早期脑利钠肽后处理对心肌缺血再灌注损伤和高迁移率族蛋白1表达的影响

1、    早期脑利钠肽后处理对心肌缺血再灌注损伤和高迁移率族蛋白1表达的影响    黄星月 胡钢英 黄婷婷 谢箐 李丹 胡笑容 江洪摘要 目的检测高迁移率族蛋白1（hmgb1）在大鼠心肌中的表达，验证脑利钠肽（bnp）后处理是否能够减少心肌损伤。方法给予麻醉后的大鼠30 min心肌缺血，再灌注前静注bnp15 min，然后再灌注4 h。记录乳酸脱氢酸（ldh）、心肌磷酸激酶（ck），肿瘤坏死因子（tnf），白介素（il6）等指标的变化，通过免疫印迹法评估hmgb1的表达。结果bnp后处理在4 h再灌注后可以显著减少心肌损伤大小和ldh，ck的表达（p<

2、;0.05），明显减少tnf，il6的增长。同时，在心肌损伤中可以明显抑制hmgb1的表达。结论bnp后处理可以通过抑制hmgb1的表达来保护心肌缺血再灌注损伤。关键词：心肌缺血再灌注;脑利鈉肽;后处理;高迁移率族蛋白1中图分类号：r542.2r285.5文献标识码：adoi：10.3969/j.issn.16721349.2015.01.020文章编号：16721349（2015）01005503effect of btype natriuretic peptide postconditioning on myocardial ischemiareperfusionhuang xingyue

3、，hu gangying，huang tingting，xie qing，li dan，hu xiaorong，jiang hongthe peoples hospital，wuhan university，wuhan 430060，hubei，chinacorresponding author：hu xiaorongabstract：objectiveto explore the effect of btype natriuretic peptide （bnp） preconditioning on myocardial ischemiareperfusion （i/r） injury an

4、d the expression of high mobility group box 1 protein （hmgb1） in rats.methodsanesthetized male rats were ischemia for 30 min，and then were treated with bnp in 15 min before reperfusion until the end of reperfusion，and followed by reperfusion for 4 hours. lactate dehydrogenase （ldh），creatine kinase （

5、ck），tumor necrosis factor （tnf），interleukin6（il6） and infarct size were measured. hmgb1 expression was assessed by immunoblotting. resultsthe results showed that treatment of bnp postconditioning could significantly decrease the infarct size and the levels of ldh and ck after 4 h reperfusion （all pk

6、ey words：myocardial ischemia;btype natriuretic peptide;postconditioning;reperfusion;high mobility group box 1 protein高迁移率族蛋白1（high mobility group box1 protein，hmgb1）是一种无染色体核的蛋白质，通常被坏死细胞、凋亡细胞或者被激活的非特异性免疫细胞（如巨噬细胞和单核细胞）抵抗性的大量释放1，2。 在一些心血管疾病中，hmgb1已经被证实是一种新型的促炎性细胞因子36。最近的研究显示hmgb1作为一种早期促炎性细胞因子在心肌缺血再灌注过程

7、中持续存在，与传统的早期促炎性细胞因子例如肿瘤坏死因子（tnf）和白介素6（il6）一样，而且还能够促进tnf和il6的释放。然而，hmgb1 a box 缩氨酸（一种特殊的hmgb1拮抗物）可以减少心肌缺血再灌注损伤并抑制tnf和il6的释放3。炎症反应被认为是心肌缺血再灌注损伤的关键因素7，8。b型钠尿肽（bnp）的预处理和后处理能够减少心hmgb1在心肌缺血再灌注损伤中有着重要的影响。肌缺血再灌注损伤，包括减少心肌酶的增加、梗死面积和细胞凋亡912。本研究通过大鼠心肌缺血再灌注模型，来验证bnp后处理是否可以通过抑制炎症反应（包括hmgb1的表达）来减少心肌缺血再灌注损伤的假设。1材料与

8、方法1.1动物准备和实验设计spf级雄性sd大鼠（250 g300 g），随机分成3组。假手术组（so）10只：只开胸，不结扎冠状动脉;缺血再灌组（i/r）15只：结扎冠状动脉左前降支（lad）30 min，再灌注4 h;脑利钠肽后处理组（bnp  i/r）15只：结扎冠状动脉左前降支（lad）30 in，再灌注4 。在再灌注前15 min给大鼠输入溶解于无菌盐水中的bnp 0.03 g/（kg·min）11静脉恒速维持至再灌注结束。用3%戊巴比妥钠（45 g/kg）腹腔麻醉大鼠，后背位固定，气管插管连接动物呼吸机，频率70次/min，潮气量（34）ml/100 g，连接心

9、电图机，持续记录心电图变化。紧靠胸骨正中于左側第23肋间打开胸腔，暴露心脏，剪开心包膜，于左心耳与肺动脉圆锥之间，用穿有50缝合线的3/8弯针钩绕lad，下垫一带凹槽的细小塑料管，待心电图恢复稳定后连同细管一起结扎，以结扎后心电图导联st段明显上抬及心脏表面相应区域发绀和苍白表明缺血成功;30 min后沿凹槽剪断结扎线，以st段下降1/2以上、心脏表面缺血区发绀和苍白恢复表明心肌组织成功恢复再灌注。1.2梗死面积评估再灌注4 h后，经股静脉注入1%依文思蓝2 ml，冰pbs液冲洗之后，立即置于-20冰箱中冷冻15 min，垂直心脏左心室长轴将每个心脏切成厚（12） mm 5个薄片，置入1%2，

10、3，5氯化三苯基四氮唑溶液（ttc溶液，浓度为0.1 mol/l的磷酸盐缓冲液pbs，ph7.4）中，37 避光恒温孵育15 min。非缺血区为蓝色。缺血区内的非梗死区心肌组织含有的脱氢酶将无色氧化型染料ttc还原成砖红色，而梗死区心肌细胞由于细胞膜损伤，脱氢酶漏出，不能将ttc还原，因此为灰白色。孵育结束后，取出心肌组织置于10%甲醛中固定12 h，分离缺血区和梗死区，用天平精确称重，计算梗死区重量与缺血区重量的比值，即梗死面积百分比。1.3心肌损伤评估再灌注4 h结束后，经颈动脉取血2 ml，以3 000 r/min离心15 min，提取上清，按试剂盒说明采用紫外分光光度法测定ck和ldh

11、的活性（中国南京建成生物工程研究所）。1.4tnf和il6的测量在心肌组织上层的tnf和il6，按试剂盒说明应用酶联免疫吸附法进行测量（中国南京建成生物工程研究所）。1.5hmgb1蛋白表达检测左心室的局部缺血样本被冷冻后应用western blot分析hmgb1的蛋白表达量，hmgb1单克隆抗体检测hmgb1蛋白含量13。（santa cruz，usa），用光密度仪扫描分析，以内参gapdh蛋白条带光密度值作为标准，计算hmgb1蛋白表达的相对量。1.6心肌组织mda和sod的检测再灌注4 h结束后，取缺血部分心肌组织按试剂盒说明测定mda和sod的活性，分光计分别测定532 nm 和550

12、 nm时的吸收率。心肌组织匀浆样本中所有蛋白质浓度采用考马斯蓝方法测定（南京建成生物工程研究所）。1.7统计学处理应用spss16.0 软件进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表达。梗死面积比较采用t检验;多组比较采用单因素anvoa或kruskalewallis h检验，两两比较采用studentnewmankeuls检验或mannwhitney u检验。以p<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1梗死面积在4 h再灌注后，与i/r组（52.8±4.4）%相比，bnp后处理组能够明显减少心肌梗死面积（28.9±3.7）%（p<0.0

13、5）。2.2ldh和ck值在4 h再灌注后，i/r组血清中ldh和ck水平明显较so组0.182增加（p<0.05）。而bnp后处理显著抑制缺血再灌注引起的ldh和ck水平增加（p<0.05）。详见表1。2.3tnf和il6值4 h再灌注后，相比so组，所有再灌注组的tnf和il6水平明显增加（p<0.05）。详见表2。2.4hmgb1表达再灌注4 h后，i/r组心肌组织hmgb1表达明显较so组增加（p<0.05）。而bnp后处理组为0.287，显著抑制了缺血再灌注引起的心肌组织hmgb1表达的增加（p<0.05）。2.5mda和sod的表达在4 h的再灌注后，

14、与so组相比，i/r组心肌组织mda表达明显增加，而sod表达明显减少（p<0.05）。bnp后处理显著地抑制了缺血再灌注引起的mda表达增加和sod表达减少（p<0.05）。详见表3。3讨论所有的预处理和后处理在心肌缺血再灌注损伤中都有着保护作用14。本研究发现，bnp后处理可以减少心肌梗死面积和心肌激酶，这也符合以往的研究结果9，10。bnp后处理可以减少tnf，il6和hmgb1的表达。而hmgb1在心肌缺血再灌注时表达增多，且促进tnf和il6的表达，用hmgb1处理过的大鼠心肌缺血再灌注损伤将更严重，而抑制hmgb1的表达可以减少这种损伤并减少tnf和 il6的表达3。h

15、u等13证实hmgb1可以促进细胞凋亡，而细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中的影响至关重要。wu等10报道bnp后处理可以减少心肌细胞凋亡。活性氧可能与hmgb1的释放有关，bnp处理能够抑制氧化应激14，15。tang等16证明活性氧之一的过氧化氢可以促进巨噬细胞和单核细胞释放hmgb1。tsung 等17发现培养肝细胞释放hmgb1依旧是由活性氧控制的。zhang等18发现抗氧化物可抑制hmgb1表达并减少急性重症胰腺炎大鼠的胰腺损伤19，20。因此，抑制活性氧的产生可能抑制hmgb1的表达。sun等12证实bnp可通过抑制活性氧的释放来减少心肌缺血再灌注的损伤。bnp后处理可以通过抑制心肌缺

16、血再灌注引起的活性氧来减少损伤，而活性氧正与hmgb1的表达有某种关系。本研究表明bnp后处理可以通过抑制hmgb1的表达来减少心肌缺血再灌注损伤。参考文献：1scaffidi p，misteli t，bianchi me.release of chromatin protein hmgb1 by necrotic cells triggers inflammationj.nature，2002，418：191195.2bell cw，jiang w，reich cf，et al.the extracellular release of hmgb1 during apoptotic cell

17、deathj.am j physiol cell physiol，2006，291：c13181325.3andrassy m，volz hc，igwe jc，et al.highmobility group box1 in ischemiareperfusion injury of the heartj.circulation，2008，117：32163226.4hu x，jiang h，bai q，et al.increased serum hmgb1 is related to the severity of coronary artery stenosisj.clin chim ac

18、ta，2009，406：139142.5andrassy m，volz hc，riedle n，et al.hmgb1 as a predictor of infarct transmurality and functional recovery in patients with myocardial infarctionj.j intern med，2011，270：245253.6hu x，zhou w，bai q，et al.increased serum high mobility group box 1 protein in patients with atrial fibrilla

19、tionj.biomed aging pathol，2011，1：5255.7frangoginis ng，smith cw，entman ml.the inflammatory response in myocardial infarctionj.cardiovasc res，2002，53：3147.8hu x，fu w，jiang h.hmgb1：a potential therapeutic target for myocardial ischemia and reperfusion injuryj.int j cardiol，2012，155：489489.9burley ds，ba

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