人突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

1、人突变型低氧诱导因子1«腺病毒载体的构建及鉴定作者：郭寿贵，吴平牛，王月刚，傅锐斌【关键词】腺病毒construct!onandi denti fi cati onofhumannmtanthypoxiai nducib lefactorla adenovirusvector【abstract】aim:toconstruetadenovirusvectorcontainingthemutanlhiflageneandtostudytheeffectofmutanthypoxiainduciblefactorlaontheangiogenesisofcoronaryheartdisea

2、se methods:humanmutanth if1 a cdnaobtainedfromtheplasmidpcdna3. 1(+)hif1 a wasclonedintoplasmidpshuttle2. theexpressioncassettecontainin gmutanthiflacdnawasobtainedfromtherecombi nantpshuttle2withdoubledi gesti o nofpiscelandlceuiandthenligatedtoadenoxviraldnawithinvitroli gation. therecombinantaden

3、oviralplasmidwasidentifiedandtransf ectedintotheadenoviralpackagingcellhek293bylipofectamine2000 mediatedgenetransfermethodtopackthevirus therecombinantadeno vi uswasconfi rmedbypolymerasechainreacti on(pcr)andtheti terwasdetermined results:therecombinantpadenohiflwascorrectlyconstructedandconfirmed

4、byrestrictionendonuclease analysisanddnasequencinganalysis. thetransfectedhek293cel1swe relysedbyfreezethawingtoobtaintherecombinantadenovirusinthel ysate thepcrproductofthelysateconfirmedthepresenceofrecombin antadenovirustheviraltiterwas2 x 1012p f u /l. conclusion:therecombinantadenoviruscontaini

5、ngthemutanthif 1 a genehasbeensuccessfullyconstrueted, whichpavesthewayformutant htf1 a genetherapyofcoronaryheartdisease a ;mutant;adenovirusvectot;genetherapykeywordshypoxiainduciblefactorl【摘要】口的:构建人突变型低氧诱导因子1 (htf1) a腺病毒表达载体，研究人突变型hif1 a基因对冠心病的血管新生作用方法:采用 分子克隆技术，rflpcdna3. l(+)hifla (突变型)质粒获得突变型h

6、if1 a cdna,克隆到穿梭质粒pshuttle2,以plscel和iceui双酶切重组 穿梭质粒，获得含有突变型hif1 a cdna的表达盒，通过体外连接法与 线性化的腺病毒骨架质粒adenoxviraldna连接，重组成padenohtfl a腺病毒质粒，经酶切及测序鉴定正确后，在iiek293细胞中包装成为 重组adenohifl a腺病毒，并进行pcr鉴立及滴度测定结果:经酶切 鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功，包装后冻融细胞的上 清pcr检测重组腺病毒包装成功，病毒滴度为2x1012pfu/l.结论:成 功构建重组腺病毒adenohifl a (突变型)，为冠心病的突变

7、型hif1 q基因治疗研究奠定基础.【关键词】低氧诱导因子la ;突变;腺病毒;基因治疗0引言低氧诱导因子1 (hypoxiainducibl efactorl, htf1)是一种在休内 广泛存在的由低氧、钻等诱导细胞产生的具有转录活性的核蛋白，由 q和b亚基组成，在低氧应答反应中起关键性作用，它能与靶基因的 缺氧反应元件(hypoxiaresponseelement, hre)结合调控血管内皮生 长因子(vascularendothe 1 ialgrowthfactor, vegf)等一系列靶基因 的转录，对血管新生等起极其关键的调节作用.htf1 a受低氧诱导，决 定iiif1的活性，然而

8、常氧状态下，其氧依赖降解区 (oxygendependentdegradat iondomain, oddd)内 564 位脯氨酸残基 pro564发生轻基化，迅速被降解为此我们在已定点突变其pro564为 丙氨酸(ala)基础上，构建重组人突变型hifla腺病毒载体，以进 一步研究常氧条件下该突变型基因表达及对冠心病的血管新生作用.1材料和方法1.1材料1. 1. 1试剂、试剂盒各种限制性内切酶pac i , plscel, iceui等 及t4dna连接酶、taqdna聚合酶、xgal分别购自takara, neb等公司； dmem培养基（gibco）,胎牛血清（paa）,转染试剂 lip

9、ofectamine2000（invitrogen）,超纯质粒提取试剂盒（qiagen）.1. 1.2 质粒、 菌株、 细胞系等 adenoxtmadenoviralexpressionsystems（bd. clontech）: 包括有 pshuttle2, pshuttle21az, adenoxtmviraldna 等，重组质粒 pcdna3. 1 （ + ）hif1 a （突变型）（本室构建）,大肠杆菌dh5 a （本室保存）,hek293 细胞（中科院上海细胞所）.1.1. 3引物htf1 a cdna片段引物（由博亚公司设计并合成），上 游引物：5 ' gacacagaag

10、caaagaaccc3 7,下游引物：5 'tcaaagcgacagataacacg37 , pcr 产物片段长 460bp. bd. clontech 所提 供引物（两个引物分别与穿梭质粒表达盒及骨架质粒的部分序列结 合），上游引物:5/ tagtgtggcggaagtgtgatgttgc37 ,下游引物：5 agatctgagctttcgctacc37 , pcr 产物片段长 287bp.12方法1. 2. 1重组穿梭质粒构建以nhe i , apa i双酶切pcdna3. 1 （ + ） hif1 a （突变型，下同）及pshuttle2,胶回收突变型hif1 ci片段及 psh

11、uttle2线性化大片段，连接后转化感受态dh5a ,于卡那霉素抗性 lb平板上筛选单菌落扩增，提取质粒，行酶切及pcr鉴定.1. 2. 2酶切连接法重组腺病毒骨架质粒以piscel iceui双酶切 pshuttle2hifl a ,胶回收含hif1 a的表达盒片段，与线性化的腺病 毒骨架质粒adenoxtmviraldna作连接，转化感受态dh5 a ,氨茉抗性 lb平板筛选，挑1216个单菌落扩增并作菌液pcr鉴定，提取重组腺 病毒质粒padenohifl a ,予xho i酶切鉴定;以piscel iceui双酶 切pshuttle21az ,胶回收含laz基因的表达盒片段，与 ade

12、noxtmviraldna作连接，方法基本同上，但菌落筛选时每个平皿涂 iptglooul及xgal20ul,挑出蓝色菌落，重组质粒称padenolaz.1. 2. 3重组腺病毒包装以含100ml/l胎牛血清的dmem培养iiek293 细胞，转染前一日细胞传代，细胞数（0.51）x106/ （60mm平皿）， 转染时细胞汇合率在70%左右；重组腺病毒质粒padenohifl a约45 u g以pac i线性化，纯化后50 p l灭菌三蒸水重溶，以 lipofectamine2000转染hek293细胞，约10d左右人部分细胞出现细 胞病变效应（cpe）后收集细胞，重悬于pbs500ul, -

13、70°c37°c反 复冻融3次，离心收集上清，此称为病毒原液，-20°c保存同法以padenolaz转染hek293细胞作对照，转染48h后固定细胞,作原位xgal染色，观察转染效率.1. 2. 4病毒扩增、滴度测定及鉴定取上述细胞裂解液250 u l重新 感染在60mm培养皿中培养的hek293细胞，如上待人部分细胞cpe完 全形成后，收集细胞，pbs重悬，冻融细胞，离心收集上清冻存；采 用cpe法(endpointdilutionassay)测定病毒滴度，重组病毒称 adenohifl a .取2ul病毒原液，行pcr鉴定.2结果2. 1重组穿梭质粒pshut

14、tle2hifl a的鉴定0的基因自pcdna3. 1 (+ ) hif1 a酶切后与经同样双酶切的穿梭质粒pshuttle2连接成功,jiffnhe i及apal单、双酶切鉴定，apa i单酶切片段大小约6500bp,双酶 切两个片段大小分别为4ooobp, 2500bp左右(figi),酶切鉴定正确;以iiif1 a的一对引物行pcr鉴定，扩增出一约460bp的dna (fig2),与预期值一致，测序后与genbank的hif1 a cdna序列比对显示564 位脯氨酸密码子ccc突变为丙氨酸密码子gcc (下划线处).2.2重组腺病毒载体padenohtfl a鉴定提取重组腺病毒质粒pa

15、denoiiifl a 以 xho i 酶切(fig3),酶切片段有 14500, 8046, 4300 和2465bp,符合预期，鉴定正确，以bdclontech公司所提供的引物 行pcr鉴定,扩增出287bp的dna片段(fig4),与预期值一致.2. 3重组腺病毒载体padenolaz转染293细胞后xgal原位染色结 果padenolaz转染293细胞后xgal原位染色，显示近20%左右的转染 细胞染成蓝色(fig5)2.4重组腺病毒adenohifl a的鉴定及滴度测定重组腺病毒 adenohifl a以bdclontech公司所提供的引物行pcr鉴定，结果同 fig4,成功扩增出2

16、87bp的目的条带，说明重组病毒成功测病毒原液 滴度为3x1010pf u/l,扩增后的病毒滴度为2x1012pf u/l3讨论腺病毒具感染谱广，高病毒滴度及感染效率，不引起插入突变等 优点，是常用的基因转移载体之一我们采用的腺病毒载体是e1/e3 区同时去除的复制缺陷型，缺失e1区的腺病毒不具复制能力采用体 外连接的重组方法，首先将目的基因连接到穿梭载体pshuttle2的h cmv启动子和s v40多聚腺昔酸尾之间，通过酶切获得含冃的基因 的表达盒片断，直接与线性化的病毒骨架质粒连接，然后在能反式提 供e1基因产物的293细胞中包装出具有复制能力的重组腺病毒此种 构建方法比常用的细菌内同源

17、重组法，具有高效、快速的优点大量扩 增重组病毒后行氯化锥梯度超速离心得到高纯度和滴度的重组腺病毒，可用于体内试验.促血管新生因子研究较多的有vegf, fgf等，已有ii期临床实验 证实携带vegf, fgf等基因的腺病毒载体可促进治疗性血管新生而改 善缺血性心脏病患者的临床症状1-3然而vegf治疗可导致新生血 管不成熟、组织水肿、血管渗漏，甚至可能促进动脉硬化进展、血管 瘤形成及侧支循环的减少，fgf则与蛋白尿有关4,5 近年发现， hif1 a可诱导生理功能完整的血管新生，其通过与靶基因hre结合调 控下游超过50种基因的转录，包括vegf及其受体等多种促血管生长、 发育的基因.口前在冠

18、心病等涉及治疗性血管新生的疾病研究中,htf1 q被认为是最具有临床治疗前景的基因之一 6,7 临床前期研究表 明其可促进缺血侧支血管的灌注、促进血管新生，在模拟的缺血再灌 注损伤中对培养的心肌细胞具保护作用&9然而常氧状态下hif1 a容易降解，其odd区的pro564在脯氨酰轻化酶作用下轻基化成轻脯 氨酸残基，介导odd区与e3泛素连接酶复合休组分vonhippellindaujiff肿瘤抑制蛋口 (pviil)相结合，进而启动iiif1 a经泛素蛋口酶体途径降 解；低氧状态下脯氨酰轻化酶活性受到抑制，pro564轻基化反应受阻 导致hif1 a降解途径中断，细胞内hif1 a水平

19、增加10, 11 通过对pro564的定点突变，使得pvhl不能与hif1 a odd区稳定结合，常氧khtf1 a可得到稳定表达我们在业已完成定点突变pro564为am564 基础上，成功构建人突变型iiif1 a重组腺病毒载体，解决了常氧下hifla基因表达困难的问题，为其体内外研究开辟了新途径，为进一步研究其对冠心病的血管新&作用及以后的临床应用奠定了基础.【参考文献】 1 hedmanm, hartikainenj, syvannem, eta1. safetyandfeasibilityofcat heterbasedlocalintracoronaryvascularend

20、othelialgrowthfactorg enetransferinthepreventionofpostangioplastyandinstentresteno sisandinthetreatmentofchronicmyocardialischemia:phasellresul tsofthekuopi oangi ogenesi strial(kat)j circulation, 2003;107(21):2677-2683. 2 ledermanrj, mendelsohnfo, andersonrd, eta1. therapeuticangiogene si swi threc

21、ombinantfibroblastgrowthf8ctor2forintenni ttentclau dication(thetrafficstudy):arandomisedtrialj .lancet, 2002;359(9323):2053-205&3grinescl, watkinsmw, helmerg, eta1. angiogenicgenetherapy(agent)trialinpatientswithstablea. nginapectorisjcirculation, 2002;105(11):1291-12974leerj, springerml. vegfg

22、enedeliverytomyocardium:deleteriouseff ectsofunregulatedexpressionj circulation, 2000;102(8):898-901.5famnp, vermas, kutrykm, eta1. clinicianguidetoangiogenesisj circulation, 2003;108(21):2613-2618 6 tarzamist, singhjp pharmacologicalrevasculari sationincoronary andperipheralvasculardiseasej expertopinlnvestigdrugs, 2004;13(10):1319-13267giacciaa, siimbg, johnsonrs. hiflasatargetfordrugdevelopment jnatrevdrugdisc