(完整版)2.2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、co(nhco(nh2 2) )2 2 + h + h2 2o coo co2 2 + + 2nh2nh3 3细菌脲酶细菌脲酶（1）将土壤中的固氮菌分离出来（2）将土壤中自养微生物分离出来举一反三（3）筛选出抗青霉素的微生物（4）筛选出耐高浓度食盐的微生物允许允许特定种类特定种类的微生物生长，同时的微生物生长，同时抑制或阻止抑制或阻止其他种类其他种类微生物生长的培养基，叫做微生物生长的培养基，叫做选择培养基选择培养基尿素尿素尿素尿素1、利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物只是一种细菌吗？都是能分解尿素的微生物吗？思考：思考： 不是，有多种。不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产

2、物进行生长繁殖。因此，还需借助生物化学方法对分离的细菌作进一步的鉴定。2、请你提供一种方法，判断分解尿素的细菌确实能将尿素分解成氨。思考：思考： 方法：在以尿素作为唯一氮源的培养基中加入酚酞指示剂,接种培养该细菌，若指示剂变红，说明该种菌分解了尿素。以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是. .统计菌落数目：统计菌落数目：1.1.显微镜直接计数法

3、：显微镜直接计数法：这种方法是利用特定这种方法是利用特定细菌计细菌计数板或血细胞计数板数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。中微生物的数量。此法的缺点是不能区分死菌和活菌。此法的缺点是不能区分死菌和活菌。在设计实验时，一定在设计实验时，一定要涂布至少要涂布至少3 3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性与准确性。在分析实验结果时，。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需

4、要重新实验重新实验。 除上述两种常用的计数方法外，还有除上述两种常用的计数方法外，还有膜过膜过滤法、比浊法滤法、比浊法。膜过滤法是当样品中菌数很低。膜过滤法是当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上( (或或一定面积中一定面积中) )的细菌数；比浊法原理是在一定范的细菌数；比浊法原理是在一定范围内，菌的悬液中细胞浓度与混浊度成正比，围内，菌的悬液中细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正

5、比，菌越多，光密度越大。因即与光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借助于分光光度计，在一定波长下，测此可以借助于分光光度计，在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度表示菌量。实验定菌悬液的光密度，以光密度表示菌量。实验测量时一定要控制在菌浓度与光密度成正比的测量时一定要控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。微生物计数法，发线性范围内，否则不准确。微生物计数法，发展迅速，现有多种多样的快速、简易、自动化展迅速，现有多种多样的快速、简易、自动化的仪器和装置等方法。的仪器和装置等方法。 计算公式：计算公式：每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数=（cv）m某同学在稀释倍数为106

6、的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()a.2.34108b.2.34109c.234d.23.4b（三）设置对照（三）设置对照判断培养基中是否有杂菌污染：判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（营养成分齐全）接种后培养完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。观察菌落数目。主要目的是排除实验组中非测试因素对实验主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。结果的影

7、响，提高实验结果的可信度。从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为稀释倍数为103107。准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基。选择培养基。每个稀释每个稀释度下需要度

8、下需要3个选择培养基，个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。还个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要需要8个灭菌试管和个灭菌试管和1个灭菌移液管个灭菌移液管。将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显生长的菌落数目应明显多于多于选择培养基上的数目，因此，选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了基是否起到了选择选择作用。作用。问题：问题：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能

9、分释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。质地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。质地等等，都是区分细菌的重要手段。 1 1、取土用的小铁铲的盛土样的

10、信封在使用前都需要灭菌。、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。形瓶中，塞好棉塞。3 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。注明培养基种类、培养日期、平板培养样品注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。的稀释度等。 三、操作提示三、操作提示鉴定：筛选后必鉴定鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：不影响微生物鉴别培养基：不影响微生物的生存的生存 酚红培养基：酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌鉴定分解尿

11、素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分原理：脲酶催化尿素分解成氨解成氨培养基碱性增强培养基碱性增强 酚红变红酚红变红脲酶阳性脲酶阳性1.1.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（ ） a.a.培养细菌培养细菌 b.b.培养真菌培养真菌 c.c.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 d.d.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( )( ) a.coa.co2 2和和n n2 2 b. b.葡萄糖和葡萄糖和nhnh3 3 c.coc.co2 2和尿

12、素和尿素 d.d.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素c cd d3.3.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（ ）a.a.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的taqdnataqdna聚聚 合酶。合酶。b.b.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为m1m1、m2m2、 m3m3、m4m4、m5m5，以，以m3m3作为该样品菌落数的估计值。作为该样品菌落数的估计值。c.c.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验

13、结果的可信度 d.d.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。4.4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）加入（） a.a.较多的氮源物质较多的氮源物质 b.b.较多的碳源物质较多的碳源物质 c.c.青霉素类药物青霉素类药物 d.d.高浓度食盐高浓度食盐b bc c 5、实验测定链霉素对、实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用种细菌的抗生素效应，用3种细种细菌在事先准备好的琼脂块平板上画菌在事先准备好的琼脂块平板上画3条等长的平行线（条等长的平行线（3条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于37条条件