【精品】PCR技术详细步骤-从RNA抽提到电泳鉴定

1、pcr技术详细步骤一从rna抽提到电泳鉴定（2010-04-21 21:16:04）转载标签： 分类：须一技之长，专业杂谈rna抽提一，准备工作1, 实验器具与材料：（1）移液枪:lml、200ul、10ul（2）吸头：lml、200ul、20ul（3）吸头台：放置lml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4）ep 管 1.5ml、looul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）盐水瓶:100ml（8）15ml塑料管一个（配75%乙醇用）2, 实验器具的处理与准备（1）塑料制品：（包括吸头、ep管等）将赠料制品逐个浸泡于1%°depc水屮（必要时小枪头需要用吸管

2、打入depc水）37°c过夜， 然后送至高压3次，后在80°c烘烤箱中烘干（或置于37°c中8小时左右烘干），试验前将枪头 放入吸头台。（2）玻璃制品：（主耍是玻璃研辭器）先泡酸过復，冲洗干净后，在1%odepc水中泡8小时左右，37°c烘干，用蒙锡纸包裹送至干 烤3次。（3）金属制品：（镶了等）先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡depc水）3, 试剂配制和准备：（1）depc水：泡实验器具的depc水的配制:1000ml双蒸水中加lmldepc,放在1000ml容 最瓶屮静置4小时后备用。配75%乙醉的depc水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸

3、水，加 40uldepc, 37°c过夜，送至高压。（2）75%乙醇（要在抽提时现配）:用无水乙醇和depc水配制（depc水:无水乙醇= 1:3）, 然后放于-20°c备川。（3）异丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶（5）trizol： 100ml/瓶 存放于4°c二，抽提时注意事项：全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的-次性的手套接触可疑污染物。三，抽提步骤1. 匀浆化作用取约100mg鼠脑组织放于玻璃研辭器内，先加0.2ml的trizol溶液，研辭组织后，倒入1. 5mlep 管中，再在研磨器内加入0.8ml的trizol溶液洗，后全部再倒入

4、ep管中。颠倒混匀10下， 室温静置5分钟。2. 分离阶段lmltrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样甜管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室 温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。3. rna的沉淀将上层水相转入新的1.5mlep管中（约400-500u1）,加入05ml异丙醇,混匀后放于-20°c中 1小吋，后12000rmp离心10分钟。34. rna的洗脱小心倒掉上清，留取沉淀。加lnil现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤rna沉淀一次，后7500rmp 离心5分钟。5. rna的再溶解小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时rna沉淀变透

5、明）。注意 不能让rna沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的depc水溶解， 在55- 60°c下孵育10分钟助溶。6. rna的保存提取的rna保存于-70°c超低温冰箱中，或立即用丁逆转录。trlzol法抽提总rna细胞1x107组织100mgi加lmltrlzol细胞用lml加样器吹至液体澄清口无细胞团块i匀浆（要彻底，后转至ep管）（组织匀浆量100mg时分装lml/每ep管）i颠倒混匀10 f,室温5分钟i加氯仿1/5体积（0. 2ml）（必须按总体积的1/5）i颠倒混匀15s,室温5分钟i4°c,离心 12000rmp, 15分

6、钟i转上层水相（约400-500 u 1）于另一新1. 5mlep管中i加等体积异丙醇（约400 -500 u 1）,混匀后-20°c中1小时i4°c,离心12000r叩，10分钟i弃上清i加冰预冷的75%乙醇（川高压后的depc水配）1ml4°c离心7500rmp, 5分钟弃上清，超净工作台开风机干燥约30分钟（不能完全干燥）溶于 depc 水中至20 u 1 （10u 1-20 u 1）（可在55-60°c水中,<10分钟助溶）i立即保存于-70°c超低温冰箱中，或立即川于逆转录4逆转录（rt）一，准备工作1, 实验器具与材料：（1）

7、移液枪：200uk 10ul（2）吸头：200uk 20ul（3）ep 管 1. 5ml、looul（4）水浴箱2, 实验器具的处理与准备塑料制品:（包括吸头、ep管等）将塑料制詁逐个浸泡于1%°depc水中（必要时小枪头需要用吸管打入depc水）37°c过枚，然后送至高压3次，后在80°c烘烤箱屮烘干（或置丁37°c中8小时左右烘干），试验前将枪头 放入吸头台。3, 试剂配制和准备：（1）depc水：泡实验器具的depc水的配制:1000ml双蒸水中加lmldepc,放在1000ml容 量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的depc水的配制：100ml

8、盐水瓶内装40ml双蒸水， 加40uldepc, 37°c过夜，送至高压,后分装到几个1. 5mlep管中,-20°c中保存备用。（2）rt中所需要的各种试剂（3）引物浓度计算方法：（新合成的引物的稀释）假如终浓度为xum（pmol/ul）加depc水体积（ul） = （0dx33x1000000） / （分子量xx）二，rt时注意事项:为避免rna酶污染，在rt中仍要佩戴一次性手套和口罩。三,rt步骤用ssiii逆转录酚进行rt (20ul体积)1, 准备0. 65ml的ep管2, 冰上操作：在ep管中加入louldepc水，lul引物，lul模板rna, luldntp

9、,短暂离心。3, 65°c水浴5分钟后，立刻0°c冰水浴至少1分钟。4, 短暂离心后,冰上操作：加入4ul 5xfirst-strand buffer, lul 0. 1mdtt, lul rnase inhibitor, lul ssiii逆转录酶。5, 短暂离心6, 50°c水浴60分钟进行逆转录。7, 70°c水浴15分钟灭活逆转录酶8, -20°c保存，或立即进行pcr。用amv逆转录酶进行rt (10ul体积)1, 准备0. 65ml ep 管2, 加入4. 5ul depc 水，lul 引物,lul 模板 rna3, 稍离心，100

10、°c沸水裕lmin4, 加入0. 5uldntp, 2ul 5 xbuffer, lul amv 逆转录酶5, 稍离心，封口膜封口，42°c水浴90°c作rt6, 100°c沸水裕3min灭活amv7, 立即pcr或-20°c保存。5聚合酶链式反应(pcr)二，准备工作8, 实验器具与材料：(1) 移液枪：200ul、10ul(2) 吸头：200ul、20ul(3) 吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个(4) ep 管 1.5ml、100ul2,实验器具的处理与准备 塑料制品：(包括吸头、ep管等)送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。3

11、,试剂配制和准备： 双蒸水：100ml盐水瓶内装40ml蒸饰水，送至高压，后分装到儿个15mlep管中,-20°c 屮保存备用。（2） pcr中所需要的各种试剂三，pcr时注意事项：佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触口 j疑污染物。四，pcr步骤1, 准备100ul ep管2, 依次在管中加入：（50ul反应体系）ddh20 37.5ul x?1 omm dntp lul x?10 x pcr buffer 5ul x?25mm mgcl2 （加之前要摇匀）3ul x?上游引物lul x?下游引物lul x?模板 cdna lul3, 稍离心4, 100°c沸水

12、浴1分钟5, 趁热加入tag酶0. 5ul （冰上操作）6, 再加入50ul液体石蜡封闭7, 1 oooormp离心1分钟8, pcr条件94°c lmin58°c 50sec72°c lmin30sec进行40个循环，然后72°c lomin完后4°c保温。9, 1 oooormp 离心5min10, 将下层水相转入新的0. 65mlep管中,-20°c保存。电泳鉴定一，准备工作1，实验器具与材料：(1) 移液枪：10ul(2) 吸头：20ul(3) 吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个(4) 三角烧瓶：50ml 个(5) 琼

13、脂糖2, 实验器具的处理与准备 塑料制品：(包括吸头等)送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。(2)电泳板及电泳杷：用白來水冲洗干净备用3, 试剂配制和准备：(1)电泳缓冲液(tae)：先配制05mol/l, ph8. 0的edta溶液：将37. 2g edta-na加入160ml蒸馆水中,在搅拌器上剧 烈搅拌。在用naoh调节溶液ph值至& 0 (约需4gnaoh)0用蒸僻水定容至200ml o后送至高 压灭菌。室温保存。再配制50xtae溶液：在400ml蒸憎水中溶解121g tris碱,加入28. 55ml冰乙酸和50ml0. 5ml/l edta溶液，再加蒸镭水定容至500ml

14、,室温保存。(2) 琼脂糖溶液(1.0%)：50xtae溶液取10ml,稀释成500ml,取50ml溶解0. 5g琼脂糖,电炉上煮至沸腾，溶化的琼 脂物冷却至60°c左右时加入10mg/ml eb 5ul,充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的电 泳板中，在室温下放置45min左右后进行电泳。(3) 漠化乙锭(eb) (10mg/ml)：在20ml水中加入0.2g溟化乙锭，磁力搅拌数小时。然后川铝箔包裹容器或将溶液转移至棕 色瓶中，室温保存。(4) 加样缓冲液(loading buffer) 一般为6xloading buffer二，电泳鉴定时注意事项：佩戴一次性手套，避免皮肤接触eb。无路做胶述是电泳缓冲液尽量用新的，不耍超过两周。五，电泳步骤i, 50xtae取10ml稀释成500ml,取50ml溶解0. 5g琼脂糊。电炉上总沸麻加入eb 5ul。 另外450ml