乳清中酪蛋白糖巨肽的制备及纯化研究

1、乳清中酪蛋白糖巨肽的制备及纯化研究徐静波孟祥河i叶欧,，缪莉s孙培龙i张建友“(1.浙江工业大学生物与环境工程学院浙江杭卅310032 2.中国检程认迄集团浙江有限公司310006)摘要：酪蛋白糖巨肽(cgmp)具有许多的生理活桂功能和独将的营养特性，可广近应用于保健食 岛和医药品.本文研究了凝乳晦对酪妥白的最住酶解条件，确定了其最佳酶解参数为：醉解温 度5(tc, ph6.5, e/s=3%,酶解时间90min.酶解后通过i2%tca沉淀法得到绘度为853% 的cgmp关键词：酪蛋白糖巨肽(cgmp);制备；纯化中图分类号：ts201.2文献标识码：bpreparation and puri

2、fication of casein glycomacropeptide (cgmp)from wheyxu jing-bo, meng xiang-he. ye ou. sun pei-long. zhang jian-you*(the college of biological and environmental engineering,. zhejiang university of technoiogy*hangzhou 310032)miao li(china certification & inspection group zhejiang co.,ltd.)abstrac

3、t: casein glycomacropeptide is a kind of peptide which has lots of biological functions , mainly derived from k«casein hydrolyzed by rennet. the optimum hydrolysis conditions of casein by rennet were confirmed: temperature50*c, ph6.5, enzyme concentration 0.03 per gram of substrate, the hydroly

4、sis time is 90 min. tca precipitation method was used to purity and the purity of cgmp produced by this method was 85.25%key words: casein glycomacropeptide; preparation; purification0前言酩蛋白糖巨ftt(cgmp)主要是k屈蛋白经凝乳酶降解产生的一类含有糖链的多肽，具有 许多的生理活性和独特的营养特性。cgmp是具有工业化潜力的蛋白质来源。它独特的酸性条件下的热稳定性和可溶性预示 了它在食品加工中的应用前景。另

5、外，它在生物和营养方面的功能为其规模生产提供了广阔 的市场。目前国内外甜乳清蛋白质量不高.主要是由于cgmp对乳清蛋白凝胶性和吸水性的 致命彫响，从乳清蛋白中将cgmp提取出来后.改善了乳清蛋白的功能性质，扩大了乳清蛋 白的应用范围，同时获得高附加值的功能性营养添加剂一cgmp,为乳品工业提供新的增长 点.随着干酪产量的增加，乳清产量持续增长.大力开发乳品中的cgmp,不仅提高了乳资 源的综合利用水平，而且为保健食品以及医药品理供了一种全新的功能性材料12切.目前国内对cgmp的研究不多，主要是因为其分离过程繁琐、纯化困难，难于工业化 生产.本文采用凝乳酶酶解，tca沉淀得到一定纯度的cgmp

6、,方法简单，易于操作.1材料与方法1.1试剂与仪器脱脂乳粉（光明乳业股份有限公司），凝乳酶.酪蛋白酸钠（丹尼斯克有限公司），lmol/l hcl 0mol/l hci. 0.1mol/l naoh, 50%tca溶况唾液酸测定试剂盒（南京建成生物工 程公司）ph计，数显恒温水浴箱，dsx-280b型高温高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂，l535r 型离心机，紫外分光光度计12凝乳酶活力测定方法脱脂乳粉9g溶于100ml水中，并用lmol/l hc1调轅ph至6.4,取凝乳酶0.5g溶于50ml 灭菌蒸镭水中，制成凝乳酶稀禅液，35c下保温30min.吸取复原脱脂乳10e于试管中， 35匸下保温3

7、0min.吸取lml凝乳酶稀释液加入脱脂乳中，搅匀，35_c保温，测定复原脱脂 乳出现初凝所需时间。凝乳酶活力（u）=2400/凝乳时间x酶的稀释倍数x复原脱脂乳®（ml）/凝乳酶忝加量 （ml）"1.3酪蛋白的水解工艺流程3%酪蛋白溶液-调ph-定温度下加酶水解-保持ph不变-灭酶活-测唾液酸含量 -根据唾液酸含量确定最佳水解条件凹1.4酪蛋白最佳酶解条件方法取20mi3%酪蛋白于50ml小烧杯中，在恒温水浴中搅拌，达到酶解温度后，用0.1mol/l hc1和0.1mol/l naoh调ph,加入一定量的酶液.在反应过思中不断搅拌并维持ph恒定 不变.反应到终点，停止搅拌

8、，置于沸水浴中i5min灭薛活，冷却待用卩忙1.5水解程度测定：采用唾液酸试剂盒测定.唾液酸（sa）仅存在于cgmp中，根据水解得到的唾液酸含世多少即可确定水解生成的 cgmp的量.在氧化剂存在的情况下唾液酸与5 -甲基苯二酚形成紫红色络合物，吸光度 符合比色定律，通过测定络合物吸光度与标准即可计算出唾液酸的含« 1喷液酸试剂盒测定水解度标淮管空白皆样品（ml）0lmmol/lsa标准(ml)o.i蒸憶水（ml）0.1迖刑-(ml)0.20.20.2试剂二显色刑（ml）4.04.04.0混匀100度水浴（或开盖煮沸）i5min,流水冷却后，3000-3500r/min离心10mim取

9、 上清，560nm波长，1cm光径，空白管或蒸馆水调零读取各管吸光度。sa （mmol/l）=（测定管吸光度/标准管吸光度）x标准液浓度（mmol/l）1.6 cgmp的纯化方法在最佳酚解条件下酶解3%酩蛋白洛液，用0.1mol/l hc1调酶解液ph至4.6以沉淀未 反应的酪蛋白，4900r/min离心15min,取上清液，加入50%tca溶液使tca的终浓度达到 12%, 4900r/min 离心 15min» 取上清1.7cgmp纯度测定分别在210nm和280nm处测纯化后cgmp的吸光度。cgmp 纯度=(od2io-od2myod210x 100%p,2结果与讨论2凝乳酶

10、活性测定结果测得复原脱脂乳出现初凝的时间为tl=308s.t2=323s取平均时间t=315.5s凝乳酶活力(u)=2400/凝乳时间(s)x酶的稀释倍数x复原脱脂乳童(ml)/凝乳酶添加量(ml) =2400/315.5x100x10/k606.97u2.2酪蛋白最佳酶解条件确定2.2.1单因素实验221.1 ph对水解程度影响酶解条件:温度40*c,酶解时间30mim酶和底物比(e/s)=l%.以唾裁酸含量为指标， 560nm处吸光度见表2。表2不同ph值下水解时所得唾液酸*ph5.56.06.57.00.134.0.1360.144.0.1440.167.0.1690.125.0.125

11、平均odo0.1350.1440.1680.125s (mmol/l)3.553.794.423.29(注:测得标准管0d560p.038)在酪蛋白水解过程中，ph对酶水解反应的影响主要有如下儿种原因造成，(1) ph变 化引起酶构象的改变，从而使酶活性丧失；(2) ph影响了底物的解离状态，使底物不能与 酶结合或结合后无法生成产物；(3) ph影响酶分子活性部位上有关基团的解离，从而影响 酶与底物的结合，使酶活性降低；(4) ph可能影响中间络合物的解离状态，不利于催化生 成产物。从表2中可以看出，ph=6.5时，酶解液中唾液酸含撥最多，得到的cgmp也最多.因 此，选择ph6.5为宜.2.

12、2.1.2酶和底物比(e/s)对水解程度的影响酶解条件：温度40*c,醉解时间3omin,ph省.5«3不同ew下水解師得唾液酸es讥2%3%4%od血0 12801300.14001)80.155,0.1550.137.0.139平均odjw0.1290.1390.1550.138sa (nwnol/l)3393.664.083.63从表3甲可以看出，&s在i%-3%时.唾液酸含輦随e/s瑠入而缗多，但是当e0增犬 到4%时，唾液酸含量减少了，这可能是由于随酶量的增多.水解进一步进行，使得生成的cgmp水解为更小的肽甚至氨基酸，cgmp减少了，与它结合的唾液酸的遂因而也减少

13、了. 所以选择e/s=3%为宜。2.2.1.3温度对水解程度的彫响酶解条件:酶解时间30min, ph=6.5, e/s=3%表4不同温度下水解所得蹟液酸量t£()c40 r5<tc6orodsao0j 0&0080.109,0.1110.140,0.1420050105平均od*）0.1080.1100j410.105sa (mmol/l)2.842.893.712.76温度对酪蛋白水解反应速度的影响分析如下：（1）在低温段酶活力较小，酶水解速度较 低；（2）在适宜温度下，有利于酪蛋白折叠结构的舒展（解聚），肽键更易与酶结合，酶水解 速度加快；（3）随着温度继续升高，

14、酶蛋白变性失活，酶水解速度降低从表4中可以看出, 选择温度为50c为宜。2.2.1.4水解时间对水解程度的影响酶解条件：ph=6.5, e/s=l%,温度50p表5不同水解时间所得履液酸量l30min60min90minl20minod$600.065,0.0700.080.0.080000.0.102005,0.105平均odseo0.0680.0800.1010.105sa (mmol/l)1.791112.662.76从表5中可以看出，水解程度随水解时间的延长不断升高，但反应趋势不同。在90min 内水解程度升离较大，这是因为最初水解时，酶主要作用的肽键数目最多，随水解进行，较 多肽键被

15、断开，水解底物中肽键数减少，水解程度增加趋势减缓，但仍呈上升趋势。90min 后，唾液酸含量增加很少，从节约时间角度考虑，把水解时间定在90min为宜。2.2.2正交实验2.2.2.1因素水平表根据实验条件，采用l9 （34）正交实验，实验因素和水平的选择如表6所示。«6 l9（34）正交实验设计表因素水平e/saph bt ( c) ci (min)d12%6.0407023%6.5509034%7.060i!0222.2正交实验结果与分析表7正交实验结果试验号abcdods60sa (mmol/l)111110.197584212220.2687.0533i3330664.368

16、421230.2486.526522310.2286.000623120.195 5.13273i320.1874.921832i30.2265.947933210.2055395ki16.60516.63216.26316.579k217.65819.00018.97417.105k316.26314.89515.28916.842ki5.5355.5445.4215.526k25.88663336.3255.702k35.4214.9655.0965.614r0.46513681.2280.175优水平a2b2c2d2由极差分析比较即b>c>a>d可以看出：因素对凝乳酶水

17、解餡蛋白得戲cgmp的影响 次序是bcad,即ph值对水解程度影响聂大，其次是水解温度、酶和底物比和水解时间。 根据ki、k2、k3确定各因素的最优水平组合为a2b2c2d2。即得到cgmp的最佳水解条 件为：ph65,水解温度为50*c,水解时间为90min,酶和底物比(e/s)3%,此时水解得到的 cgmp*最多。2.223验证实验在最优实验条件下，即ph65,水解温度为50*c,水解时间为90min,酶和底物比(e/s)3% 时进行验证实验。验证实验结果表明：在最优条件下，测得od560p.283,唾液酸含量sa (mmoi/l)- (测定管吸光度/标准管吸光度)x标准液浓度(mmol/

18、l) =0.283/0.038x1=7,447.该结果比 正交实验中任一水平组合得到的唾液酸量都大。因此可以判断a2b2c2d2是得到cgmp的 最佳水解条件。2.3 cgmp纯度测定结果210nm280nmod任0.9290.137cgmp 纯度=(od2io-od28oyod21ox 100%= (0.929-0.137) /0.929"00%=8525%3结论本实验以酪蛋白酸钠为原料.采用凝乳酶酶解，12%tca沉淀法分离、纯化cgmp, 得到如下结论： 凝乳酶活力为7606.97 v；(2) 凝乳酶酶解酩蛋白得到cgmp的最佳水解条件为：ph6.5,水解温度50p,水解时 间

19、90min.酶和底物比(e/s)3%。此时得到的酶解液中唾液酸含董为sa(mmol/l)=7.447。(3) 采用12%tca沉淀法纯化cgmp,得到cgmp纯度约为85.25%。参考文ik【1吴鼻酪蛋白巨肽的生物特性及应用前景几食品研究与开发.200324 (4) ： 411韩婷乳清蛋白的营养特点和作用几肠外与肠内营养.2005,12 (4) : 243-246李海平，程涛尊乳源糖巨肽的生物活性“中国乳品工业.200230 (5) i 74-774吴*酪蛋白績巨肽(cgmp)的制备方法及生化特性研究天津商学院硕士学位论文.2004王专，易华西等乳酸蛋白源生物活性肽的研究进展(jj.生物信息学

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