤维素膜上，预染蛋白标志物指示条带位置。蛋白western blot的一抗分别为兔抗磷酸化的jak1( 1:1 000 )和兔抗0 actin( 1: 1 000 ),二抗为hrp标记的山羊抗兔igg ( 1:5 000 蛋白条带应 用ecl发光试剂盒显影。设b actin作为内参照。1.2.6 stat3转录因子活性的emsa分析 按照试剂盒说明进行 o stat3 寡核昔酸序列为 5gatccttctgggaattcctag

13、atc3 t4多聚核酸酶将丫32p标记在双链寡核昔酸上，每个反应体系中加入1 pl标记的寡核 昔酸探针。将反应复合物加在40 ml/l甘油凝胶电泳分离，之后压片, -70°c曝光12 h后显影。实验同时设置对照，对其序列结合进行特异性检验。1.2.7小鼠肠道bax和bel2表达的免疫组织化学检测 切片脱蜡后经30 ml/l过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，微波抗原修复,山羊血清封闭。bax、bel2抗工作液浓度为1:100,生物素标记的山羊抗兔igg及hrp标记链亲和素均为1:200, dab显色，苏 木素复染细胞核。pbs代替一抗作阴性对照。阳性结果呈棕黄色。1.2.8图像分析及统计学

14、处理对免疫组织化学和western blot结果，应用cmias ii图像分析仪分别进行平均光密度(mean optical density, mod )测定和定量分析。数据以x±s表示，经 spss11.0统计软件进行单因素方差分析，excel软件作图。p0.05表 示有统计学意义。2结果2.1 il “对中子辐射小鼠肠道损伤的影响从肠道宏观改变 看，4.0 gy照射组及il 11治疗组动物无明显差别，均表现为：肠 道呈黄色，肠壁菲薄可透光，黏膜皱襲消失，肠腔大量渗出液，肠壁 淋巴结难以寻见，全肠长度明显缩短；但在照射后2 d时，中子照射 组和il 11治疗组腹泻发生率分别为53.

15、3% ( 16/30 )和43.3% (13/30 )，显示il 11治疗有降低其腹泻发生率的趋势。镜下见4.0 g y中子照射后3d内，肠道尤其空肠损伤进行性加重，镜下可见 肠黏膜大面积坏死脱落，绒毛上皮细胞数量减少、排列紊乱，隐窝细 胞数量急剧减少等(图1a ); il 11治疗组隐窝上皮细胞较丰富，存 活隐窝数量多(图1b ),表明il 11对肠上皮细胞具有一定保护 作用。图1中子照射后3d小鼠空肠病理检查(略)fig 1 histological changes of the murine small intestine at 3 d after neutron irradiation

16、a: 3 d after neutron irradiation(x200); b: 3 d after neutron irradiation and il 11 administration(x400).2.2 iec 6细胞中磷酸化jakl表达的改变 western blot结果显示，正常iec 6细胞中，jakl具有弱磷酸化水平，照射后5 min,其活性几乎消失，而照前和照后应用il “组，无明显下降，且与照射后10和15 min,磷酸化水平升高，于10 min达高峰,30 min时其活性下降。应用il “组其5 min时活性强于照射组（图2 ' 表明中子照射可引起iec6细胞

17、jak1激酶磷酸化活化减弱，il 11处理可刺激jak1激酶磷酸化活化。图2 il "对4.0 gy中子辐射iec 6细胞jak1活性的影 响(略)fig 2 effect of il 11 on the jak1 tyrosine phosphorylation iniec 6 after 4.0 gy neutron irradiation with (+) or without (-) il11 treatmentap0.05 vs control group; cp0.05 vs neutron group.2.3 iec6细胞中stat3转录因子活性的变化 正常iec6细胞

18、中存在活化的stat3,形成强阻滞条带，中子照射后30 min,其阻滞条带变化不明显，照射后1 h,其活性明显减弱，基本上无阻 滞形成。在照射后施加il "，于15 min和30 min均可形成强阻 滞，且其活化可维持至照射后1 h （图3 l这表明，在中子辐射iec6细胞损伤时，il 11刺激可引起stat3活化。图3emsa法检测il 11对中子辐射后iec 6细胞核提取物中stat3活化的影响（略）fig 3 emsa analysis for stat3 activation using nuclear extracts of iec 6 after neutron irra

19、diation with (+) or without (-)il 11 treatmenta: analysis of sequence specific dna binding of stat3; 1: negative control; 2: positive control; 3: specific competitor reaction; 4: nonspecific competitor reaction. b: effect of il 11 on stat3 activation in iec 6 after neutron irradiation.2.4 il 11对小鼠空肠

20、bax表达的影响bax于正常肠绒毛及 隐窝上皮细胞呈弱阳性表达，中子照射后6 h3 d, bax表达持续增 加，3d时呈强阳性，阳性部位见于肠绒毛及隐窝上皮细胞质，以绒毛 为著。il "治疗组在照射后3d时，bax表达呈阳性，强度弱于照 射组。定量分析结果见表1o表明il 11可下调中子辐射后肠上皮 细胞bax的表达。2.5 il 11对小鼠空肠bel 2表达的影响bel 2于正常肠 绒毛及隐窝上皮细胞质呈微弱阳性表达，中子照射后6 h3 d, bel2表达无明显改变。il "治疗3 d后，bel 2表达明显增加。定量分析结果见表2o表明il 11可增加中子辐射后肠上皮细胞

21、bel 2的表达。11对中子照射后小鼠空肠bax表达的影响（略）tab 1 effect of il 11 on the expression of bax in the murinesmall intestine after neutron irradiation ( modx10-1)ap0.05 vs control group; cp0.05 vs neutron group. means no datum.表2 il 11对中子照射后小鼠空肠bel 2表达的影响(略)tab 2 effect of il 11 on the expression of bel 2 in the mur

22、ine small intestine after neutron irradiation ( modx10-1) ap0.05 vs control group; cp0.05 vs neutron group means no datum.3讨论放射性肠道损伤尤其是中子辐射所致的肠道损伤的防治, 目前仍然是困扰世界的难题。究其原因，主要是因为其致伤的机制尚 未完全阐明。本课题组尝试应用il 11于中子辐射肠上皮损伤的防治，发现il 11可抑制凋亡，并促进损伤后细胞增殖3 但il11发挥防护作用的机制如何，目前尚不明确。il 11通过与其受体结合后，在细胞内诱导的参与细胞增殖与损伤修复的主要

23、信号通路 之一为jak/stat信号通路1 本研究中，我们发现中子辐射后，肠 上皮内jak/stat信号通路活化受到抑制，而il 11则可激活该通路。有关jak/stat通路在肠道中的病理生理意义，既往通过一些基 因突变动物模型的研究发现5, 6 , il 11受体基因敲入突变删除 全部stat结合位点的小鼠会自发地患上肠溃疡，且上皮损伤修复能 力减弱，应用dss （磺琥辛酯钠）诱导急性肠上皮损伤时，与野生型 小鼠比较，基因突变小鼠的肠道病变更复杂、肠上皮腐蚀程度更重 且存活率低。而转录因子stat3下游许多靶基因都与细胞的增殖和 凋亡密切相关，其中bel 2和bel xl也受到stat3调控

24、，因此stat3在调节肠上皮细胞增殖、损伤后存活、凋亡及炎症反应在内的多种过程中具有重要作用7, 8 过控制细胞核内外物质的运输和抑制ca2+的释放或阻断细胞内过氧 化物的堆积而发挥抗凋亡作用。而bax作为bel 2的同源体，其作 用是抑制bel 2作用。bax与bel 2在细胞中的比例决定细胞是否发生凋亡。bax过量时，形成bax bax同二聚体，诱导细胞凋 亡bel 2过量时，形成bel 2 bax异二聚体，抑制细胞凋亡 4 o我们的研究也发现，il 11诱导jak/stat通路活化后，对其 下游凋亡靶蛋白bel2和bax也有影响，il 11可通过上调bel2的表达并抑制bax的表达水平，

25、从而发挥肠道保护作用。总之，il 11诱导的jak/stat信号通路在调节肠道病理生理过程中十分重要。但其在放射性肠道损伤中的变化及意义目前尚 未见报道。本研究结果表明中子辐射后，肠上皮jak/stat通路活化 受到抑制，bax表达过量，诱导肠上皮细胞发生凋亡；而il “则可 通过激活jak/stat通路，上调bel 2同时下调bax的表达 起到 一定的抗凋亡作用，并有助于肠隐窝再生，从而对肠上皮细胞起到放 射保护作用。本研究为il 11应用于临床放射病人的治疗提供了新的依据，也为放射性肠道损伤的防治提供了一条新的思路。【参考文献】1 kiessling s, muller newen g,

26、leeb sn, et al.functional expression of the interleukin11 receptor alphachain and evidence of antiapoptotic effects in human colonic epithelial cells j j biol chem, 2004, 279(11): 10304-10315.2 venkova k, keith jc jr, greenwood van meerveld b. oral treatment with recombinant human interleukin 11 imp

27、roves mucosal transport in the colon of human leukocyte antigen b27 transgenic rats j j pharmacol exp ther, 2004, 308(1):206-213.3 wang rj, peng ry, fu kf, et al. effect of recombinant human interleukin 11 on expressions of interleukin11 receptor a chain and glycoprotein 130 in intestinal epithelium ce